СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДНК, ИЗОЛИРОВАННОЙ ИЗ АРХИВНЫХ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ТКАНЕЙ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к молекулярной онкологии, молекулярной медицинской генетике, молекулярной диагностике.

Известны следующие способы выделения ДНК из архивных патоморфологических образцов тканей.

1. Экстракция ДНК из парафиновых блоков тканей с использованием фенола, хлороформа и изоамилового спирта. (J.Isola, S.DeVries, L.Chu, S.Ghazvini, F. Waldman. Analysis of changes in DNA sequence copy number by comparative genomic hybridization in archival paraffin - embedded tumour samples. Amer. J. Pathol., 1994 December, v.145, 6).

Срезы парафиновых блоков тканей подвергаются инкубации с фенол-хлороформ-изоамиловым спиртом в объеме 500 мкл при температуре 20^oC в течение 10 мин. Затем производят центрифугирование, и поверхностно расположенную ДНК преципитируют в присутствии 250 мкл ацетата аммония в концентрации 7,5 М и 1 мл охлажденного 100% этанола. Затем к образцам добавляют гликоген в концентрации 0,1 мг/мл, производят центрифугирование и инкубируют в 20-40 мкл ТЕ буфера в течение 10-12 ч.

2. 1-ступенчатая экстракция ДНК из парафиновых блоков тканей путем кипячения в ионообменном веществе Chelex - 100 (D.Shibata. Extraction of DNA from paraffin-embedded tissue for analysis by polymerase chain reaction: new tricks from an old friend. Hum. pathology, 1994 June, v.25, 6; E.Hodges, J. Smith. Isolation of nucleic acid from paraffin-embedded tissue for PCR amplification and sequencing of TcR Vbeta genes. Leukemia Research, 1995, v.19, 3, pp.183-186). Срезы парафиновых блоков тканей толщиной 5 мкм ресуспензируются в 5% растворе Chelex - 100 и подвергаются кипячению в течение 20 мин.

3. 1-ступенчатая экстракция ДНК из парафиновых блоков тканей путем кипячения в дистиллированной воде (E.Hodges, J.Smith. Isolation of nucleic acid from paraffin-embedded tissue for PCR amplification and sequencing of TcR Vbeta genes. Leukemia Research, 1995, v.19, 3, pp.183-186).

Срезы парафиновых блоков тканей толщиной 5 мкм подвергаются кипячению в дистиллированной воде в течение 20 мин с предшествующей депарафинизацией их путем инкубации с ксилолом при температуре 60^oC в течение 20 мин (повторяется дважды) и последующей регидратации в 100% этаноле; или же без вышеописанной депарафинизации.

4. 1-ступенчатое выделение ДНК, основанное на применении "мягких" детергентов (R. Sepp, I.Szabo, H.Uda, H.Sakamoto. Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR. J.Clin.Pathol., 1994, v.47, pp.318-323).

А. Срезы парафиновых блоков тканей толщиной 5 мкм подвергаются кипячению в дистиллированной воде в течение 20 мин с предшествующей депарафинизацией их путем инкубации с ксилолом при температуре 60^oC в течение 20 мин (повторяется дважды) и последующей регидратации в 100% этаноле. Затем образцы ресуспензируют в буфере, содержащем 50 мМ КСl, 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ Трис - НСl, 0,5% ТВИН 20, 200 мкг/мл протеиназы К, рН 9, и инкубируют при температуре 55^oC в течение 3-х часов. Затем производят инактивацию протеиназы К путем инкубации образца при температуре 100^oC в течение 8 мин.

Б. Срезы парафиновых блоков тканей толщиной 5 мкм подвергаются кипячению в дистиллированной воде в течение 20 мин с предшествующей депарафинизацией их путем инкубации с ксилолом при температуре 60^oC в течение 20 мин (повторяется дважды) и последующей регидратации в 100% этаноле. Затем образцы ресуспензируют в буфере, содержащем 200 мкг/мл протеиназы К в 50 ммоль Трис - НСl, рН 8,5, 1 ммоль ЭДТА, 0,5% ТВИН 20 и инкубируют при температуре 37^oC в течение 10-12 часов. Затем производят инактивацию протеиназы К путем инкубации образца при температуре 95^oC в течение 8 мин.

