СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИТНОГО ПРЕПАРАТА, СОДЕРЖАЩЕГО НУКЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ Российский патент 2004 года по МПК A61K31/7105 A61K31/711 A61K31/712 A61P35/00 

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к комплексным препаратам, содержащим комплекс катионных носителей и полимеров нуклеиновых кислот. Комплекс иногда называют липоплексом.

Как использовано в данном описании, термин "катионный носитель" относится к лекарственным носителям, имеющим положительные заряды в воде, которые являются эффективными для переноса лекарственных средств, особенно для переноса в клетки анионных лекарственных средств. Недавно катионные носители были широко изучены в качестве носителей лекарственных средств для переноса в клетки генов и РНК, таких как поли I:С.

Выражение "полимеры нуклеиновых кислот" относится к природным или синтезированным, или синтетически полученным из веществ природного происхождения полинуклеотидам (ДНК, РНК) и природным или синтезированным, или синтетически полученным из веществ природного происхождения олигонуклеотидам.

Уровень техники
Содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты, которые включают комплекс катионного носителя и полианионной двойной цепи полимера нуклеиновой кислоты, имеющего двойную спиральную структуру, могут быть получены только путем смешивания катионного носителя и полимера нуклеиновой кислоты с двойной цепью.

Однако в получаемых таким способом комплексных препаратах, содержащих нуклеиновую кислоту, частицы препаратов обычно являются крупными, имеющими диаметр от нескольких микрометров до нескольких сотен микрометров и гетерогенными. Содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты с такими крупными и гетерогенными частицами являются неудобными в отношении недостаточного получения гомогенных данных при исследовании внутриклеточных переносов и сигнальных экспрессий полимеров нуклеиновых кислот. Наиболее критические проблемы, касающиеся крупных размеров частиц, заключаются в трудности осуществления стерилизации в промышленном масштабе и в том, что в инъекционных иглах и капиллярах в случае внутривенного введения возможно появление эмболизации и тому подобного, несмотря на то, что фармацевтические препараты получают, исходя из предположения, что они безопасны при введении людям. Такие проблемы трудно разрешимы не только при использовании способов, в которых получают комплексные препараты только путем смешивания, как описано выше, но также с использованием способов получения, в которых применяется процесс диспергирования с использованием подходящих эмульгирующих дисперсионных устройств.

Агрегация частиц также представляет собой проблему, возникающую при сублимационной сушке, предпринимаемой для стабилизации комплексных препаратов.

Желательно, чтобы полимеры нуклеиновых кислот в комплексных препаратах имели высокие концентрации для снижения дозировки и уменьшения нагрузки на пациентов и медицинских работников в процессе введения, а также для достижения продуктивной эффективности комплексных препаратов. Однако при обычных способах получения, когда общее количество полимеров нуклеиновых кислот составляет 0,1 мг/мл или более, в частности, 0,5 мг/мл или более, происходит необычайная агрегация в условиях способа получения продукта и образуются огромные осадки или суспендированные твердые продукты, легко заметные невооруженным глазом. Они не могут быть диспергированы в достаточной степени с помощью какого-либо способа диспергирования.

Общепринято, что двухцепочечная РНК, имеющая двойную спиральную структуру, обычно используется в качестве генов и РНК, таких как поли I:С, с точки зрения их физиологических особенностей и стабильности для различных нуклеаз. Например, известно, что достаточная фармакологическая эффективность не достигается отдельным введением поли I и поли С вместо поли I:С, которая обладает физиологической активностью, такой как сильное индуцирование активности интерферона и иммунопотенцирующее действие (Archives of Virology, 51, 199-215 (1976)). Таким образом, полагают, что двойные цепи, имеющие двойные спиральные структуры, являются существенными для генов и РНК, таких как поли I:С.

Для содержащих нуклеиновую кислоту комплексных препаратов, которые включают комплекс катионного носителя и полимеров нуклеиновых кислот, необходимость двойных спиральных структур вообще не обсуждалась, и обычно в способах получения комплексных препаратов используют двухцепочечную ДНК и двухцепочечную РНК, имеющие двойную спиральную структуру.

