Способ определения активности рецепторов нейтрофилов человека Советский патент 1991 года по МПК G01N33/543 

СО

с

Изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано для оценки функциональной активности Fc-рецепторов и СЗв рецепторов нейтрофилов человека. Целью изобретения является упрощение и ускорение определения. Способ включает подготовку частиц-носителей, связанных с IgG, либо СЗв-фактором комплемента, стимуляцию этими частицами нейтрофилов, находящихся в составе разведенной крови, в соотношении 1:50-1-: 150 и оценку функциональной активности Fc-рецепторов и СЗв- рецепторов нейтрофилов по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции. Способ позволяет в несколько раз уменьшить объем исследуемой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза время определения.

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в качестве дополнительного теста при оценке эффекторных свойств нейтрофилов.

Целью изобретения является упрощение и ускорение определения.

В качестве носителя IgG используют убитые бактериальные клетки Staphylococcus aureus, штамм 141, либо пептидогликан Staphylococcus aureus, штамм 885.

Суточную культуру Staphylococcus aureus, штамм 141, выращенную на мясо - пептонном агаре, трижды отмывают стерильным физиологическим раствором, прогревают 30 мин при +80°С, доводят концентрацию до 20 млрд. бакт. клеток/мл и хранят при +4°С (срок хранения до 12 мес.).

Пептидогликан получают из клеточных стенокStaphyloccucus aureus, штамм885 по методу Peterson et at.( Peterson P.P., Wilkinson B.I., Kim Y. et al. The Key cole of peptidoglycan in the opsonisatlort of S. aureus. - I.CIIn.Twest. - 1978. - № 61. - p. 597-609). Суточную культуру бактерий, выращенную на мясопептинном агаре, трижды отмывают дистиллированной водой, взвешивают в физиологическом растворе в концентрации 200 млрд бакт. клеток/мл и разрушают в гомогенизаторе Л-17 К 33 МИ стеклянными бусами диаметром 0,7 мм (20 мин при 0°С, 1000 оборотов/мин).После трехкратного отмывания дистиллированной водой и удаления неразрушенных клеток (дифференциальное центрифугирование при 4000 g в течение 10 мин) клеточные

О 00

с

со

VJ

го

стенки ресуспендируют в 100 мл 2%-ного раствора додецилсульфата натрия (Serva, США) и инкубируют 18ч при комнатной температуре. Осадок четырехкратно отмывают при 8000 g в течение 15 мин, взвешивают в 100 мл 0,05 М трмс-НОбуфера (рН 7,4). содержащего 0,005 М MgCIa, добавляют 20 мкг/мл РНК-азы (Reanal, ВНР), 20 мкг/мп ДНК-азы { Реахим, СССР), инкубируют 60 мин при +37°С, затем вносят 200 мкг/мл трипсина (Spopha, ЧСФР) и продолжают инкубацию еще 4 ч при 37°С. Клеточные стенки отмывают трижды при 8000 д по 15 мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют равный объем 80%-ного раствора фенола и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После трехкратного отмывания (8000 д, 15 мин) осадок ресуспендируют в 5 мл дистиллированной воды, вносят 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и инкубируют 90 мин при +60°С. Затем пептидогликан отмывают дистиллированной водой до рН 6,0 м взвешивают в растворе Хенкса до концентрации 100 мгк/мл,

Фракцию IgG выделяют из коммерческого иммуноглобулина путем хроматографии на ДЭАЭ-тояполе(Тоуо Soda, Япония) при помощи элюции 0,01 М фосфатным буфером, рН 6,5. Опсонизацию объектов-но- ситвлей (конечная концентрация стафилококка-5 млрд. бактерий/мл, пепти- догликана - 10 мгк/мл) иммуноглобулинами G (конечная концентрация IgG 10 мг/мл) проводят при + 37°С и течение 30 мин, трижды отмывают физиологическим раствором и взвешивают а растворе Хенкса: стафилококки до концентрации 1 млрд/мл, пептидогликан - 10 мкг/мл. Препараты хранят при +40С {срок хранения 3 мес).

