СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИМИКРОБНЫМ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ И АНЕСТЕЗИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК A61K36/80 A61K31/10 A61P29/00 A61P31/04 

Изобретение относится к области фармации и касается состава и способа получения комбинированного средства, обладающего антимикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием.

В основе многих заболеваний сосудов, мышц, суставов лежит воспалительный процесс, вызванный патогенными микроорганизмами. К таким заболеваниям относятся артриты, артрозы, миозиты и другие.

Для лечения этих заболеваний используется обширный арсенал лекарственных средств, в том числе и комбинированных. Комбинирование субстанций из различных фармакологических групп обосновано и направлено на подавление роста патогенных микроорганизмов, уменьшение воспалительного процесса, купирование болевого синдрома.

Известны комбинированные антимикробные средства, полученные на основе экстрактов из лекарственных растений. В качестве экстрагента биологически активных веществ при получении таких средств используется диметилсульфоксид (ДМСО) или его аналог более высокой степени очистки - димексид. Наиболее близким прототипом по составу и технической сущности получения является антибактериальное средство на основе ДМСО экстрактов из лекарственных растений, взятое нами за прототип [Патент RU №2088246].

Прототип, так же как и заявляемое средство, содержит биологически активные вещества из растений, димексид и дополнительно синтетические низко- и высокомолекулярные полиэтиленоксиды. Антибактериальный эффект прототипа обусловлен наличием в составе противомикробных компонентов - синтетических антибиотиков, сульфаниламидов, производных нитрофурана. В качестве растительных компонентов используются цветки календулы, листья подорожника, трава зверобоя, тысячелистника и череды. Не исключается применение и других видов сырья.

Сырье экстрагируют в реакторе, оборудованном паровой рубашкой, в два приема 100% димексидом, нагретым до температуры 90-100°С, в течение 2-4 часов. Антибактериальные компоненты и полиэтиленоксиды растворяют в горячем экстракте. Полиэтиленоксиды, входящие в прототип, имеют различную молекулярную массу и в зависимости от их соотношения получают лекарственные формы различной консистенции - линименты, мази, суппозитории.

Прототип имеет следующие недостатки.

1. Процесс получения препарата многостадиен и требует использования специального оборудования - экстрактора или диффузора, оборудованного паровой рубашкой и механической мешалкой.

2. Технология получения препарата предусматривает длительное (около 5 часов) нагревание (при температуре 100°С) биологически активных веществ, содержащихся в растительном сырье, что приводит к их термическому разложению. Особенно неустойчивы такие вещества, как терпеноиды, каротиноиды, гликозиды, витамины, содержащие лабильные группы - альдегидные, ацильные, лактонные, енольные, спиртовые и другие.

3. На стадии получения экстракта неизбежны потери димексида, так как он является высококипящим веществом (t_кип.+189°С) и трудно отделимым от шрота. Рекуперация димексида острым паром невозможна, в связи с его физико-химическими свойствами.

4. Димексид является более дорогостоящим экстрагентом растительного сырья по сравнению с традиционно применяемым - спиртом этиловым и его смесями с водой.

5. Полиэтиленоксиды, входящие в препарат, вступают в межмолекулярные взаимодействия с биологически активными веществами растений и активными центрами антибактериальных компонентов, образуют сольватные оболочки на их поверхности, что затрудняет их биологическую доступность и снижает фармакологическую активность.

6. Термическое воздействие на антибактериальные компоненты (особенно антибиотики и сульфаниламиды) приводит к частичной потере основного эффекта.

7. Прототип может использоваться только как антибактериальное средство. Он не обладает местноанестезирующим и противовоспалительным действием.

8. Отсутствие параметров стандартизации и возможности контроля качества антибактериального средства.

Целью изобретения является состав и способ получения средства с антимикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием для лечения воспалительных заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами.

Цель достигается тем, что в качестве антимикробного и противовоспалительного компонента в препарате используется сухой экстракт вероники дубравной Veronica chamaedrys L. (сем. Scrophulariaceae). Экстракт вероники дубравной содержит большой набор биологически активных веществ (флавоноиды, иридоиды, фенолокислоты и др.) и обладает сильным антимикробным, противовоспалительным и Р-витаминным действием, что делает его целесообразным компонентом комплексного препарата [Гусев Н.Ф. Вероники Кунгурско-Красноуфимской лесостепи Предуралья и перспективы их использования: Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Пермь, 1976; Растительные ресурсы СССР Семейства Caprifoliaceae - Plantaginaceae. - Л.: Наука, 1990].

