СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ, ГИПОТЕНЗИВНЫМ И ДИУРЕТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2014 года по МПК A61K36/80 B01D11/02 A61P9/02 A61P13/00 

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и касается создания средства растительного происхождения на основе биологически активных веществ коровяка черного (Verbascum nigrum L.) сем. Scrophulariaceae, обладающего одновременно антикоагулянтной, гипотензивной и диуретической активностями.

Поиск и разработка новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы, обусловлены широким распространением, сложностью патогенеза данных болезней. Наиболее распространенными болезнями из этой нозологической группы являются различные виды гипертонии, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, тромбоэмболия и другие. Очень часто эти заболевания имеют взаимозависимый характер и сопровождаются повышенным артериальным давлением, отечностью, образованием сосудистых тромбов. В комплексной терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы используют гипотензивные, антикоагулянтные и диуретические средства, которые назначают одновременно. В настоящее время доказана эффективность применения лекарственных препаратов из растительного сырья для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, при этом фитопрепараты не оказывают побочного действия и безвредны при длительном применении.

Известен ряд растительных средств оказывающих избирательное антикоагулянтное действие. Так, антикоагулянтная активность обнаружена у извлечений из растений одуванчика лекарственного [Патент RU 2085205 С1], пиона древовидного [Патент RU 93033687А], медуницы мягчайшей [Чирятьев Е.А., Русакова О.А. Виды флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого действия. Раст. ресурсы 1994. Т 30. №4, С.21-28], извлечений из продуктов микробной деструкции растительных веществ сапропеля [Патент RU 2101023 С1]. Гипотензивной активностью обладают извлечения из травы очанки лекарственной [Патент RU 2220735 С1], марьянника лугового [Патент RU 2222339 С2], сбора из пяти видов лекарственных растений (сушеницы топяной, плодов боярышника, шлемника байкальского, горца птичьего, плодов шиповника) [Патент RU 2182487 С2]. Диуретическая активность обнаружена у извлечений из подземных органов сабельника болотного [Патент RU 2318531 С1], травы ортосифона тычиночного [Патент RU 1737797 С1] и земляники лесной [Патент RU 2342945 C1], а так же у извлечений из сборов лекарственных растений, содержащих листья брусники, толокнянки, траву горца птичьего и другие виды [Патент RU 2008142861 А; Патент RU 2237488 С1].

Наиболее близким по направленности и комплексности действия, а также по способу получения является средство, представляющее собой очищенное извлечение из корней патринии средней, обладающее седативным, гипотензивным, антикоагулянтным, антиагрегационным и гиполипедемическим действием [Патент RU 2189241 С1], взятое нами за прототип.

Основные недостатки прототипа заключаются в том, что:

1. Растительный источник средства - патриния средняя {Patrinia in-tercetia Roem et Sehult) сем. Valerianaceae, имеет ограниченный ареал распространения и не образует плотных зарослей, что лимитирует сырьевую базу производства.

2. Источником получения препарата являются подземные органы патринии средней. Процесс заготовки корней трудоемкий, а приведение сырья в стандартное состояние энергетически и экономически затратное (отмывка корней от земли, сушка, измельчение).

3. Измельченное растительное сырье экстрагируют спиртом высокой концентрации (80%), что приводит к удорожанию препарата.

4. Технология получения средства многостадийна, имеется дополнительная стадия очистки извлечения от балластных веществ.

5. В процессе получения средства используются высокотоксичные органические растворители - хлороформ и бутанол.

6. Средство не обладает диуретическим действием.

Задачей настоящего изобретения является повышение биологической ценности, улучшение лечебных свойств и расширение спектра фармакологической активности за счет проявления диуретической активности. Предложен препарат, одновременно сочетающий в себе антикоагулянтные, гипотензивные и диуретические свойства, позволяющие применять его для профилактики и лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца и т.д.).

Для достижения указанной цели высушенную надземную часть (траву) Коровяка черного (Verbascum nigrum L. сем. Scrophulariaceae) измельчают до размера частиц не более 2 мм, экстрагируют 60% этиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1:6, методом реперколяции в батарее из трех перколяторов с неравной загрузкой сырья (20:30:50), время настаивания в каждом перколяторе по 8 часов. Полученное извлечение отстаивают при температуре не выше +10°С, в течение 2-х суток, отфильтровывают, сгущают, высушивают под вакуумом и получают сухой экстракт. Выход готового продукта составляет 38% от массы растительного сырья.

Конечный продукт имеет следующие качественные и количественные характеристики:

Анализ на содержание флавоноидов:

Сухой экстракт (0,1 г) растворяют в 10 мл 60% этилового спирта

1. К 3 мл раствора прибавляют 1 мл 2% раствора алюминия хлорида, появляется желтое окрашивание.

