СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ Российский патент 2004 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для изучения патогенеза и разработки методов лечения сенсоневральной тугоухости.

Сенсоневральная тугоухость (СНТ) по современным данным остается распространенным явлением и составляет наибольшую долю (60-80%) в структуре тугоухости другой природы. В клинике заболевание проявляется снижением слуха по типу нарушения звуковосприятия и субъективным шумом в ушах. В настоящее время имеющиеся в арсенале оториноларингологов способы лечения СНТ направлены на стабилизацию слуховой функции и, как правило, не удовлетворяют ни врача, ни больного, являясь в основном симптоматическими. Учитывая вышесказанное, уточнение некоторых аспектов патогенеза заболевания для возможности последующего патогенетического воздействия на его звенья является чрезвычайно важным. Большинство исследователей считает, что, несмотря на полиэтиологичность СНТ, какова бы не была причина заболевания, патогенез тугоухости един: нарушение кровообращения, трофики волосковых клеток спирального органа и других нервных элементов слухового пути вплоть до дегенерации. Токсический же фактор, в том числе воздействие ототоксическими антибиотиками, приводит к первичным дистрофическим изменениям нервной ткани из-за метаболических нарушений в ней (Руководство по оториноларингологии / Под ред. И.Б. Солдатова. - М.: Медицина. - 1994. - 608 с.). Известно, что хроническая СНТ может быть прогрессирующей или стабильной, никогда не возвращаясь к нормальному слуху. Без лечения тугоухость чаще прогрессирует, так как дегенеративно-дистрофические нарушения усугубляются и распространяются в область вышележащих структур слухового анализатора, что клинически сопровождается прогрессирующим снижением слуховой функции, иногда вплоть до глухоты.

Г. А. Таварткиладзе (1995) отмечает, что решение фундаментальных проблем современной сурдологии возможно лишь при комплексном подходе, при этом одним из приоритетных направлений в этом вопросе должно быть изучение сенсорных элементов слуховой системы в экспериментах на животных. Полученные данные, по мнению автора, могут быть использованы в последующем для изучения эффектов различных лечебных воздействий с целью восстановления слухового восприятия (Фундаментальные и прикладные исследования научного центра аудиологии и слухопротезирования // Folia Otorhinolaryngologica. - 1995. - Vol.1. - 1. - Р. 40-65). Эти позиции определяют важность экспериментальных исследований по моделированию СНТ на животных.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлены различные способы моделирования сенсоневральной тугоухости.

Ряд авторов проводили моделирование СНТ путем введения ототоксического антибиотика канамицина морским свинкам (В.Ф.Аничин, А.Т.Пакунов. Действие канамицина на ушной лабиринт (Эксперим. исследование) // Вестн. оторинолар. - 1980. - 6. - С.27-31; С.Г.Журавский, А.И.Лопотко, В.В.Томсон. Влияние трудотерапии на морфологию и функцию волосковых клеток спирального органа морских свинок при канамициновом ототоксикозе // Новости оторинолар. - 2000. - 2(22). - С.36-46; Е.В.Ильинская. Электронно-микроскопическое исследование ототоксической модели и ультраструктурных изменений в клетках спирального органа при электростимуляции // Новости оторинолар. и логопатол. - 2001. - 3 (27). - С. 41-48; D.N. Furness, C.M. Hackney. Morphological changes to the stereociliary bundless in the guinea pig cochlea after kanamycin treatment // British. J. Audiology. - 1986. - Vol. 20. - P.253-259).

Недостатками способа являются:
- недостаточная (60-80%) воспроизводимость патологии при моделировании по данной методике;
- отдаленность предлагаемой модели от воспроизводимой патологии из-за анатомического несоответствия строения улитки морской свинки, имеющей большее количество завитков, чем улитка человека (три завитка);
- отдаленность модели от естественных условий возникновения СНТ в связи с использованием для ее моделирования антибиотика (канамицин), достаточно редко применяемого в современной практической медицине.

Имеются данные об использовании для моделирования СНТ у морских свинок неомицина (B. C.Муравейская. Локализация первичного поражения при нарушении слуха у морских свинок вследствие введения неомицина // Антибиот. - 1974. - 6. - С.1104-1107).

Недостатками способа являются:
- невысокая воспроизводимость заболевания при введении морским свинкам неомицина;
- анатомические различия в строении улитки морской свинки и человека;
- использование для моделирования редко применяемого в современной клинической практике антибиотика.

