СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРИ ОСТРОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2017 года по МПК G09B23/28 A61B5/04 G01N33/50 

Изобретение относится к экспериментальной медицине в области оториноларингологии и может быть использовано для оценки протективного действия фармакологического препарата при острой сенсоневральной тугоухости (ОСНТ) в эксперименте.

Острая сенсоневральная тугоухость является полиэтиологическим заболеванием, характеризующимся нарушением звуковосприятия и развивающимся либо одномоментно, либо быстро в течение одних суток, либо медленно в течение трех суток, при этом может быть как односторонним, так и двухсторонним, сопровождаться шумом и заложенностью в ушах, головокружением, нарушением равновесия. На развитие ОСНТ оказывают влияние сосудистые, инфекционные, токсические, физические, психические и другие факторы. На фоне перечисленных факторов патологический процесс развивается преимущественно на уровне периферического отдела слухового анализатора, а именно в улитке, поражая волосковые клетки кортиева органа. В связи с этим возникает необходимость объективной оценки функции периферического отдела слухового анализатора для выявления (оценки) протективного действия фармакологических препаратов при ОСНТ в эксперименте.

Известны работы, относящиеся к оценкам состояния периферического отдела слухового анализатора с помощью электрофизиологических показателей, такие как: Гершуни Г.В. (1. Оценка функционального значения электрических ответов слуховой системы. // М.: Физиол. журн. СССР, №33, 1947. - С. 241-247; 2. Общие результаты деятельности слухового анализатора человека при помощи разных реакций. // М.: Журн. высшей нервной деятельности, Т. 7, 1957. - С. 13); Винникова Я.А, Титова Л.К. (Кортиев орган. Гистофизиология и гистохимия. // М.: Медицина, 1961).; Ундрица В.Ф., Темкина Я.С., Неймана Л.В. (Руководство по клинической аудиологии. - М.: Медгиз, 1962. - 324 с.); Devis Н. (Transmission and transduction in the cochlea. Laryngoscope. // St. Louis. 1958. - Vol. LXVIII, №3. - p. 359-382); Аничина В.Ф., Ароновой М.З. (Электронномикроскопические исследования ацетилхолинэстеразы в нервных окончаниях клеток спирального органа в норме до и после звукового воздействия. // М.: Журн. УНГБ, №1, 1972. - С. 1-8.); Забоевой Н.В. (Зависимость суммарных электрических ответов периферического отдела слухового анализатора от крутизны фронта звукового сигнала. // М.: Физиол. журн. СССР, №4. 1976. - С. 346-354); Е.В. Ильинской (Электронно-микроскопическое исследование ототоксической модели и ультраструктурных изменений в клетках спирального органа при электростимуляции. // Новости оторинолар. и логопатол. - 2001. 3(27). - С. 41-48).

Указанные выше работы имеют большое теоретическое значение, но рассматривают и оценивают только отдельные электрофизиологические показатели функции улитки, которые в полной мере не могут охарактеризовать состояние слухового анализатора.

Методы моделирования ОСНТ, предложенные Несчетной Л.Б., Коротченко В.В., Терещенко О.Н. (Морфологические изменения сенсорного эпителия и нервных элементов улитки морских свинок под действием аминогликозидных антибиотиков // Вестн. оторинолар. - 1984. - 3. - С. 16-21); Журавским С.Г, Лопотко А.И., Томсоном В.В. (Влияние трудотерапии на морфологию и функцию волосковых клеток спирального органа морских свинок при канамициновом ототоксикозе // Новости оторинолар. - 2000. - 2(22). - С. 36-46); Furness D.N., Hackney С.М. (Morphological changes to the stereociliary bundless in the guinea pig cochlea after kanamycin treatment // British. J, Audiology. - 1986. - Vol. 20. - P. 253-259), а также Золотовой Т.В., Панченко C.H (Способ моделирования сенсоневральной тугоухости / RU 2222054), G09B 23/28 - в медицине.) и др. близки по своей сущности, но рассматривают только морфологические и биохимические изменения, происходящие в структурах слухового анализатора крыс и морских свинок и не могут в полной мере удовлетворить потребности в объективной оценке всех необходимых функций периферического отдела слухового анализатора.