Обезболивающий эффект в препарате обуславливается анилокаином - анестетиком отечественного производства, сочетающим в себе высокую анестезирующую активность с умеренным противовоспалительным действием [Панцуркин В.В., Алексеева И.В. Анилокаин, поиск, свойства. Начальный опыт применения лекарственных форм в медицинской практике / В.И.Панцуркин, И.В.Алексеева. - Пермь: 2006. - 174 с.].

В качестве растворителя и средообразующего вещества используется смесь димексида и воды очищенной (1:1) в терапевтической концентрации [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993, Т.1, с.222], что позволяет получать препарат, готовый к употреблению. Димексид является универсальным растворителем, растворяющим как липофильные, так и гидрофильные вещества, обладает проводниковой активностью и способствует проведению биологически активных веществ вероники дубравной внутрь органов и тканей.

Сущность изобретения

10 г сухого экстракта из травы вероники дубравной, полученного по способу [Патент RU 2220735], растворяют в 85 г смеси димексида (ФС 42-2980-98) и воды очищенной, в соотношении 1:1 в плоскодонной колбе при температуре 100°С в течение 15 мин, при перемешивании. Раствор охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 г анилокаина (ВФС 42-2846-97) и растворяют в течение 5 мин, при легком перемешивании. Жидкость процеживают через три слоя марли и получают готовый препарат. Изобретение иллюстрируют следующим примером.

Пример. 10 г сухого экстракта из травы вероники дубравной (Veronica chamaedrys L.) растворяют в 85 г смеси димексида и воды очищенной в соотношении 1:1 в плоскодонной колбе при температуре 100°С в течение 15 мин при перемешивании. Раствор охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 г анилокаина и растворяют в течение 5 мин при легком перемешивании. Жидкость процеживают через три слоя марли и получают готовый препарат.

Препарат представляет собой прозрачную жидкость, темно-коричневого цвета, специфического запаха (запах ДМСО), смешивается с водой и спиртом этиловым в любых соотношениях.

Параметры подлинности и качества препарата

Подлинность препарата подтверждается качественными реакциями, хроматографическими пробами и УФ-спектральными характеристиками.

1. Реакции подлинности на содержание биологически активных веществ вероники дубравной и анилокаина:

а) Флавоноиды

К 1 мл препарата добавляют 1 мл воды очищенной, 10 мг кристаллического магния и 5 капель кислоты хлористо-водородной концентрированной, нагревают на кипящей водяной бане 3 мин, появляется красно-коричневое окрашивание (проба Синода);

б) Иридоиды

К 1 мл препарата добавляют 1 мл воды очищенной и 5 капель реактива Шталя (1 г п-диметиламинобензальдегида, 5 г кислоты фосфорной и 50 г кислоты уксусной ледяной, разбавленной водой до 100 мл), доводят до кипения на водяной бане, появляется синее окрашивание;

в) Фенолкарбоновые кислоты

К 1 мл препарата добавляют 1 мл воды очищенной и 5 капель 1% водного раствора квасцов железоаммониевых, нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин, появляется осадок черного цвета;

г) Анилокаин

К 1 мл препарата добавляют 1 мл воды очищенной и 5 капель 10% водного раствора натрия гидроксида, нагревают на кипящей водяной бане 1 мин, выпадает осадок темно-коричневого цвета.

Специфичность проб подлинности подтверждается реакциями на модельной смеси, состоящей из водного раствора димексида (50%) с анилокаином, взятых в одинаковых с препаратом пропорциях (табл.1).

2. Хроматографическая характеристика флавоноидов

На лист хроматографической бумаги марки «Ленинградская - С» размером 30×40 см наносят 0,1 мл препарата и хроматографируют в стеклянной камере восходящим методом в системе растворителей бутанол - кислота уксусная - вода (4:1:2) в течение 17 часов (первое направление). Хроматограмму вынимают из камеры, высушивают, поворачивают на 90° таким образом, чтобы флавоноиды, распределившиеся в первом направлении, были внизу, помещают в 15% раствор кислоты уксусной, где выдерживают в течение 8 часов (второе направление). По истечении времени хроматограмму вынимают из камеры, высушивают и просматривают в УФ-свете до и после обработки парами аммиака, а также обрабатывают хромогенными реактивами - 1% спиртовым раствором алюминия хлоридом и 3% спиртовым раствором цирконила нитратом. Результаты хроматографического анализа представлены в таблице 2.

На основании люминесцентно-хроматографических свойств и реакций с хромогенными реактивами установлено, что в препарате с экстрактом вероники дубравной содержится шесть веществ флавоноидной природы. Значение коэффициентов распределения (R_f) этих веществ служит показателем подлинности препарата.