2. К 3 мл раствора прибавляют 10 мг кристаллического магния и 5 капель концентрированной хлороводородной кислоты, нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, появляется оранжево-красное окрашивание.

3. 0,01 мл раствора наносят на лист хроматографической бумаги марки Filtrak FN-1 размером 40×40 см и хроматографируют восходящим методом, сначала в системе растворителей бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2) в течение 17 часов, а после высушивания лист бумаги поворачивают на 90° и хроматографируют в 15% уксусной кислоте в течение 8 часов. Хроматограмму высушивают и просматривают в УФ свете до и после обработки парами аммиака. При этом на хроматограмме появляются 6 пятен. Значение R_f данных пятен должно соответствовать данным таблицы №1.

Количественное определение флавоноидов:

Аналитическую пробу сухого экстракта около 0,2 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в смеси диоксан - вода (1:1) и доводят до метки (раствор А), 10 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 1% раствора алюминия хлорида, доводят до метки смесью диоксан - вода (1:1) и перемешивают (раствор Б). Спустя 10 минут измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре «Спектр-2000» при длине волны 383 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 10 мл раствора А, доведенного смесью диоксан - вода (1:1) до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл. Содержание суммы флавоноидов в сухом экстракте в пересчете на гесперидин вычисляют по формуле:

,

где D - оптическая плотность исследуемого раствора; m-масса экстракта, г; V - объем раствора А, взятый для разбавления, мл; 50 - объем раствора Б; 100 - объем раствора A; W - влажность экстракта, %; 120 - удельный показатель поглощения комплекса 100% субстанции гесперидина с реактивом при длине волны 383 нм.

Анализ содержания иридоидов:

Сухой экстракт (0,1 г) растворяют в 10 мл 60% этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Шталя (1 г п-диэтиламинобензальдегида, 5 г фосфорной кислоты и 50 г уксусной кислоты, разбавляют водой до 100 мл), доводят до кипения на водяной бане, появляется сине-голубое окрашивание.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 капель реактива Трим-Хилла (смесь, состоящая из 5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, 10 мл 0,2% раствора сульфата меди и 100 мл ледяной уксусной кислоты), нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин., появляется синее окрашивание.

Количественное определение иридоидов:

Проводят по реакции с реактивом Трим-Хилла по методу Грегора и Симхена. Навеска вещества для количественного определения составляет 0,2 г.

Способ получения средства иллюстрируется следующим примером:

0,1 кг травы коровяка черного (только надземная часть) измельчают до размера частиц <0,25≤2,0. Измельченное сырье загружают в три перколятора, причем в первый перколятор помещают 20 г, во второй 30 г и в третий 50 г.Сырье в первом перколяторе заливают до «зеркала» и настаивают 8 часов. Полученные извлечения сливают и используют для экстрагирования сырья во втором перколяторе и далее каждую последнюю порцию сырья экстрагируют извлечением, полученным из предыдущего перколятора. Объем слива (мл) из каждого перколятора равен массе загруженного сырья (г). Время настаивания в каждом перколяторе 8 часов, общий расход экстрагента - 600 мл, что соответствует соотношению сырье - экстрагент 1:6. Извлечения, полученные из последнего перколятора, объединяют, отстаивают при температуре +10°С в течение двух суток, фильтруют, упаривают и высушивают в вакууме. Получают 0,038 кг готового продукта, что составляет 38% сухого экстракта от массы исходного сырья.

Сухой экстракт представляет собой гигроскопическую массу темно-коричневого цвета с характерным специфическим запахом. Содержание флавоноидов в экстракте составляет 8,2±0,4%, иридоидов 0,83±0,04%, влажность 6,5±0,5%.

Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной системы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Способ получения может быть внедрен на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.

Оценку антикоагулянтной активности проводили in vitro с помощью коагулометра «Minilab-701» в концентрации 1 мг/мл. Для исследования использовали кровь собаки, стабилизированную 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Безтромбоцитную и тромбоцитную плазму получали по стандартной методике [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000].

В качестве индуктора свертывания крови использовали 0,28% раствор хлорида кальция. Эталоном антикоагулянтной активности служил гепарин, который испытывали в концентрации 1 ЕД/мл в аналогичных условиях. Эффекты всех фармакологических испытаний считали достоверными при Р≤0,05 [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963]. Полученные данные приведены в таблице 2.

Как следует из данных таблицы 2, экстракт коровяка черного оказывает антикоагулянтное действие. Он достоверно замедляет время свертывания крови на 17-18%». Биологически активные вещества экстракта не влияют на эритроцитарный компонент тромбообразования. Опыты с плазмой обогащенной тромбоцитами и безтромбоцитарной плазмой свидетельствуют о том, что экстракт коровяка черного не вызывает блокаду функции тромбоцитов, а оказывает влияние на плазменные факторы свертывания крови, сходное с действием гепарина.