Техническим результатом изобретения является объективная оценка функции периферического отдела слухового анализатора в условиях патологических моделей ОСНТ различного генеза, последующий ее анализ и возможность восстановления путем выявления соответствующего фармакологического препарата в эксперименте на кошках.

Указанный технический результат достигается в способе оценки протективного действия фармакологического препарата при ОСНТ в эксперименте, заключающемся в том, что согласно изобретению в условиях моделей ОСНТ различного генеза определяют амплитудные и временные характеристики суммарного электрического ответа улитки слухового анализатора кошки с мембраны круглого окна на короткий звуковой сигнал «щелчок» длительностью 3,1-0,2 мс при интенсивности щелчка 30 дБ над порогом обнаружения ответа, а также содержание глюкозы и лактата в лабиринтной жидкости улитки до и после введения исследуемого фармакологического препарата, и, если после введения препарата значения всех определяемых показателей приближаются к значениям таковых у кошек в нормальном физиологическом состоянии, то протективное действие фармакологического препарата оценивают как положительное.

Исследование слухового анализатора кошки при моделировании ОСНТ наилучшим образом отражает клинические проявления этого заболевания у человека.

Исследование слухового анализатора кошки при моделировании ОСНТ наилучшим образом отражает клинические проявления этого заболевания у человека.

Экспериментальные исследования по изучению уровня метаболических процессов и биоэлектрической активности улитки проводились на половозрелых кошках обоего пола весом 2,5-3 кг, в 4-х серия экспериментов по 20-25 опытов в каждом на патологических моделях ОСНТ различного генеза и в норме:

1. Нормальные физиологические условия (НФУ);

2. Острая гипоксическая гипоксия (ОГГ);

3. Острый стрептомициновый ототоксикоз (ОСО);

4. Острая акустическая травма (ОAT).

Функцию периферического отдела слухового анализатора кошки во всех четырех сериях опытов оценивали по суммарному электрическому ответу (СЭО) ее улитки, который регистрировался в ответ на короткий звуковой сигнал "щелчок" длительностью 3,1-0,2 мс с мембраны круглого окна.

СЭО составляется из начального микрофонного потенциала (МП) и акционного потенциала (АП), представленного нервными компонентами N₁, и N₂ (фиг. 1). МП характеризует функцию рецепторных, а АП - нервных структур улитки. МП отражает промежуточные метаболические процессы, связывающие механические явления с возникновением импульсов в слуховом нерве, а АП позволяет судить о некоторых характеристиках начальной части афферентного потока информации от улитки в первый центральный отдел слуховой системы кохлеарного ядра.

Для создания модели ОГГ после обнажения слуховой буллы кошке накладывали трахеостому. Через трахеостому в трахее герметично фиксировали интубационную трубку. Внутривенно капельно вводили листенон 25 мг/кг веса со скоростью 4-6 капель в минуту. Подсоединив интубационную трубку к объемно-частотному респиратору ВИТА-1, переводили животное на управляемое дыхание.

Жизненный объем легких определяли спирометром, входящим в комплект респиратора. Частота дыхания была 28-30 в одну минуту. Респиратор обеспечивал полуоткрытую систему дыхания, что исключало гиперкапнию.

Для получения ОГГ респиратор соединяли с дыхательным мешком Дугласа, заполненным калиброванной газовой смесью, содержащей 7% кислорода и 93% азота, что соответствует подъему на высоту 6500 метров и атмосферному давлению 246,8 мм рт.ст. (парциальному давлению кислорода 51,5 мм рт.ст.).

Проводили серии опытов, отличающиеся временем дыхания гипоксической смесью.

Это время было названо периодом гипоксии. После каждого периода гипоксии животному давали дышать атмосферным воздухом. Время вдыхания атмосферного воздуха назвали периодом восстановления. Последовательно повторяли период гипоксии и восстановления от 1 до 5-12 раз в каждом опыте.