В качестве объекта-носителя СЗв-фрак- ции комплемента используют зимозан (Реахим, г. Олайне). Зимозан, связанный с СЗа-фактором комплемента, получают по методике Stossel et al. (Stossel T,P., Field R.i., Gitlin I.D. et al. The opsonic fragment of the thlre component of human complement (C3). - I. Exp. Med. - 1975, v, 141. p. 1329- 1347).

Зимозан взвешивают в физиологическом растворе рН 7,2-7,4 в концентрации 10 мг/мл, прогревают при 100°С в течение 15 мин. После трехкратного отмывания физиологическим раствором (центрифугирование и;ч/ ЮООд в течение 15 мин) зимозан опсо- низируют пулом сывороток 40 доноров при +37°С з течение 30 мин, трижды отмывают физиологическим раствором (центрифуги- рсяанм© при ЮООд п течение 15 мин), взве- шиаают s 2 М растворе NaCI и инкубируют

при +100°С в течение 10 мин; после трехкратного отмывания препарат доводят раствором Хеикса до концентрации 10 мг/мл. Хранят при +4°С. В качестве контроля используют зимозэн, обрабатанный пулом сывороток по указанной методике в присутствии 0,01 М этилендиаминтетраацета- тз, т.е. в условиях, исключающих активацию комплемента и связывание СЗв-фактора с зи0 мозаном.

Периферическую кровь забирают путем укола иглой-скарификатором в мякоть дис- тальной фаланги III пальца левой руки в стерильных условиях. Микропипеткой,

5 обработанной гепарином, забирают 0.12 мл крови и разводят ее в 12 мл раствора Хенкса, содержащего 0,1 % желатины. Таким образом получают разведение крови 1:100, Для полного исключения влияния опсо0 нических факторов плазмы при оценке функциональной активности Fc - рецепторов нейтрофилов форменные элементы отделяют от плазмы и ресуспендируют в растворе Хенкса. Для этого полученную вышеуказан5 ным способом кровь разводят раствором Хенкса в соотношении 1:50-1:150 центрифугируют 4 мин при 400д, удаляют надоса- дочную жидкость и разводят 100-кратным объемом раствора Хенкса, содержащего

0 0,1 % желатины. Все манипуляции с кровью производят в дважды силиконированной стеклянной посуде.

Интенсивность люминолзависимой хе- милюминесценции регистрируют на жидко5 стно-сцинтилляционной счетчика Бета-1 (ПО Медаппаратура, Киев) в течение 30 мин при +37°С. К 1 мл разведенной крови либо форменных элементов, взвешенных в растворе Хенкса, добавляют 0,1 мл

0 раствора люминола (Реахим, Ереван), инкубируют 15 мин при +37°С для стабилизации спонтанной хемилюминесценции. Стимуляцию проводят объектами, связанными с IgG либо с СЗв-фактором компле5 мента. Использование в качестве носителя IgG микробных клеток золотистого стафилококка, штамм 141, значительно упрощает получение объекта-носителя. Однако, стафилококки, как и любые другие микроорганизмы, относительно неоднородны даже

0 внутри штамма и подвержены изменчивости. В качестве более стандартного носителя IgG можно использовать пептидогликан золотистого стафилококка, штамм 885. Пептидогликан данного штамма имеет хорошо

5 изученную химическую и антигенную структуру и является более стандартным объектом для использования в реакциях с нейтрофилами, но процесс получения пеп- тидогликана более трудоемок и длителен.