3. УФ-спектральная характеристика

УФ-спектры препарата в разведении 1:2000 представлены в таблице 3. Как следует из полученных данных, в УФ-спектрах препарата присутствует два максимума - коротковолновый 240 нм и длинноволновый 316 нм. При добавлении хромогенного реактива (AlCl₃) наблюдается гипсохромный сдвиг коротковолнового максимума поглощения (Δλ=17 нм) и батохромный длинноволнового (Δλ=12 нм). Изменения в УФ-спектрах подтверждают наличие флавоноидов в препарате и участие их в реакциях комплексообразования.

Совместное добавление комплексообразующего (AlCl₃) и ионизирующего (CH₃COONa) агентов, за счет сольватационных эффектов, приводит к еще более значительному батохромному сдвигу длинноволнового максимума.

В дифференциальном спектре препарата с алюминия хлоридом и натрия ацетатом присутствует также два максимума. Длинноволновый максимум (388 нм) находится в области спектра, свободной от поглощения простых фенольных соединений (простых фенолов, гидроксикоричных кислот, кумаринов и др.) и может использоваться как для подтверждения подлинности, так и для разработки метода количественного определения флавоноидов в препарате.

4. Количественное определение флавоноидов

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г препарата (точная навеска), доводят до метки водой очищенной (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида и 2 мл 8% спиртового раствора натрия ацетата, доводят объем раствора до метки водой очищенной, через 30 мин измеряют оптическую плотность на спектрофотометре СФ-2000 (или другой марки) при длине волны 388 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 5 мл раствора А, доведенного водой очищенной до метки в мерной колбе объемом 50 мл.

Содержание флавоноидов в % (X) в пересчете на цинарозид вычисляют по формуле:

где D - оптическая плотность исследуемого раствора; - удельный показатель поглощения комплекса цинарозида с реактивами при λ₃₈₈=428; а - точная навеска препарата, г.

Содержание флавоноидов в препарате составляет 0,71±0,06%.

5. Содержание анилокаина

0.5 мл препарата разводят в 10 мл 0,05 М раствора кислоты хлористоводородной в воде, добавляют 5 мл хлороформа и 1-2 капли смешанного индикатора диметилового желтого с метиленовым синим в соотношении 2:1. Титруют 0,01 М раствором натрия лаурилсульфата до появления оранжевой окраски хлороформного слоя.

Содержание анилокаина в % (X) вычисляют по формуле:

где Т - титр 0,01 М раствора натрия лаурилсульфата по анилокаину = 0,003357 г/мл;

V - объем титранта, мл;

К_п - коэффициент поправки титранта, вычисляется согласно ВФС 42-2846-97;

а - навеска препарата, мл.

Содержание анилокаина в препарате составляет 5,0±0,3%.

6. Содержание димексида

Концентрация димексида в препарате определяется по значению плотности. Нами установлена линейная зависимость плотности от концентрации димексида в интервале 20-60% в модельной смеси и препаратах, включающих сухой экстракт с влажностью 5%.

Уравнение линейной регрессии, описывающее эту зависимость, используется для определения концентрации димексида.

Количественное содержание димексида в % (X) в препарате находят по формуле:

где ρ - плотность препарата, г/см³.

Содержание димексида в препарате составляет 50,0±5,0%.

7. Физико-химические параметры

Значения плотности составляет 1,1188±0,0011 г/см³, показателя преломления 1,4305±0,0030 и сухого остатка 12,4±0,5% и устанавливаются по методикам ГФ XI [Государственная фармакопея СССР, вып.1, М., 1987, 336 с].

8. Фармакологическая активность

Для подтверждения фармакологической активности заявленного состава на противовоспалительную и противомикробную активность испытаны препараты сравнения, содержащие экстракты из других растений семейства Норичниковые (Очанки и Зубчатки), а также димексид и смесь димексида с анилокаином. Все компоненты в испытанных образцах взяты в одинаковых с препаратом соотношениях.

а) Противовоспалительная активность

Оценку противовоспалительной активности препарата проводили на беспородных крысах обоего пола массой 180-200 г по общепринятой методике [Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ, 1982];

Асептическое воспаление конечностей вызывали субплантарным введением в правую заднюю лапу крысы 0,1 мл 1% раствора карагенина. Препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мл/кг в 1 мл воды очищенной за один час до моделирования воспаления. Животным контрольной группы в равном объеме вводили воду очищенную. Через 1 и 3 часа после введения карагенина определяли величину отека онкометрическим методом, по разности между объемами воспаленной и невоспаленной лапок животных. Статистическую обработку данных фармакологического эксперимента проводили по критерию Стьюдента. Эффект считали достоверным при р≤0,05 [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд., Л.: Медицинская литература, 1963].