Для создания модели ОСО после обнажения слуховой буллы ее заполняли раствором стрептомицина сульфата (0,5 мл/50 тысяч ЕД в 1 мл) при температуре 34-36°. Раствор отсасывали через 15 минут и буллу промывали изотоническим раствором хлорида натрия (0,85% температура 34--35°). Наблюдали за изменением СЭО улитки в течение 2-х часов. В качестве контроля проводили опыты по описанной схеме с заполнением буллы 0,85% раствором хлорида натрия или раствором натриевой соли бензилпенициллина (в 1 мл 50 тысяч ЕД).

Для создания модели ОАТ проводили озвучивание "белым шумом" интенсивностью 105 дБ над нормальным порогом слышимости 2.10^-5 Н/м² в течение 5 минут. Интенсивность 105 дБ соответствовала звуковому давлению, измеренному на уровне барабанной перепонки исследуемого уха шумомером (PI-202, ГДР).

Изменение временных и амплитудных характеристик после ОАТ наблюдали в течение 1-1,5 часов, регистрируя их через каждые 15-30 минут.

Все полученные статистические данные обрабатывались по стандартным прикладным программам по методикам медицинской статистики, описанным у Полякова И.В., Соколовой Н.С. (Практическое пособие по медицинской статистике. // Л.: Медицина. 1975. - С. 3-46).

Экспериментальные исследования позволили сделать следующие выводы:

1. Изменения биоэлектрической активности улитки слухового анализатора кошки на моделях ОГГ, ОСО, ОАТ показывают, что имеет место идентичность в изменениях как амплитудных, так и временных характеристик суммарного электрического ответа улитки.

2. Биоэлектрическая активность улитки слухового анализатора кошки в условиях 20-30-минутной гипоксии по величине и характеру падения и восстановления амплитуд МП и N₁ АП может быть сравнима с биоэлектрической активностью улитки в условиях ОАТ и ОСО (фиг. 3).

3. При сравнении средних относительно нормы изменениях длительности всего СЭО и его компонентов можно отметить следующее:

а) большое сходство в изменении длительности СЭО и его компонентов непосредственно после ОАТ и 20-минутной гипоксии и после периода восстановления (фиг. 2);

б) сходство в изменении длительности СЭО и его компонентов после периода восстановления 20-30-минутной гипоксии и через 1-2 часа после ОСО, и различие непосредственно после патологических воздействий представлены в табл. 1.

4. Установлено, что качественное и количественное выражение биоэлектрической активности улитки в условиях ОГГ и ОАТ и ОСО идентичны (значительное уменьшение содержания кислорода в лабиринтной жидкости).

Это дает основание предположить, что непосредственно после ОАТ и ОСО возникает внутриулитковая гипоксия (в лабиринтной жидкости наступает снижение содержания кислорода за счет поражения окислительного фосфорилирования), которая вызывает нарушение энергетического метаболизма, что является определяющим в развитии ОСНТ при всех патологиях.

5. Прямым подтверждением метаболических изменений в улитке являются данные об увеличении содержания лактата и снижения содержания глюкозы в лабиринтной жидкости после ОГГ, ОСО и ОАТ (табл. 2, фиг. 4).

На основании полученных данных можно сделать вывод, что наиболее общим патогенетическим звеном, осложняющим течение патологического (процесса различного генеза), является внутриулитковая гипоксия, выступающая в виде постоянного или временного нарушения снабжения кислородом тканей с последующим нарушением метаболизма клеток, за которым следует снижение энергетического потенциала и функциональной устойчивости периферического отдела слухового анализатора.

Все изложенное выше является основанием для экспериментального изучения влияния различных фармакологических средств на функцию улитки в патологических моделях (оценка протективного действия фармакологического препарата).

Способ иллюстрируется графическими изображениями на фиг. 1-4, где:

На фиг. 1 представлена кривая СЭО улитки кошки при интенсивности "щелчка" 30 дБ над порогом обнаружения ответа.

На фиг. 2 представлены кривые изменения длительности характеристик точек СЭО в течение часа после ОГГ и ОАТ.

На фиг. 3 представлены кривые средних (относительно нормы) изменений амплитуды N₁ АП после ОГГ, ОСО, ОАТ (в %).

На фиг. 4 представлена диаграмма изменения содержания глюкозы и лактата в лабиринтной жидкости относительно нормы (НФУ) в условиях ОГГ, ОСО, ОАТ (в %).