К реакционной взвеси (1 мл разведенной крови с 0,1 мл раствора люмино ла или 1 мл форменных элементов, взвешенных в растворе Хенкса, с 0,1 мл раствора люминола) добавляют по 0,1 мл взвэси объектов, связанных с IgG или СЗв-фактором (концентрация lgG-опсонизи- рованного стафилококка и пептидогликана - соответственно500 млн. бакт.клеток/мл и 10 мкг/мл, зимозана - 10 мг/мл). В качестве контроля используют объекты, не обработан- ные IgG либо СЗв-фактором комплемента (в соответствующих дозировках). Каждую пробу исследуют в трех повторениях. Хемилюми- несценцию измеряют при красном свете. При оценке функциональной активности Fc-pe- цепторов хемилюминесценцию измеряют через 30 мин после внесения стимулятора, при оценке СЗв-рецепторов - через 10 мин после внесения стимулятора. Результаты учитывают по разнице между максимальны- ми показателями хемилюминесценции, индуцированной объектами, связанными с IgG или СЗв, и уровнем хемилюминесценции при стимуляции объектами, необработанными IgG и СЗв, на тех же сроках.

Необходимо оценить функциональную активность Fc-рецепторов и СЗв-рецепторов нейтрофилов периферической крови.

Пример 1. (Выписка из протокола № 102 от 30 марта 1987 года, донор крови - Чекуров А.А., 19 лет). Порядок исследования: в качестве носителя IgG использовали бактериальные клетки золотистого стафилококка, штамм 141. Для этого взвесь убитых прогреванием бактериальных клеток (кон- центрация - 5 млрд/мл) опсонизировали при 37°С раствором иммуноглобулина G (конечная концентрация -10 мг/мл)(30 мин) трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспендировали в растворе Хенкса в концентрации 500 млн. микробных тел/мл. Суспензию зимозана опсонизировали пулом сывороток крови человека при +37°С в течение 30 мин, трижды отмывали физиологическим раствором и ресуспенди- ровали в растворе Хенкса в концентрации 10 мг/мл. 0,12 мл гепаринизированной крови, полученной уколом из пальца, разводили раствором Хенкса, содержащим 0,1% желатины, в соотношении 1:100. В стандар- тные стинциляционные флаконы вносили по 1 мл разведенной крови и 0.1 мл раствора люминола, инкубировали 15 мин при +37°С. Для оценки Fc-рецепторов к реакционной смеси добавляли 0,1 мл взвеси IgG-on- сонизированного золотистого стафилококка (концентрация 500 млн. бактер.клеток/мл) и измеряли хемилюминесценцию через 30 мин. Для оценки СЗв-рецепторов нейтрофилов к

реакционной смеси добавляли 0,1 мл взвеси СЗв-опсонизированного зимозана (концентрация 210 мг/мл) и измеряли хемилюминесценцию через 10 мин. В качестве контроля использовали необработанные стафилококки и зимозан в соответствующих дозировках. Каждую пробу делали в трех повторениях.

Результаты: при стимуляции IgG-onco- низированными бактериями (стафилококками) хемилюминесценция составила в среднем (по результатам трех проб) 434865 имп/мин, при стимуляции неопсонизиро- ванным стафилококком - 244 415 имп/мин. При стимуляции СЗв-опсонизированным зимозаном хемилюминесценция составила 1.200 610 имп/мин, при стимуляции неопсо- низированным зимозаном - 265 435 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв- рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как стимуляция через эти рецепторы вызывает значительное усиление хемилюминесценции.

Пример 2. (Выписка из протокола № 104 от 11 апреля 1987 года, донор - Коныш- кина Т.М.). Порядок исследования - тот же.

Результаты: при стимуляции IgG-onco- низированными стафилококками хемилюминесценция составила 475 562 имп/мин. при стимуляции неопсонизированными стафилококками-221 540 имп/мин При стимуляции СЗв-опсонизированным зимозаном хемилюминесценция составила 1 544 655 имп/мин, неопсонизированным зимозаном - 187 767 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как стимуляция через эти рецепторы вызывает значительное усиление хемилюминесценции.