Как следует из полученных данных (табл.4), препарат с экстрактом вероники дубравной, на пике воспаления (3 часа), обладает наивысшей активностью. Он тормозит воспалительный процесс на 63% по сравнению с контролем.

Препараты сравнения в аналогичных условиях менее активны. Сила противовоспалительного действия средства с экстрактом зубчатки обыкновенной ниже заявляемого препарата на 30%, а с экстрактом очанки коротковолосистой на 50%. Противовоспалительный эффект модельной смеси (анилокаин с 50% раствором димексида в воде) составляет 14% и является статистически недостоверным. Раствор димексида в воде (50%) на данной модели воспаления практически не оказывает антиотечного действия;

б) Антимикробная активность

Определение противомикробного действия препаратов проводили по методике, рекомендованной Государственной Фармакопеей 11 издания [Государственная фармакопея СССР: Вып.2 - М.: Медицина, 1989. - 398 с. ил.]. Была исследована активность в отношении штаммов из коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (Москва): Escherichia coli АТСС 25922, Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р. Готовили двукратные разведения образцов препаратов, используя мясопептонный бульон.

Культуры Е. coli, St. aureus выращивали на жидкой питательной среде при температуре 30-35°С в течение 18-20 часов. Готовили разведение культур 1:1000, используя стерильный 0,9% раствор натрия хлорида изотонический. В приготовленные разведения образцов вносили взвесь каждого тест-штамма из расчета 1 мл взвеси на 10 мл разведения. Параллельно готовили контроли среды и испытуемых культур микроорганизмов, без добавления препаратов.

Разведения препаратов с внесенными в них микроорганизмами и контрольные образцы выдерживали в течение 18-20 часов при температуре 30-35°С. Учет результатов проводили по отсутствию визуальных признаков роста микроорганизмов (бактериостатическая активность) и отсутствию роста микроорганизмов на плотной питательной среде (мясопептонный агар) после высева соответствующего разведения препарата (бактерицидная активность). Результаты представлены в таблице 5.

Бактериостатическая активность препарата с экстрактом вероники дубравной в отношении золотистого стафилококка и кишечной палочки в два раза выше по сравнению с препаратом на основе экстракта очанки и в семь раз выше по сравнению с препаратом на основе экстракта зубчатки.

Бактерицидная активность, в отношении St. aureus, препаратов с экстрактами вероники и очанки одинакова и во много раз превышает активность препарата с экстрактом зубчатки. Бактерицидное действие на Е. coli у препарата с экстрактом вероники выше, чем у препаратов сравнения в 4-15 раз.

9. Сравнение с прототипом

Сравнительная характеристика заявленного состава средства и способа его получения с прототипом представлена в таблице 6.

Состав средства, несмотря на общую концепцию создания, существенно отличается от прототипа. Он позволяет реализовать комплексное действие средства (противомикробное, анестезирующее, противовоспалительное). В качестве антибактериального компонента в заявляемом средстве выступает нетоксичный комплекс биологически активных веществ вероники дубравной, а в прототипе синтетические продукты - антибиотики, сульфаниламиды, производные нитрофурана.

Способ получения позволяет:

- получить средство с антимикробной, местноанестезирующей и противовоспалительной активностью, готовое непосредственно к применению;

- исключить длительное нагревание и разрушение природных биологически активных веществ в ходе получения;

- контролировать технологические стадии получения и стандартизовать целевой продукт;

- исключить потери средообразующего вещества - димексида;

- исключить использование специального технологического оборудования.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении эффективности средства за счет включения в состав экстракта вероники дубравной, местного анестетика и димексида.

Вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения, исключающей загрязнение окружающей среды отходами производства, способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья, расширяют ассортимент лекарственных средств для лечения заболеваний мышц и опорно-двигательного аппарата и открывают перспективу внедрения данного препарата в фармацевтическую промышленность.

Литература

1. Антибактериальное средство и способ его получения. Патент RU №2088246 от 20.07.1993.

2. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта, 2-е изд.. Л.: Медицинская литература, 1963.

3. Временная фармакопейная статья «Анилокаин» 42-2846-97.

4. Государственная фармакопея СССР, вып.1, М., 1987, 336 с.

5. Государственная фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11 изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 398 с., ил.

6. Гусев Н.Ф. Вероники Кунгурско-Красноуфимской лесостепи Предуралья и перспективы их использования: Автореф. дисс. канд. биол. наук / Н.Ф.Гусев. - Пермь, 1976.-26 с.

7. Лекарственный препарат и способ лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата, периферической нервной системы и кожных покровов Патент RU №2261720 от 16.04.2004.

8. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ. Одобрено фармакологическим комитетом МЗ СССР, 1982.

9. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1993, T.1, с.222.

10. Панцуркин В.В., Алексеева И.В. Анилокаин, поиск, свойства. Начальный опыт применения лекарственных форм в медицинской практике / В.В.Панцуркин, И.В. Алексеева. - Пермь: ГОУ ВПО «ПГФА Росздрава», 2006. - 174 с.

11. Растительные ресурсы СССР: цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Caprifoliaceae - Plantaginaceae. - Л.: Наука, 1990. - 362 с.

12. Способ получения средства, обладающего противовоспалительной и гипотензивной активностью. Патент RU №2220735 от 10.01.2004.

13. Фармакопейная статья «Димексид» 42-2980-98.

Таблица 2 Люминесцентно-хроматографическая характеристика флавоноидов, содержащихся в препарате № R_f R_f Окраска пятен пятна БУВ (4:1:2) 15%СН₃СООН УФ УФ+NH₃ AlCl₃ ZrO(NO₃)₂ 1 0,14 0,69 фиолетовая темно-фиолетовая желто-коричневая --- 2 0,14 0,54 --- желто-зеленая желто-зеленая бледно-желтая 3 0,16 0,38 темно-фиолетовая темно-фиолетовая желтая сиреневая 4 0,24 0,37 бледно-фиолетовая желто-коричневая желтая темно-желтая 5 0,30 0,37 фиолетовая салатная желтая красно-фиолетовая 6 0,47 0,15 темно-фиолетовая желтая желтая желтая

Таблица 3 УФ-спектральная характеристика препарата * Препарат Препарат+AlCl₃ Препарат+AlCl₃+CH₃COONa ** Димексид (50%) Димексид (50%) Димексид (50%) Препарат λ_макс. λ_макс. λ_макс. λ_макс.   240 223 226 229   316 328 369 388 Примечание: * рабочий раствор; ** раствор сравнения.

Таблица 4 Противовоспалительная активность заявляемого препарата, модельных смесей и препаратов сравнения №п/п Препарат Доза, мг/кг Число животных Торможение отека при внутрибрюшинном введении, % через 1 час через 3 часа 1 С экстрактом вероники 50 6 30* 63* 2 С экстрактом зубчатки 50 6 39* 42* 3 С экстрактом очанки 50 6 10 30* 4 Димексид (50%)+анилокаин 50 6 14 14 5 Димексид (50%) 50 6 0 0 6 Контроль (вода) --- 7 --- --- Примечание: * при р<0,05.

Таблица 5 Противомикробная активность заявляемого препарата, модельных смесей и препаратов сравнения №и/и Препарат Разведение Е. coli St. aureus бактериостатическая бактерицидная бактериостатическая бактерицидная 1 С экстрактом вероники 1:2560 1:1280 1:2560 1:1280 2 С экстрактом зубчатки 1:320 1:160 1:160 1:80 3 С экстрактом очанки 1:1280 1:1280 1:1280 1:320 4 Димексид (50%)+анилокаин -* 1:20 - 1:10 5 Димексид (50%) - 1:10 - 1:10 Примечание: -* -активность не установлена.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему антимикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием. Предлагается средство, обладающее антимикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием, содержащее сухой экстракт травы вероники дубравной, анилокаин и димексид в виде смеси с водой очищенной в соотношении 1:1, при определенном содержании компонентов, а также способ получения средства, включающий растворение сухого экстракта травы вероники дубравной в смеси, содержащей димексид и воду очищенную в соотношении 1:1, при определенных условиях, далее раствор охлаждают до комнатной температуры, добавляют анилокаин при перемешивании и процеживают. Вышеописанное средство обладает эффективным комплексным противомикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием. 2 н.п. ф-лы, 6 табл.

1. Средство, обладающее антимикробным, противовоспалительным и анестезирующим действием, содержащее активное вещество и димексид, отличающееся тем, в качестве активного вещества оно содержит сухой экстракт травы вероники дубравной; дополнительно включает анестетик - анилокаин, а димексид входит в состав в виде смеси с водой очищенной в соотношении 1:1, при следующем содержании компонентов, г:
Сухой экстракт вероники дубравной 10 Анилокаин 5 Смесь димексида и воды очищенной (1:1) 85

2. Способ получения средства по п.1, состоящий в том, что растворяют сухой экстракт травы вероники дубравной в смеси, содержащей димексид и воду очищенную в соотношении 1:1, при температуре 100°С в течение 15 мин при перемешивании, далее раствор охлаждают до комнатной температуры, добавляют анилокаин при перемешивании и процеживают.