А. И. Крюков (1990) применил для моделирования СНТ на одной группе беспородных крыс гентамицин (15 мг/кг массы, как минимальную ототоксическую дозировку, и 25 мг/кг массы, как максимальную ототоксическую дозировку, не вызывающую нефротоксический эффект), а на другой - акустическую стимуляцию с электрофизиологическим контролем (зарегистрировано удлинение пиковых латентностей коротколатентных слуховых вызванных потенциалов - КСВП), при этом максимальное время наблюдения составило 72 ч (Органная специфика внутреннего уха, особенности патогенеза и лечения лабиринтных расстройств (клинико-экспериментальное исследование): Автореф. дис. . ..докт. мед. наук. - Л., 1990. - 29 с.).

Недостатками способа являются:
- невысокая воспроизводимость патологии с помощью предлагаемой методики;
- несоответствие модели течению заболевания в связи с неустойчивостью вызываемых нарушений.

L. Afzelius, J. Aursness (1979) осуществляли моделирование СНТ путем перевязки передней нижней мозжечковой артерии у экспериментальных животных, при этом дистрофические изменения наружных волосковых клеток были обнаружены лишь у 22 из 41 морской свинки (Structural changes in the organ of Corti of the guinea Pig after obstruction of arterial blad flow to the inner ear // Acta otolaryngol. - 1979. - V.104. - 3 - 4. - Р.202-210).

Недостатком этого способа является небольшая степень воспроизводимости (53,7%) морфологической основы патологии.

Наиболее близким по своей сущности и взятым в качестве прототипа является способ, предложенный Л. Б. Несчетной, В.В. Коротченко, О.Н. Терещенко (Морфологические изменения сенсорного эпителия и нервных элементов улитки морских свинок под действием аминогликозидных антибиотиков // Вестн. оторинолар. - 1984. - 3. - С.16-21). Авторы использовали внутрибрюшинное введение двум группам морских свинок ототоксических антибиотиков: одной - мономицина, а другой - канамицина; после забоя животных в обеих группах были обнаружены дегенеративные изменения в наружных и внутренних волосковых клетках, нервных волокнах и ганглиозных клетках спирального ганглия, которые существенно не зависели от вида применяемого антибиотика.

К недостаткам прототипа относятся:
1) отдаленность модели от воспроизводимой патологии из-за анатомического несоответствия строения улитки морской свинки и человека, связанные с большим количеством завитков у морских свинок;
2) недостаточная воспроизводимость патологии при моделировании данным способом;
3) отдаленность модели от естественных условий возникновения СНТ в связи с использованием для моделирования антибиотиков (мономицин, канамицин), достаточно редко применяемых в современной практической медицине.

Целью настоящего изобретения является создание модели сенсоневральной тугоухости у животных, приближающейся по развитию и течению заболевания к клиническим проявлениям у человека и обладающей высокой воспроизводимостью заболевания у экспериментальных животных.

Цель достигается путем предварительного воздействия на организм иммобилизацией (обездвиживанием) животных (крыс) с последующим введением гентамицина (гентамицина сульфат).

Способ осуществляется следующим образом.

Экспериментальные животные (крысы) первые две недели по 3 ч в сутки подвергаются обездвиживанию путем помещения их в одноместный крысиный "домик", а затем в последующие 2 недели ежедневно после кратковременной иммобилизации в течение 1 ч вводят внутримышечно ототоксический антибиотик - гентамицин - в дозе 20 мг/кг массы.

Данная методика является высокоэффективной и способствует проявлению специфического повреждающего действия ототоксического антибиотика у устойчивых в обычных условиях крыс в связи с истощением их резервных возможностей путем предварительного иммобилизационного стрессирования помещением их в одноместный крысиный "домик". Указанное воздействие двух стрессорных агентов (иммобилизация и введение ототоксического антибиотика) способствует изменению обменных процессов в организме животных в виде нарушения свободнорадикального окисления, истощения антиоксидантной системы, нарушения соотношения биоактивных веществ в сыворотке крови и структурах слухового анализатора, а также к функциональным и морфологическим изменениям в слуховой системе.

Для специфического ототоксического воздействия на слуховой орган был избран гентамицин, наиболее часто применяемый в настоящее время в клинической практике. Дозу вводимого ототоксического антибиотика - гентамицина сульфата - определяли, основываясь на данных С.И.Крюкова (1990) о величине минимальной и максимальной ототоксической дозировки для крыс, не вызывающей нефротоксический эффект соответственно 15 и 25 мг/кг массы (Органная специфика внутреннего уха, особенности патогенеза и лечения лабиринтных расстройств (клинико-экспериментальное исследование): Автореф. дис....канд. мед. наук. - Л. , 1990. - 29 с.). Мы избрали среднюю ототоксическую дозировку - (15+25) мг/кг: 2=20 мг/кг массы, стараясь приблизить условия эксперимента к условиям клиники.