Настоящие заявители подали заявку на патент, относящуюся к комплексным препаратам, содержащим нуклеиновую кислоту, в качестве нуклеаза-активирующих препаратов в раковых клетках, так как комплексные препараты, содержащие нуклеиновую кислоту, состоящие из катионных носителей и двойной цепи РНК, такой как поли I: С, активируют нуклеазы в раковых клетках, что является эффективным при лечении рака, а также ими подана заявка на патент, относящийся к комплексным препаратам, содержащим нуклеиновые кислоты, в качестве лекарственных агентов при гепатите, так как эти препараты в течение продолжительного периода времени индуцируют эффективные количества интерферонов, специфических для печени и селезенки (PCT/JP98/04695, PCT/JP99/01438).

Описание изобретения
Объектом настоящего изобретения является, в частности, разработка способа получения гомогенных комплексных препаратов хорошего качества, содержащих нуклеиновую кислоту, отличающихся тем, что эти препараты возможно получать так называемым стерилизационным фильтрованием, и они не содержат грубых частиц размером 7 мкм или более, которые считаются небезопасными для человека.

Авторы настоящего изобретения первыми установили, что вышеуказанные проблемы могут быть решены одним достижением, не оказывая влияния на фармакологическую активность препаратов, посредством получения с использованием полимеров нуклеиновых кислот с отдельной цепью, которая была отделена от двойной спиральной структуры или первоначально образована без двойной цепочечной структуры, без использования двойной цепи ДНК или двойной цепи РНК, обычно имеющих двойные спиральные структуры, в способе получения содержащих нулеиновые кислоты комплексных препаратов, которые содержат катионный носитель и полимеры нуклеиновых кислот, и таким образом осуществили настоящее изобретение.

Следовательно, настоящее изобретение включает способ получения содержащих нуклеиновую кислоту комплексных препаратов, отличающихся тем, что два полимера одноцепочечной нуклеиновой кислоты, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, добавляют по отдельности в форме одиночной цепи к катионному носителю или к исходным материалам перед образованием катионного носителя, и два полимера одноцепочечной нуклеиновой кислоты подвергают обработке диспергированием в способе получения указанного комплексного препарата, содержащего нуклеиновую кислоту, который включает катионный носитель и полимеры нуклеиновых кислот (далее упоминаемые как "содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты").

Далее изобретение будет описано подробно.

"Катионные носители", которые могут использоваться в настоящем изобретении, могут включать носители лекарственных средств, описанные в РСТ WO94/19314, такие как 2-о-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-о-диолеил-глицерин (упоминаемый далее как соединение А), представленный следующей структурной формулой [I], и носители лекарственных средств, образованные фосфолипидами в качестве обязательной компоненты, и носители лекарственных средств, такие как полилизин, в дополнение к коммерчески доступным липофектину (торговое название), липофектамину (торговое название), липофектаку (торговое название) и DMRIE-C (торговое название).

"Два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот", подходящие для использования в настоящем изобретении, могут включать, но не ограничены конкретно ими, в том случае если они представляют два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по меньшей мере, частично образовывать двойные цепи, например, две одноцепочечные ДНК и РНК, которые составляют природные гены или искусственно модифицированные гены (например, плазмиду) и две одноцепочечные РНК, такие как поли I и поли С, поли I и поли C₁₂U, поли I с частичной химической модификацией (например, поли (7-деазаинозиновая кислота)) и поли С, поли I и поли С с частичной химической модификацией (например, поли(бромцитидиловая кислота), поли (тиоцитидиловая кислота)). В настоящем изобретении можно использовать две отдельные цепи РНК, такие как поли I и поли С, которые составляют поли I:С, обладающее физиологической активностью, такой как сильное индуцирующее действие интерферонов. Использованные в данном описании термины "поли I", "поли С", "поли А", "поли U" и "поли C₁₂U" означают полиинозиновую кислоту, полицитидиловую кислоту, полиадениловую кислоту, полиуридиловую кислоту и сополимер цитидиловой кислоты и уридиловой кислоты, где одна уридиловая кислота замещает примерно каждую 12 цитидиловую кислоту, соответственно.