5. Экстракция ДНК из парафиновых блоков тканей в условиях длительной инкубации их с протеиназой К в повышенной концентрации (D.P.Jackson, F.A.Lewis, G. R. Taylor, A.W.Boylston, P.Quirke. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. J.Clin. Pathol., 1990, v.43, pp. 499-504). Срезы парафиновых блоков тканей подвергаются депарафинизации путем инкубации их с ксилолом и последующей регидратации с применением этанола. Затем образцы ресуспензируются в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис - НСl, 0,5% SDS, 25 мМ ЭДТА и протеиназу К в концентрации 0,1 мг/мл, рН 8,4, и инкубируют при температуре 37^oC в течение 5 суток. Затем производится экстракция нуклеиновых кислот с применением фенола, хлороформа и изоамилового спирта. Производится добавление к образцам вышеперечисленных ингредиентов в соотношении 25:24:1; полученный раствор перемешивается и центрифугируется. Затем отделяют поверхностно расположенную ДНК, и данный этап повторяют. Затем к образцам добавляют хлороформ и изоамиловый спирт в соотношении 24:1. После этого производят преципитацию ДНК в охлажденном этаноле и осаждают ее с помощью центрифугирования. На заключительном этапе полученный осадок растворяют с помощью инкубации в Трис - ЭДТА буфере в течение 3-5 дней.

Известные к настоящему времени способы выделения ДНК из архивных патоморфологических срезов позволяют выделить лишь частично деградированную ДНК, что накладывает ограничения на последующий ее анализ.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения ДНК посредством лизирования в "мягком" детергенте (J.Pavelic, К.Gall-Troselj, М.Herak Bosnar, M. M.Kardum, К.Pavelic. PCR amplification of DNA from archival specimens. A methodological approach. Neoplasma, 1996, v.43, 2). Срезы парафиновых блоков тканей толщиной 5 мкм подвергаются депарафинизации в 1 мл ксилола при температуре 20^oC в течение 1 ч (повторяется дважды) и последующей отмывке его от ксилола 96% этанолом в объеме 500 мкл в течение 30 мин. Затем образцы центрифугируют, осадок высушивают, ресуспензируют и инкубируют его в 0,1 мл буфера, содержащего 50 мМ КСl, 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ Трис - НСl, 0,5% ТВИН 20, 200 мкг/мл протеиназы К, рН 9, и инкубируют при температуре 55 ^oC в течение 3-х часов. После всего вышеперечисленного к полученному лизату добавляют Chelex - 100 до конечной концентрации 5% и производят инактивацию протеиназы К путем инкубации образца при температуре 100^oC в течение 8 мин.

Однако способ выделения ДНК посредством лизирования в "мягком" детергенте имеет существенный недостаток, т.к. позволяет выделить лишь частично деградированную ДНК, что накладывает ограничения на последующий ее анализ.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является увеличение эффективности и расширение возможностей молекулярно-диагностических методов, основанных на использовании архивного банка тканей.

Указанная задача достигается путем применения нового способа восстановления частично деградированной ДНК, полученной из архивных патоморфологических парафиновых срезов тканей.

Изобретательский уровень предлагаемого изобретения подтверждается тем, что способ восстановления ДНК при изоляции ее из архивных патоморфологических парафиновых срезов тканей включает в себя следующие не используемые ранее этапы: 1) частичный протеолиз препаратов посредством добавления малых доз протеиназы К; 2)увеличение времени лизиса препаратов в "мягком" детергенте; 3) репарация ДНК при помощи фермента Taq ДНК-полимеразы.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Парафиновый срез ткани подвергается депарафинизации путем инкубации его с 1 мл ксилола при температуре 20^oC в течение 1 ч (повторяется дважды) и последующей отмывке его от ксилола 96% этанолом в объеме 500 мкл при температуре 55^oC в течение 30 мин.