Три серии модельного эксперимента по воспроизведению стойкой сенсоневральной тугоухости (СНТ) проводили на белых крысах линии Вистар.

Крысам 1-й серии модельного эксперимента (основная группа) в количестве 5 крыс (10 ушей) проводили моделирование стойкой СНТ следующим образом. Первоначально в течение двух недель крыс обездвиживали в одноместном крысином "домике", а затем в течение последующих двух недель ежедневно крыс обездвиживали на 1 ч и производили внутримышечное введение ототоксического антибиотика - гентамицина - в количестве 20 мг/кг массы тела.

Крысам 2-й серии модельного эксперимента (5 крыс - 10 ушей) проводили моделирование стойкой СНТ путем внутримышечного введения гентамицина сульфата ежедневно в течение двух недель (без дополнительных воздействий) в той же дозировке, что и в 1-й группе.

Крысы 3-й серии модельного эксперимента представляли контрольную группу, в которую вошли 5 здоровых крыс (10 ушей) с нормальным слухом.

Слуховую функцию животных во всех группах оценивали до и после воздействия с помощью рефлекса Рreyer (реакция животных в виде подергивания ушей при звуковом воздействии) (К.Л.Хилов, В.С.Черкасов. К вопросу о так называемых "невритах слухового нерва // Журн. ушн. нос. и горловых болезней. - 1967. - 2. - С. 10-15; С. Г.Журавский и соавт. Новости оторинолар. и логопатол. - 2001. - 4(28). - С.114-116).

До начала воздействия во всех 3-х группах у крыс отмечался нормальный живой рефлекс Рreyer.

По окончании воздействия у крыс 1-й (основной) группы рефлекс Рreyer был отрицательным, что свидетельствовало об угнетении функции органа слуха у всех 5 животных (10 ушей) - возникновении глухоты или высокой степени тугоухости, подтверждающей воспроизведение патологии в 100% случаев.

У крыс 2-й группы по окончании воздействия рефлекс Рreyer у 2-х крыс (4 уха) был положительным и у 3-х крыс (6 ушей) отрицательным, что свидетельствовало о возникновении глухоты или высокой степени тугоухости лишь у трех животных и подтверждало воспроизведение патологии в 60% случаев.

У крыс 3-й - контрольной - группы рефлекс Рreyer был положительным во всех случаях, что свидетельствовало о нормальном слухе у этих животных.

Для изучения сути происходящего в процессе моделирования были проведены морфологические исследования. Через одни сутки после окончания воздействия и проверки слуха с помощью рефлекса Рreyer крыс декапитировали с последующим морфологическим исследованием височных костей и проведением биохимических исследований сыворотки крови и тканей слухового анализатора. Морфологические исследования височных костей осуществляли с целью оценки состояния слуховых структур в процессе эксперимента. Биохимические исследования были проведены для выявления патогенетических факторов, предрасполагающих к СНТ и сопровождающих ее, изменений биохимических данных в процессе эксперимента. Биохимические исследования включали хемилюминесцентный анализ, характеризующий процессы свободнорадикального окисления (СРО) в сыворотке крови и структурах слухового анализатора.

Показатели хемилюминесценции (ХЛ) регистрировали на установке ХЛМ 1Ц-01 по методу Ю.А.Владимирова и соавт.(1974) и оценивали нарушения в структурах слухового анализатора по состоянию свободнорадикального окисления (СРО) в сыворотке крови животных и гомогенатах тканей таламуса и височной зоны коры. Оценивали спонтанную хемилюминесценцию (S), которая отражает интенсивность эндогенного свободнорадикального перекисного окисления липидов (количество импульсов за 100 сек.

Полученные при исследованиях данные обработаны методами вариационной статистики с использованием Т-критерия Стьюдента для малых выборок.

Результаты морфологических исследований улиток животных были следующие:
У крыс 1-й серии модельного эксперимента, которые были подвергнуты воздействию - обездвиживанию и введению гентамицина сульфата - физиологические данные о глухоте полностью подтверждались морфологическими, свидетельствующими о грубых дистрофических изменениях во всех 10 улитках 5 крыс (100%).

У крыс 2-й серии эксперимента, подвергнутых действию гентамицина, данные, полученные при морфологическом исследовании, соответствовали физиологическим данным о состоянии слуха по рефлексу Рreyer'a:
У 3-х крыс (6 ушей) из 5 исследуемых обнаружены дистрофические нарушения в улитках, при этом изменения в улитке и спиральном ганглии были менее выражены, чем у крыс первой серии эксперимента.

То есть модель воспроизведена в 3-х случаях из 5-ти (60% воспроизведения).