Выражение "могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи" относится к тому, что комплементарные основания, существующие в двух полимерах одноцепочечных нуклеиновых кислот, имеются в такой степени, что они могут образовывать двойные цепи при физиологических условиях, и данная степень изменяется в зависимости от типов полимеров одноцепочечных нуклеиновых кислот и длины каждого полимера нуклеиновой кислоты, и конкретная общность заключается в том, что число комплементарных оснований составляет 20 или более.

Подходящее число оснований, которое содержит каждый полимер одноцепочечной нуклеиновой кислоты и которое специально не ограничивается, составляет 10000 или менее, предпочтительно 2000 или менее. Число оснований может быть выбрано подходящим образом в зависимости от природы, которую имеет каждый полимер нуклеиновой кислоты. Кроме того, два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот необязательно состоят из одного и того же числа оснований. Каждый полимер нуклеиновой кислоты обычно имеет определенное распределение, составленное из различного числа оснований, но каждое число оснований означает число оснований для максимума распределения и упоминается в данном описании как "среднее число оснований".

В дальнейшем, например, среднее число оснований поли I и поли С в настоящем изобретении может быть определено на основе баланса между эффективностью и безопасностью. В частности, подходящим является диапазон от 30 до 3000 оснований, предпочтительно диапазон от 60 до 2000 оснований и более предпочтительно диапазон от 100 до 500 оснований.

Фосфолипиды в носителях лекарственных средств (катионные носители), образованные вышеуказанным соединением А и фосфолипидами в качестве обязательной компоненты, не ограничены, если они являются фармацевтически приемлемыми. Например, они включают фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, сфингомиелин и лецитин. Также можно использовать гидрированные фосфолипиды. Предпочтительные фосфолипиды могут включать фосфатидилхолин яичного желтка, лецитин яичного желтка, соевый лецитин и фосфатид яичного желтка. Можно использовать два или более типов фосфолипидов. Тем не менее, среди данных катионных носителей фосфатидилхолин или лецитин являются лучшими по сравнению с фосфатидилэтаноламином, обычно используемым в катионных носителях.

Соотношение компонентов фосфолипидов к соединению А изменяется в зависимости от вида фосфолипидов и вида двух используемых полимеров одноцепочечных нуклеиновых кислот, однако, количество фосфолипидов соответственно колеблется в диапазоне от 0,1 до 10 весовых частей, предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 5 весовых частей и более предпочтительно в диапазоне от 1 до 2 весовых частей на 1 весовую часть соединения А. Данное соотношение является таким же, когда фосфолипид заменяют на лецитин.

Соотношение компонентов полимеров нуклеиновых кислот к катионному носителю изменяется в зависимости от источника катионного носителя и используемого вида полимера нуклеиновой кислоты, однако, общее количество полимеров нуклеиновых кислот соответственно находится в диапазоне от 0,05 до 10 весовых частей, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 4 весовых частей и более предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 2 весовых частей на 10 весовых частей катионного носителя. Аналогично, когда комплекс образован поли I и поли С вместе с катионным носителем, полученным из соединения А и фосфолипидов в качестве обязательных компонентов, при условии что два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот представляют собой поли I и поли С, общее количество поли I и поли С составляет соответственно в диапазоне от 0,05 до 10 весовых частей, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 4 весовых частей и более предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 2 весовых частей на 10 весовых частей катионного носителя.

Содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты по настоящему изобретению (называемые далее "препаратами настоящего изобретения") могут быть получены, например, способом диспергирования с помощью обычных методов с использованием подходящих эмульгирующих диспергирующих устройств, после добавления двух полимеров одноцепочечных нуклеиновых кислот последовательно или одновременно к водному раствору, в котором диспергирован коммерчески доступный катионный носитель, или к водному раствору, в котором катионный носитель получают способом диспергирования с помощью обычного способа обработки водного раствора, в котором диспергируют исходные материалы перед получением катионного носителя с использованием подходящего эмульгирующего диспергирующего устройства, или к водному раствору, в котором диспергированы исходные материалы перед образованием катионного носителя. Препараты настоящего изобретения также могут быть получены способами, в которых две отдельные цепи полимеров нуклеиновых кислот добавляют к твердому катионному носителю или его исходным материалам и добавляют воду, а затем смесь диспергируют с помощью подходящего эмульгирующего диспергирующего устройства. Последовательность добавления, добавляемые объемы, добавляемые концентрации и концентрации катионных носителей и их исходных материалов в растворах выбирают произвольно, и они конкретно не ограничены в настоящем изобретении.

Более конкретно, при использовании катионного носителя, полученного из соединения А и фосфолипидов в качестве обязательных компонентов, препарат настоящего изобретения может быть эмульгирующей дисперсионной обработкой смеси, образованной постепенным добавлением по каплям водных растворов поли I и поли С по отдельности в водный раствор, в котором диспергирован катионный носитель. Также препарат настоящего изобретения может быть получен способом, в котором соединение А, фосфолипид, поли I и поли С взвешивают и загружают в химический стакан и грубо диспергируют после добавления воды с помощью гомогенизатора, а затем диспергируют под давлением с помощью эмульгирующего дисперсионного устройства.

Можно использовать два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, полученные разделением полимера двухцепочечной нуклеиновой кислоты с помощью обычных манипуляций. В частности, манипуляции могут включать неферментативные обработки, такие как нагревание при 60^oС или выше, или ферментативные обработки.

Вышеописанные коммерчески доступные катионные носители могут использоваться без обработки или с использованием подходящей обработки.

Вышеуказанные водные растворы могут включать воду для инъекций, дистиллированную воду для инъекций и растворы электролитов, такие как физиологический раствор, и раствор глюкозы.

Вышеуказанные эмульгирующие диспергирующие устройства могут включать, например, гомомиксер, гомогенизатор, ультразвуковое диспергирующее устройство, ультразвуковой гомогенизатор, эмульгирующее дисперсионное устройство высокого давления, Microfluidizer (торговое название), Nanomizer (торговое название), Ultimizer (торговое название), DeBEE2000 (торговое название) гомогенизатор высокого давления Manton-Gaulin типа, однако достаточными являются те, которые подходящим образом используются в медицинских целях. Условия обработки, временные интервалы и температуры обработки выбирают подходящим образом.

Препараты настоящего изобретения могут содержать в подходящих количествах фармацевтически приемлемые добавки, например, эмульгирующее диспергирующее вспомогательное вещество, стабилизатор, изотонический агент, липопротектанты и рН регулятор. В частности, они могут включать жирные кислоты, содержащие от 6 до 22 атомов углерода (например, каприловую кислоту, каприновую кислоту, лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, олеиновую кислоту, линолевую кислоту, арахидоновую кислоту и докозагексаеновую кислоту), их фармацевтически приемлемые соли (например, натриевые соли, калиевые соли и кальциевые соли), эмульгирующие, диспергирующие вспомогательные средства, такие как альбумин и декстран, стабилизаторы, такие как холестрин и фосфатидная кислота, изотонические агенты, такие как хлорид натрия, глюкоза, мальтоза, лактоза и сахароза, лиопротектанты и рН регуляторы, такие как хлористоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, гидроксид натрия, гидроксид калия и триэтаноламин.

Вышеуказанные фармацевтически приемлемые необязательные вспомогательные вещества могут быть добавлены подходящими способами перед или после диспергирования.

После диспергирования препараты необязательно могут быть профильтрованы через 0,2 мкм стерилизующую фильтрующую мембрану, а затем упакованы в ампулы и пузырьки. Диаметр частиц почти всех препаратов по настоящему изобретению составляет 200 нм или менее. Следовательно, почти 100% препаратов по настоящему изобретению может проходить через 0,2 мкм стерилизующую фильтрующую мембрану.