Способ осуществляют, например, следующим образом.

В нормальных физиологических условиях (НФУ), как и в условиях патологических моделей ОГГ, ОСО, ОАТ, под внутрибрюшинным нембуталовым наркозом 40 мг/кг веса латеральным подходом обнажают слуховую буллу кошки с последующей ее трепанацией (отверстие диаметром 2-3 мм). Голову жестко фиксируют в специальном держателе, который обеспечивает свободный доступ к элементам среднего и внутреннего уха. Животное помещают в электроэкранированную, звукозаглушенную камеру. Константановый электрод, диаметром 0,1 мм на конце изогнутый в виде петли с помощью манипулятора устанавливают на вторичную мембрану круглого окна улитки кошки и определяют функцию периферического отдела слухового анализатора и оценивают уровень метаболических процессов в улитке.

Оценивают функцию периферического отдела слухового анализатора кошки по регистрации СЭО улитки с мембраны круглого окна в ответ на короткий звуковой сигнал "щелчок" длительностью 3,1-0,2 мс.

Регистрацию СЭО осуществляют с помощью универсальной электрофизиологической установки (УЭФУ), состоящей из трех основных узлов. Первый узел - блок формирования звукового воздействия (БФЗВ) - обеспечивает формирование и подачу звукового раздражителя в виде прямоугольного звукового импульса, длительностью 100 мксек ("щелчка"). Подача "щелчка" в 1 дБ осуществляется в динамическом диапазоне от 0 до 80 дБ над порогом обнаружения ответа. Динамический громкоговоритель 6ГД-36 устанавливают на расстоянии 15 см от барабанной перепонки. Предусмотрена возможность подачи одновременно "щелчка" и белого шума интенсивностью 105 дБ над нормальным порогом слышимости 2.10^-5 Н/м².

Второй узел УЭФУ - блок регистрации и преобразования ответа (БРПО) - позволяет регистрировать СЭО и измерять амплитуды компонентов ответа и их временные параметры в характерных точках с разрешающей способностью минус 72 дБ по напряжению и 2 мксек по времени. БРПО имеет схему фиксации нуля напряжения, что позволяет не только определять знак напряжения, но и значительно повысить точность измерения.

Третий узел УЭФУ - программное обеспечение для проведения статистической обработки массива данных с выхода БРПО, осуществления изменения параметров БРПО, их регистрации, получения графического изображения.

УЭФУ включает, кроме трех основных узлов, устройство для измерения температуры тела и артериального давления подопытного животного, а также объемно-частотный респиратор ВИТА-I, позволяющий проводить исследования при управляемом дыхании.

Исследователь может задавать любые режимы работы и снимать все показания СЭО как в определенные промежутки времени, так и в течение всего эксперимента.

На кривой СЭО (фиг. 1) улитки имеются наиболее характерные информативные точки об амплитудных и временных параметрах ответа. Параметры ответа измеряли в девяти условных точках.

Точка 0 соответствует началу подачи раздражителя и соответствует переднему фронту прямоугольного электрического импульса. Точка I - амплитуде микрофонного потенциала. Интервал между точками 0-2 соответствует латентному периоду МП и его длительности. Эта величина всегда постоянна для данных условий опыта. Интервал 2-3 соответствует латентному периоду АП; 3-9 - длительности АП; 3-5 - длительности N₁ АП; 5-7 - длительности негативного пика между N₁ и N₂ АП; 7-9 - длительности N₂ АП (фиг. 1).

В процессе исследования последовательно регистрируют время от начала подачи раздражителя (точка 0) до точек 2-9.

Величину амплитуды определяют для МП в точке 1, N₁ АП в точке 4 и N₂ АП - в точке 8.

Измерения проводили при увеличении интенсивности "щелчка" ступенчато на 10 дБ в динамическом диапазоне от 10 до 80 дБ над порогом обнаружения ответа.

2. Уровень метаболических процессов в улитке оценивают по содержанию в лабиринтной жидкости глюкозы и лактата.

В процессе опыта, вскрыв буллу среднего уха кошки до воздействия патологическими факторами, через мембрану круглого окна с помощью операционного микроскопа специальной микроканюлей производят забор лабиринтной жидкости, в которой определяют содержание глюкозы и лактата в контроле (норме).