Испытание на гипотензивную активность проводили in vivo на кошках [Березина М.П., Василевская Н.Е., Авербах М.С. и др. Большой практикум по физиологии человека и животных./под общей редакцией Васильева Л.Л. и Ветюкова И.А. - М.: Высшая школа, 1961. с.675], в качестве эталона сравнения использовали раствор папаверина гидрохлорида в дозе 3 мг/кг (0,1 ЛД₅₀). Он вызывает достоверное снижение артериального давления на 34,4% продолжительностью 5 минут. Результаты в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, сухой экстракт коровяка черного вызывает достоверное снижение артериального давления на 12% в течение 10 минут.

Диуретическую активность определяли на 30 белых беспородных крысах самцах массой 250-300 г. Сухие экстракты вводили перорально в дозе 50 мг/кг, предварительно растворяли в 5 мл воды. Сбор мочи производили через 3 и 6 часов после введения препаратов. Контрольной группе животных вводили по 5 мл воды. Препараты сравнения (сухие водные экстракты хвоща полевого и листьев брусники обыкновенной) испытывали в аналогичных условиях. Результаты представлены в таблице 4. Из представленных данных видно, что экстракты коровяка черного обладают диуретической активностью. Следует отметить, что экстракты проявляют максимальную активность в течение первых трех часов после введения препарата. Мочегонный эффект экстракта коровяка черного, полученного на 60% этаноле, за первые три часа в два раза, а за 6 часов в три раза активнее экстракта, полученного на 40% этаноле. Диуретический эффект заявленного средства за 6 часов достоверен и сопоставим с активностью экстракта из листьев брусники и в два раза выше, чем у традиционного мочегонного средства - травы хвоща полевого.

ЛИТЕРАТУРА

Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963.

Березина М.П., Василевская Н.Е., Авербах М.С. и др. Большой практикум по физиологии человека и животных. / под общей редакцией Васильева Л.Л. и Ветюкова И.А. - М.: Высшая школа, 1961, с.675.

Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000.

Способ получения биологически активных веществ, обладающих антиагрегационным и гипотензивным действием Патент №2222339 от 27.01.2004.

Способ получения комплекса, обладающего фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной активностью Патент RU №93033687 А от 20.11.1995.

Способ получения средства, обладающего антикоагулянтной активностью Патент RU №2101023 С1 от 10.01.1998.

Способ получения средства, обладающего гипотензивной активностью Патент №2182487 С2 от 20.05.2002.

Способ получения средства, обладающего диуретической и противовоспалительной активностью Патент №2318531 С1 от 10.03.2008.

Способ получения средства, обладающего диуретической и противовоспалительной активностью Патент №2342945 С1 от 10.01.2009.

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной и гипотензивной активностью Патент №2220735 от 10.01.2004.

Способ получения суммы экстрактивных веществ, обладающей диуретической активностью Патент №1737797 С от 30.11.1994.

Средство, обладающее антикоагулянтным действием Патент RU №2085205 С1 от 27.07.1997.

Средство, обладающее диуретической и гипоазотемической активностью (варианты), и способ его получения Патент №2008142861 А от 10.05.2010.

Средство «Патримин», обладающее седативным, гипотензивным, антикоагулянтным, антиагрегационным и гиполипидемическим действием Патент №2189241 С1 от 26.06.2001.

Средство «Чай байкальский - 6», обладающее диуретической активностью и способ его получения Патент №2237488 С1 от 10.10.2004.

Чирятьев Е.А., Русакова О.А. Виды флоры Сибири как источники антикоагулянтов прямого действия. Раст. ресурсы. 1994. Т 30, №4, с.21-28.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения средства, обладающего антикоагулянтным, гипотензивным и диуретическим действием. Способ получения средства, обладающего антикоагулянтным, гипотензивным и диуретическим действием, состоящий в том, что экстракцию измельченной травы коровяка черного проводят 60% этиловым спиртом, методом реперколяции в батарее из 3 перколяторов с неравной загрузкой сырья, полученное извлечение отстаивают, фильтруют, упаривают и высушивают в вакуум-сушильном аппарате при определенных условиях. Средство, полученное вышеописанным способом, обладает выраженным антикоагулянтным, гипотензивным и диуретическим действием. 4 табл.

Способ получения средства, обладающего антикоагулянтным, гипотензивным и диуретическим действием, состоящий в том, что экстракцию измельченной до не более 2 мм травы коровяка черного проводят 60%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:6, методом реперколяции в батарее из 3 перколяторов с неравной загрузкой сырья в соотношении 20:30:50 и времени настаивания в каждом перколяторе 8 ч, полученное извлечение отстаивают при температуре не выше 10°C, фильтруют, упаривают и высушивают в вакуум-сушильном аппарате.