Посредством вышеуказанных способов получения, в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты, которые содержат гомогенные и тонкоизмельченные комплексные частицы, и, кроме того, могут быть получены содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты, содержащие полимеры нуклеиновых кислот в растворе в концентрации 0,1 мг/мл или более.

Следовательно, полученные вышеуказанными способами получения, содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты и полученные вышеуказанными способами получения содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты, включающие полимеры нуклеиновых кислот в растворе в концентрации в диапазоне от 0,1 до 10 мг/мл, в диапазоне от 0,5 до 10 мг/мл, в диапазоне от 1 до 10 мг/мл или в диапазоне от 2 до 10 мг/мл, также могут быть включены в объем настоящего изобретения. Тем не менее, настоящее изобретение не исключает полимеры нуклеиновых кислот с концентрациями в растворе 10 мг/мл или больше.

Кроме того, в том случае, если препараты настоящего изобретения, полученные посредством диспергирования, как описано выше, подвергают сублимационной сушке, то они могут представлять собой лиофилизованные препараты по настоящему изобретению. Следовательно, лиофилизованные препараты также могут быть включены в качестве одного из препаратов настоящего изобретения. Сублимационную сушку осуществляют общепринятыми способами.

Лиофилизованные препараты по настоящему изобретению, например, подвергают сублимационной сушке посредством предварительного замораживания при условиях от -40 до -20^oС в течение 2 часов после распределения по пузырькам, с последующей первичной сушкой при 0-10^oС при пониженном давлении, а затем вторичной сушке при 15-25^oС при пониженном давлении. Обычно пузырьки наполняют внутри газообразным азотом и закупоривают пузырьки, получая лиофилизованные препараты по настоящему изобретению. В том случае, когда препараты подвергают сублимационной сушке, предпочтительным является использование лиопротектантов, которые образуют лиофилизованные лепешки. Особенно подходящими являются сахариды и дисахариды, в частности, среди других наиболее предпочтительной является мальтоза.

Восстановление влагосодержания лиофилизованных препаратов по изобретению обычно может быть осуществлено путем добавления необязательного подходящего раствора (восстанавливающие растворы) с последующим использованием. Такие восстанавливающие растворы могут включать воду для инъекций, раствор глюкозы, растворы электролитов, такие как физиологический раствор и другие инфузионные растворы. Объем жидкости данных восстанавливающих растворов может изменяться в зависимости от применения и специально не ограничен, но подходящими являются объемы от 0,5 до двухкратного от объема жидкости перед сушкой или 500 мл или менее.

Препараты настоящего изобретения могут быть разработаны в форме жидких рецептур, таких как лекарственные средства для инъекций или для капельного введения, или в форме лиофилизованных препаратов.

Препараты настоящего изобретения можно вводить животным, включая человека, различными путями введения, как, например, внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутримышечно, путем ингаляции, назально, офтальмологически, перорально и ректально. Препаративные лекарственные формы и дозировки могут быть выбраны подходящим образом в соответствии с пожеланиями. Кроме того, препараты также могут использоваться в качестве различных реагентов и лекарственных средств для культивируемых клеток животных, растений, грибков и бактерий.

Лучший способ осуществления изобретения
Далее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров, сравнительных примеров и примеров исследования.

В качестве исходных продуктов в примерах 1-5 используют одноцепочечные РНК поли I и поли С, каждая из которых имеет среднее число оснований, составляющее приблизительно 200. Кроме того, после процесса диспергирования в каждом примере с успехом может быть осуществлена стерилизация фильтрованием без засорения фильтра в процессе стерилизации фильтрованием с использованием 0,2 мкм мембранного фильтра, и выходы фильтратов составляют в диапазоне от 98 до 102% для всех полимеров нуклеиновых кислот, указывая, что потенциальная стерилизация протекает приблизительно на 100%.

