СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ КРОВИ МЕТОДОМ НСТ-ТЕСТА Российский патент 2013 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к клинической иммунологии, в частности к исследованию метаболической активности фагоцитов крови.

Генерация фагоцитами крови активных форм кислорода в ходе респираторного взрыва является одним из звеньев фагоцитоза, необходимого для обеспечения неспецифического иммунитета (Виксман М.Е., Маянский А.Н, 1979, Герасимов И.Г., 2006, Третьякова И.Е. и др., 2003). Одним из инструментов изучения респираторного взрыва in vitro является реакция восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Известен способ исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови (Park B.N., Fikrig S.M., Smithwich E.M. Infection and nitrobluetetrazolium reduction by neutrophils; a diagnostic aid // Lancet, 1968, vol.11, 2, P.532-534), заключающийся в предварительно получении чистой лейкоцитарной взвеси в градиенте плотности фиколл-верографин, выделенной из 5 мл венозной крови, затем с помощью микроскопа определяют количество клеток, содержащих в цитоплазме гранулы формазана после инкубации их с нитросиним тетразолием (НСТ).

Недостатком описываемого способа являются невозможность использования способа для скрининга функциональной активности фагоцитов, т.к. используется чистая лейкоцитарная взвесь, выделенная из крови в градиенте плотности фиколл-верографин, что требует дорогостоящих реактивов и больших объемов крови (3-5 мл).

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению является Способ исследования метаболической активности нейтрофилов периферической крови методом НСТ - теста (Виксман М.Е., Маянский А.Н. Характеристика опсоничнеских факторов по реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980, Т.89, №2, С.214-215), взятый нами за прототип, заключающийся в заборе 0,1 мл крови из пальца, к ней добавляют 0,9 мл среды 199, затем добавляют 0,1 мл 0,1% нитросинего тетразолия(НСТ-тест спонтанный) и 0,1 мл суспензии латекса с размером частиц 1,5 мкм (НСТ - тест индуцированный), инкубируют 40 минут при 37С.

Недостатком прототипа является: субъективизм и трудоемкость подсчета формазан-позитивных клеток, определение в препарате только метаболической активности нейтрофилов.

У прототипа и заявляемого изобретения имеются следующие существенные признаки: для исследования используется кровь, осуществляют определение с помощью микроскопа количества фагоцитов крови, содержащих гранулы формазана, что свидетельствует о их метаболической активности.

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 минут заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты, затем взвесь клеток центрифугируют, фиксатор отсасывают, а ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло,, полученный мазок высушивают, после чего его окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 минут, затем мазок микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10, результаты исследований оценивают наличию формазан-позитивных клеток, что свидетельствует о метаболической активности фагоцитов.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа исследования метаболической активности фагоцитов крови методом НСТ-теста.

Решение этой задачи позволяет повысить точность исследования метаболической активности фагоцитов периферической крови, получит возможность провести массовое обследование и снизить трудоемкость и финансовые затраты на обследование.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение Способ исследования метаболической активности фагоцитов крови методом НСТ-теста, включающий забор 0,1 мл крови из пальца, к ней добавляют 0,9 мл среды 199, затем добавляют 0,1 мл 0,1% нитросинего тетразолия (НСТ-тест спонтанный) и 0,1 мл суспензии латекса с размером частиц 1,5 мкм (НСТ - тест индуцированный), инкубируют 40 минут при 37С, отличающийся тем, что дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 минут заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты, затем взвесь клеток центрифугируют, фиксатор отсасывают, а ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло, полученный мазок высушивают, после чего его окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 минут, затем мазок микро-скопируют под иммерсией при увеличении 90×10, результаты исследований оценивают наличию формазан-позитивных клеток, что способствует повышению точности исследования, снижению трудоемкости подсчета фагоцитов в отличие от прототипа

Совокупность указанных общих существенных признаков дополняют, развивают и уточняют следующими частными отличительными признаками, которые направлены на решение этой задачи получение чистой лейкоцитарной взвеси, содержащей моноциты и нейтрофилы позволяет снижает трудоемкость процесса в подсчете формазан-позитивных клеток. Применение дополнительного центрифугирования и другого фиксатора способствует лизису эритроцитов и получению достаточного количества фагоцитов, необходимых для подсчета..