Пример 3. (Выписка из протокола № 118 от 21 10.87 года, донор - больной Сергеев А.А.). Порядок исследования - тот же. Результаты: при стимуляции lgG-опсонизи- рованными стафилококками чемилюминес- ценция составляла 273 506 имп/мин, при стимуляции неопсонизированными стафилококками - 272 387 имп/мин. При стимуляции СЗв-опсонизированным зимозаном уровень хемилюминесценции составлял 227 981 имп/мин, при стимуляции неопсонизированным зимозаном - 224 749 имп/мин. Заключение: Fc-рецепторы и СЗв-рецепторы нейтрофилов исследуемой крови являются функционально неактивными, так как не наблюдается значительной разницы между показателями хемилюминесценции, инициированной lgG-опсонизированными и неопсонизированными объектами.

Необходимо оценить функциональную активность Fc-рецепторов нейтрофилов.

Пример 4. (ЕЗыпискэ из протоколе № 106 от 14.04.87 года, донор-Чеботарь И.В,). Порядок исследования: в качестве носителя IgG использовали пептидогликан золотистого стафилококка, шгамм 885. Пептидогликан (конечная концентрация 10 мгк/мл) опсонизировали раствором иммуноглобулина G (конечная концентрация 10 мг/мл) при +37 С в течение 30 мин, трижды отмывали физиологическим раствором и ресус- пендировали в растворе Хенкса в концентрации 10 г/мл. Порядок подготовки крови для измерения хемилюминесценции тот же (см. пример 1). К реакционной смеси добавляли по 0,1 мл взвеси lgG-обработан- ного пептидогликана (концентрация 10 мкг/мл) и измеряли хемилюминесценцию через 30 мин. В качестве контроля использовали пептидогликан, не обработанный IgG. Результаты: при стимуляции lgG-обра- ботанным пептидогликаном хемилюминес- ценция составляла 1 2(3 331 имп/мин, при стимуляции необработанным пептидогликаном - 234 220 имп/мин. Заключение: Fc- рецепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как наблюдается значительная разница между показателями хемилюминесценции при стимуляции lgG-опсонизированным и неопсонизиро- ванным пептидогликаном.

Пример 5. (Выписка из протокола № 116 от 19 июня 1987 года, донор крови - Невмятуллин А.Л., 30 лот). Порядок исследования: 0,12 мл гепарииизированной крови, полученной уколом из пальца, разводили раствором Хенкса в соотношении 1:50, при помощи центрифугиррвания отделяли форменные элементы крови от плазмы и ресус- пендировали форменные элементы в 100-кратном объеме (от исходного обьема крови) раствора Хенкса, содержащего 0,1 % желатины. Порядок подготовки полученных форменных элементов доя измерения хемилюминесценции аналогичен описанному выше (см. пример 1). В качестве объекта-носителя IgG использовали убитые прогреванием бактериальные клетки золотистого

стафилококка (штамм 141). Порядок стимуляции и измерения хемилюминесценции описан в примере 1. Результаты: при стимуляции lgG-обработанными стафилококками хемилюминесценция составила 2 368 555

имп/мин, необработанными стафилококками - 407 730 имп/мин. Заключение: Fc-pe- цепторы нейтрофилов исследуемой крови функционально активны, так как наблюдается значительная разница между показателями хемилюминесценции, индуцированной lgG-обработанными и необработанными стафилококками.

Таким образом, изобретение позволяет в несколько раз уменьшить объем исследуемой крови, исключить сложные предварительные процедуры обработки крови, сократить в 2-2,5 раза время определения. Формула изобретения Способ определения активности рецепторов нейтрофилов человека, включающий забор периферической крови, обработку нейтрофилов специфическими для их Fc и СЗв-рецепторов стимуляторами, связанными с частицами-носителями, инкубацию суспензии клеток с последующим измерением люминолзависимой хемилюминесценции по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения определения используют цельную периферическую кровь при разведении физиологической средой в соотношении 1:50-1:150.

Штамм S. aureus № 141 со слабыми адгезивными свойствами в отношении нейтрофилов человека депонирован в научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗ СССР в ян- варе 1983 г., штамму присвоен № 120.