После воздействия патологическими факторами лабиринтную жидкость забирают из второго уха этого же животного, что позволяет проследить изменение содержания глюкозы и лактата по сравнению с контролем у данного животного.

Исследования содержания лактата и глюкозы в лабиринтной жидкости проводят по методикам, указанным в справочнике В.В. Меньшикова (Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. // М.: Медицина, 1967. - С. 230-234).

В качестве примера оценки протективного действия фармакологического препарата на предлагаемых моделях ОСНТ приведем результаты эксперимента с использованием известного антигипоксанта – тримина - под условным названием АГ-5.

В 4-х сериях опытов (по 20 кошек в каждой) - нормальных физиологических условиях, и в трех патологических моделях ОСНТ - по методикам, описанным выше, подопытным кошкам внутривенно вводили АГ-5 по 25 мг на кг веса и регистрировали амплитудные и временные характеристики суммарного электрического ответа улитки кошки, а также содержание глюкозы и лактата в лабиринтной жидкости в различные временные сроки. Все полученные результаты эксперимента были подвергнуты статистической обработке и представлены в табл. 3-6.

Следует отметить, что в нормальных физиологических условиях введение АГ-5 не влияло как ни на один исследуемый показатель биоэлектрической активности улитки, так и на содержание глюкозы и лактата.

В то же время в создаваемых патологических моделях ОСНТ введение АГ-5 оказывало существенное влияние на все показатели биоэлектрической активности улитки и содержание глюкозы и лактата в лабиринтной жидкости, приближая их к фиксированной норме.

Таким образом, предложенный способ оценки протективного действия фармакологических препаратов на различных моделях ОСНТ в эксперименте на кошках позволяет:

1. объективно оценить функциональное состояние слухового анализатора;

2. показать возможность восстановления слуховой функции после патологического воздействия различного генеза;

3. выявить единый механизм развития острой сенсоневральной тугоухости при любом патологическом воздействии, а именно внутриулитковую гипоксию, приводящую к нарушению энергетического метаболизма на клеточном уровне и снижению биоэлектрической активности слухового анализатора;

4. выбирать различные фармакологические средства для дальнейшего экспериментального изучения их влияния на функцию улитки в предлагаемых патологических моделях.

Изобретение относится к экспериментальной медицине в области оториноларингологии и может быть использовано для оценки протективного действия фармакологического препарата при острой сенсоневральной тугоухости (ОСНТ) в эксперименте. С этой целью в условиях моделей ОСНТ различного генеза до и после введения исследуемого фармакологического препарата определяют амплитудные и временные характеристики суммарного электрического ответа улитки слухового анализатора кошки с мембраны круглого окна на короткий звуковой сигнал «щелчок» длительностью 3,1-0,2 мс при интенсивности щелчка 30 дБ над порогом обнаружения ответа. Определяют также содержание глюкозы и лактата в лабиринтной жидкости улитки. Если после введения препарата значения всех определяемых показателей приближаются к значениям таковых у кошек в нормальном физиологическом состоянии, то протективное действие фармакологического препарата оценивают как положительное. Способ позволяет объективно оценивать различные фармакологические средства по их влиянию на функцию улитки в предлагаемых патологических моделях и выявлять единый механизм развития ОСНТ при любом патологическом воздействии. 6 табл., 4 ил.

Способ оценки протективного действия фармакологического препарата при острой сенсоневральной тугоухости (ОСНТ) в эксперименте, заключающийся в том, что в условиях моделей ОСНТ различного генеза определяют амплитудные и временные характеристики суммарного электрического ответа улитки слухового анализатора кошки с мембраны круглого окна на короткий звуковой сигнал «щелчок» длительностью 3,1-0,2 мс при интенсивности щелчка 30 дБ над порогом обнаружения ответа, а также содержание глюкозы и лактата в лабиринтной жидкости улитки до и после введения исследуемого фармакологического препарата, и, если после введения препарата значения всех определяемых показателей приближаются к значениям таковых у кошек в нормальном физиологическом состоянии, то протективное действие фармакологического препарата оценивают как положительное.