По отношению к прототипу у заявляемого изобретения имеются следующие отличительные признаки: дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 минут заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты, затем взвесь клеток центрифугируют, фиксатор отсасывают, а ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло, полученный мазок высушивают, после чего окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 минут, затем мазок микроскопируют под иммерсией с увеличением 90×10 для определения наличия формазан-позитивных клеток.

Между отличительными признаками и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: Способ является комплексным, более чувствительным и дешевым, доступным для проведения массового обследования в любой лаборатории. Используется фиксатор вызывающий лизис эритроцитов, фиксацию лейкоцитов получение их в чистой взвеси. Дополнительное центрифугирование способствует получению достаточной концентрации фагоцитов. В одном препарате можно определить как метаболическую активность моноцитов так и нейтрофилов.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения не известна из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов сущность заявляемого изобретения не следует для специалиста явным образом из известного уровня техники, так как из него не выявляется выше указанные влияния на получаемый технический результат - новое свойство объекта - совокупности признаков, которые отличают от прототипа заявляемое изобретение, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «изобретательский уровень»

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе могут быть многократно использованы в медицине, с получением технического результата, заключающегося в определении метаболической активности фагоцитов периферической крови, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применяемость»

Данный способ осуществляется следующим образом: К 0,1 мл крови из пальца, к ней добавляют 0,9 мл среды 199, затем добавляют 0,1 мл 0,1% нитросинего тетразолия (НСТ - тест спонтанный) и 0,1 мл суспензии латекса с размером частиц 1,5 мкм (НСТ - тест индуцированный), инкубируют 40 минут при 37С, отличающийся тем, что дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин., надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 минут заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты, затем взвесь клеток центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин., фиксатор отсасывают, а ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло, полученный мазок высушивают, после чего его окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 минут, затем мазок микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10, результаты исследований оценивают по наличию формазан-позитивных клеток, что свидетельствует о метаболической активности фагоцитов. Использование фиксатора и дополнительного центрифугирования позволило увеличить точность, снижение трудоемкости исследования в 2-5 раз.

Для определения эффективности предлагаемого способа исследовали % формазан-позитивных клеток, вычисляли цитохимический показатель и индекс стимуляции НСТ-теста у доноров традиционным и заявляемым способом. С целью вычисления цитохимического показателя активности (ЦПА) провели визуальную оценку количества гранул диформазана в фагоцитах с использования принципа Kaplow L.S. по формуле

$$\frac{(0\times a)+(1\times b)+(2\times c)+(3\times d)+(4\times e)}{100}$$

где а, b, с, d, е - количество соответственно 0, 1, 2, 3, 4-й степени Результаты показывают, что предлагаемый способ более чувствительный и точный (табл.1), кроме того позволяет определить цитохимический показатель и индекс стимуляции НСТ-теста моноцитов. (табл.2)

Таблица 1 Показатели НСТ-теста нейтрофилов у здоровых лиц СПОНТАННЫЙ НСТ-ТЕСТ Показатели Прототип Заявляемый способ %ПК 29,4±1,7 26,3±0,81 ЦПА 0,87±0,08 0,74±0,02 СТИМУЛИРОВАННЫЙ НСТ-ТЕСТ Показатели Прототип Заявляемый способ %ПК 34,7±1,4 37,1±0,73 ЦПА 1,35±0,13 1,46±0,06 ИС НСТ 1,64±0,19 0,61±0,11

Таблица 2 Показатели НСТ-теста моноцитов у здоровых лиц СПОНТАННЫЙ НСТ-ТЕСТ Показатели Прототип Заявляемый способ %ПК - 15,6±0,53 ЦПА - 0,52±0,072 СТИМУЛИРОВАННЫЙ НСТ-ТЕСТ Показатели Прототип Заявляемый способ %ПК - 23,4±0,62 ЦПА - 1,12±0,07 ИС НСТ - 0,43±0,08