У крыс 3-й серии эксперимента, представляющих контрольную группу, морфологические исследования улиток свидетельствовали о норме во всех 5 случаев (10 улиток).

То есть в результате эксперимента в основной опытной группе в 100% случаев морфологически подтверждена модель хронической СНТ.

Результаты биохимических исследований были следующими.

Контрольные показатели биохимических исследований на основе хемолюминесцентного анализа сыворотки крови и структур слухового анализатора, принятые за нормальные (группа 3), представлены в таблицах 1, 2, 3.

Показатели ХЛ сыворотки крови крыс с экспериментальной тугоухостью в сравнении с контрольными свидетельствуют о начальном оксидантном повреждении структур слухового анализатора в обеих (1-й и 2-й) группах животных, более выраженном в 1-й группе (таблица 1). Выявлено также, что у этих же крыс имеются начальные изменения соотношений между моноаминами в слуховых структурах.

Показатели биохимических исследований методом ХЛ гомогенатов таламуса и слуховой зоны коры в экспериментальных группах свидетельствуют об оксидантном повреждении этих структур слухового анализатора и несколько отличаются от показателей сыворотки крови. При СНТ в эксперименте при воздействии только гентамицином отмечается тенденция к ускорению процессов СРО (2 группа), тогда как при введении гентамицина на фоне иммобилизации (1 группа) определяются признаки угнетения инициальных стадий СРО таламуса, что может способствовать нарушению проведения нервного импульса в этой зоне. При дополнении действия гентамицина иммобилизацией животного (стресс) изменения показателей ХЛ гомогената таламуса становятся более выраженными. Воспроизведение модели тугоухости на фоне предварительной иммобилизации, рассматриваемой как стрессовый фактор для животных, приводит к истощению системы СРО, что указывает на важную роль экстремальных воздействий в повреждении слухового анализатора с последующим развитием заболевания. Действие только гентамицина на слуховую зону коры в эксперименте приводит к нерегулируемой активации СРО наряду с нарушением прооксидантных и антиоксидантных соотношений. Добавление же стрессорного агента (иммобилизации) приводит к угнетению системы СРО.

Таким образом, при моделировании СНТ на животных обнаруживается, так же как и в клинике у больных СНТ, снижение активности свободнорадикального окисления, что подтверждает истощение данной системы и создает условия в организме человека и животных для угнетения адаптивных реакций, что благоприятствует явлениям, приводящим к деструкции нервной ткани при СНТ.

То есть экспериментальное изучение СНТ на крысах трех серий свидетельствует о наибольшей выраженности в 3-й группе крыс патологических изменений в первично поврежденном спиральном органе, подтвержденных физиологическими исследованиями (глухота в 100% случаев) и морфологически (100%), которые сопровождаются нарушением свободнорадикальных процессов в других структурах слухового анализатора - таламусе и слуховой зоне коры. Описанный способ позволяет моделировать СНТ в эксперименте, подтверждает изменения, происходящие при этом заболевании у человека, и может явиться пусковым моментом для определения лечебной тактики.

Заявляемый способ обладает следующими преимуществами:
1) воспроизводимость стойкой СНТ в эксперименте на животных (крысах) в 100% случаев;
2) соответствие предлагаемой модели воспроизводимой патологии у человека;
3) простота воспроизведения модели стойкой СНТ;
4) возможность использования предлагаемой модели СНТ в дальнейшем для испытания эффективности лечебных воздействий.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и касается моделирования сенсоневральной тугоухости. Для этого осуществляют воздействие на организм обездвиживанием с последующим введением гентамицина. Экспериментальное животное - крысу - первые две недели по 3 ч ежедневно обездвиживают в одноместном крысином "домике". В последующие 2 недели ежедневно животное кратковременно в течение 1 ч обездвиживают и вводят внутримышечно ототоксический антибиотик - гентамицин. Одноразовая доза гентамицина составляет 20 мг/кг массы животного. Способ повышает воспроизводимость патологии, позволяет использовать наиболее доступных животных - крыс, имеющих сходное с человеком строение органа слуха, приближает условия опыта к клиническим, учитывая возрастающее влияние стрессовых ситуаций на жизнедеятельность человека. 3 табл.

Способ моделирования сенсоневральной тугоухости путем введения экспериментальному животному ототоксического антибиотика, отличающийся тем, что предварительно экспериментальное животное – крысу обездвиживают в крысином "домике", первоначально по 3 ч ежедневно в течение 2-х недель, а затем по 1 ч ежедневно в последующие 2 недели с одновременным внутримышечным введением гентамицина в дозе 20 мг/кг массы животного.