Впервые применяемым этапом является осуществление частичного протеолиза образца посредством его инкубации в 400 мкл 1-кратного ТЕ буфера в присутствии малых доз протеиназы К (до концентрации 20 мкг/мл) при температуре 20^oC в течение 20 мин. Затем этот раствор удаляется.

Затем производится отмывка образцов тканей от протеиназы К посредством добавления/удаления 400 мкл 1-кратного ТЕ буфера. Данная процедура повторяется 4 раза.

Следующим этапом данной методики является ранее не используемый, длительный - 12-часовой - лизис клеток путем инкубации образцов в растворе суммарным объемом 77 мкл. содержащем 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ Трис, 50 мМ КСl, 200 мкМ dNTPs, 2% Тритон-Х100 при температуре 55^oC. В результате осуществляется лизис клеток и создаются оптимальные условия для процессов репарации ДНК.

Следующим впервые применяемым этапом является репарация ДНК при помощи фермента Taq ДНК-полимеразы. К образцу добавляют Taq ДНК-полимеразу "Perkin Elmer" до концентрации 0,1 ед./мкл, с последующей инкубацией при температуре 72^oC в течение 1 ч. Затем продукт реакции инкубируют при температуре 100^oC в течение 5 мин с целью инактивации вышеупомянутого фермента.

Далее производится приготовление ДНК-лизата путем добавления к образцам протеиназы К до обычной концентрации (200 мкг/мл) и последующей инкубации их при температуре 55^oC в течение 10-12 ч. После всего вышеперечисленного к полученному лизату добавляют Chelex - 100 до конечной концентрации 5%. Процесс завершается инактивацией протеиназы К, которая производится путем инкубации образца при температуре 100^oC в течение 8 мин.

Предлагаемое изобретение включает в себя оригинальный способ восстановления ДНК, изолированной из архивных патоморфологических парафиновых образцов тканей, что резко увеличивает эффективность и расширяет возможности молекулярно-диагностических методов, основанных на использовании архивного банка тканей.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для молекулярной диагностики. Патоморфологические образцы тканей депарафинизируют, затем осуществляют частичный протеолиз образцов в присутствии протеиназы К в концентрации 20 мкг/мл при температуре 20^oС в течение 20 мин. Лизис клеток проводят в течение 12 ч в растворе, содержащем 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ Трис, 50 мМ КСl, 200 мкМ dNTPs, 2% Тритон-Х100 при температуре 55^oC. Последующую репарацию ДНК осуществляют в присутствии фермента Taq ДНК-полимеразы в концентрации 0,1 ед/мкл при температуре 72^oC в течение 1 ч. Изобретение позволяет увеличить эффективность и расширить возможности молекулярно-диагностических методов, основанных на использовании архивного банка тканей.

Способ восстановления ДНК, изолированной из архивных патоморфологических образцов тканей, включающий депарафинизацию образцов, лизис клеток в "мягком" детергенте, протеолиз и приготовление лизата, отличающийся тем, что после этапа депарафинизации дополнительно осуществляют частичный протеолиз образцов в присутствии малых доз протеиназы К в концентрации 20 мкг/мл при температуре 20°С в течение 20 мин и после отмывки образцов от фермента в 1-кратном ТЕ буфере производят 12-часовой лизис клеток в растворе, содержащем 1,5 мМ МgСl₂, 10 мМ Трис, 50 мМ КСl, 200 мкМ dNТPs, 2% Тритон-Х100 при температуре 55°С, после чего осуществляют репарацию ДНК при помощи фермента Таq ДНК-полимеразы в концентрации 0,1 ед./мкл, которую инкубируют с образцами при температуре 72°С в течение 1 ч, с последующей инактивацией вышеупомянутого фермента посредством кипячения в течение 5 мин.