Пример 1. Донор С., 28 лет. Дата забора крови 12.03.12 г. Было проведено исследование метаболической активности фагоцитов крови заявляемым спобом. Исследования НСТ-теста проводили по следующей методике: К 0,1 мл крови из пальца добавляют 0,9 мл среды 199, затем добавляют 0,1 мл 0,1% нитросинего тетразолия (НСТ-тест спонтанный) или добавлением 0,1 мл суспензии латекса с размером частиц 1,5 мкм (НСТ - тест индуцированный), инкубируют 40 минут при 37С, дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин., надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 минут заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты, затем взвесь клеток центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин., фиксатор отсасывают, а ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло, полученный мазок высушивают, после чего его окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 минут, затем мазок микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10. В качестве тест-системы использовали 10% полистирольную суспензию частиц латекса диаметром 1,5 мкм производства фирмы ДИАэМ, Россия, кроме того использовали нитросиний тетразолий (НСТ) производства Германии. Оценка НСТ-теста проводится по следующим показателям: %ПК - процент формазан-позитивных нейтрофилов и моноцитов, вычисляется индекс стимуляции НСТ-теста (ИС НСТ) - отношение %ПК в стимулированном НСТ-тесте к %ПК в спонтанном тесте, вычисляют цитохимический показатель. Показатели НСТ-теста представлены в табл.3.

Таблица 3 Показатели НСТ-теста фагоцитов крови Показатели спонтанного НСТ-теста фагоцитов крови донора С., 28 лет Показатели Нейтрофилы Моноциты %ПК 29,2 13,6 ЦПА 1,3 1,1 Показатели стимулированного латексом НСТ-теста фагоцитов крови донора С., 28 лет Показатели Нейтрофилы Моноциты %ПК 34,1 16,8 ЦПА 1,7 1,6 ИС НСТ 1,2 1,2

В одном микропрепарате определяют показатели НСТ - теста как моноцитов так и нейтрофилов. Менее трудоемким является процесс подсчета фагоцитов крови.

Заявляемое изобретение СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ КРОВИ МЕТОДОМ НСТ-ТЕСТА является более чувствительным способом и значительно повышает точность определения метаболической активности фагоцитов. Это значит, что предлагаемый способ обследования является наиболее эффективным по сравнению с применяемым в современной практической медицине.

Изобретение относится медицине, а именно к клинической иммунологии, и может быть использовано для исследования метаболической активности фагоцитов. Для этого проводят забор 0,1 мл крови из пальца, к ней добавляют 0,9 мл среды 199, затем добавляют 0,1 мл 0,1% нитросинего тетразолия и 0,1 мл суспензии латекса с размером частиц 1,5 мкм, инкубируют 40 минут при 37С. Дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 минут заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты. Затем взвесь клеток центрифугируют, фиксатор отсасывают. Ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло, полученный мазок высушивают, после чего его окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 минут. Затем мазок микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10, результаты исследований оценивают путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя и индекса стимуляции НСТ-теста. Использование данного способа позволяет получить достаточную концентрацию фагоцитов, необходимых для подсчета, что способствует повышению точности исследования. 3 табл., 1 пр.

Способ исследования метаболической активности фагоцитов крови методом НСТ-теста, включающий забор 0,1 мл крови из пальца, к ней добавляют 0,9 мл среды 199, затем добавляют 0,1 мл 0,1% нитросинего тетразолия и 0,1 мл суспензии латекса с размером частиц 1,5 мкм, инкубируют 40 мин при 37°С, отличающийся тем, что дополнительно для получения лейкоконцентрата полученную смесь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, осадок на 10 мин заливают 2 мл фиксатора, состоящего из 3 частей этанола и 1 части ледяной уксусной кислоты, затем взвесь клеток центрифугируют, фиксатор отсасывают, а ресуспендированные в капле фиксатора клетки переносят на предметное стекло, полученный мазок высушивают, после чего его окрашивают раствором красителя нейтрального красного 20 мин, затем мазок микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10, результаты исследований оценивают путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя и индекса стимуляции НСТ-теста.