Пример 1
Сорок граммов мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, добавляли к 2,0 г соединения А и 2,0 г очищенного лецитина яичного желтка, смешанным посредством перемешивания, и диспергировали в течение 5 минут с помощью гомогенизатора, получая сырой дисперсионный раствор катионного носителя. Сырой дисперсионный раствор дополнительно диспергировали в течение часа с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства, а затем доводили водой для инъекций объем раствора до 250 мл, получая дисперсионный раствор катионного носителя. К 250 мл данного дисперсионного раствора при перемешивании добавляли семьдесят пять мл водного раствора, содержащего 250 мг поли I, затем добавляли при перемешивании 75 мл водного раствора, содержащего 250 мл поли С, и смесь дополнительно диспергировали в течение часа с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства с последующей стерилизацией фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат по настоящему изобретению. Средний диаметр комплексных частиц для данного препарата по настоящему изобретению составлял 138 нм, при измерении с помощью устройства для измерения диаметра частиц (DLS-700, производство Otsuka Electronics Inc., далее использовали этот же прибор), использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Впоследствии, по 1 мл данного препарата по настоящему изобретению распределяли в каждый пузырек и подвергали переработке в лиофилизованный препарат в соответствии с общепринятыми способами. Восстановление влагосодержания полученного лиофилизованного препарата осуществляли, добавляя 0,9 мл воды для инъекций. Средний диаметр комплексных частиц в восстановленном препарате по настоящему изобретению составлял 140 нм при измерении с помощью устройства для измерения диаметра частиц (DLS-700, производство Otsuka Electronics Inc. , далее использовали этот же прибор), использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Пример 2
Четыре килограмма сахарозы, растворенной в 10 л воды для инъекций, добавляли к 50 г соединения А и 30 г очищенного фосфатида яичного желтка, смешанного посредством перемешивания, и диспергировали смесь в течение 10 минут с помощью гомогенизатора Manton-Gaulin высокого давления, с последующим доведением объема раствора до 25 л водой для инъекций, получая дисперсионный раствор катионного носителя. Шесть литров водного раствора, содержащего 50 г поли С добавляли к 20 л данного дисперсионного раствора при перемешивании, а затем добавляли при перемешивании 6 л водного раствора, содержащего 50 г поли I. рН данного дисперсионного раствора доводили до 5,5 с использованием соляной кислоты и дисперсионный раствор дополнительно диспергировали в течение 30 минут с помощью гомогенизатора Manton-Gaulin высокого давления, а затем стерилизовали фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат по настоящему изобретению. Измеренный средний диаметр комплексных частиц препарата по настоящему изобретению составлял 150 нм. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Впоследствии, по 20 мл данного препарата по настоящему изобретению распределяли в каждый пузырек и подвергали переработке в лиофилизованный препарат в соответствии с общепринятыми способами. Восстановление влагосодержания полученного лиофилизованного препарата осуществляли, добавляя коммерчески доступный 5%-ный инфузионный раствор глюкозы (500 мл). Средний диаметр комплексных частиц в восстановленном препарате по настоящему изобретению составлял 151 нм при измерении с помощью устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Пример 3
Два грамма соединения А, 2 г соевого лецитина, 25 мг поли I и 25 мг поли С загружали в химический стакан, добавляли в стакан 20 г глюкозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, затем содержимое стакана смешивали путем перемешивания и диспергировали в течение 5 минут с помощью гомогенизатора. Сырой дисперсионный раствор диспергировали в течение часа с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления (800 кг/см²) и доводили водой для инъекций объем раствора до 400 мл, после чего стерилизовали фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат настоящего изобретения. Средний диаметр комплексных частиц данного препарата по настоящему изобретению составлял 121 нм, при измерении с использованием устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Пример 4
Сорок граммов мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, добавляли к 1,2 г соединения А и 2,0 г очищенного лецитина яичного желтка, смешанным посредством перемешивания, и диспергировали смесь в течение 30 минут с помощью небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления, а затем доводили водой для инъекций объем раствора до 250 мл, получая дисперсионный раствор катионного носителя. К 250 мл данной дисперсии при перемешивании одновременно постепенно добавляли по каплям семьдесят пять мл водного раствора, содержащего 100 мг поли I, и 75 мл водного раствора, содержащего 100 мл поли С, и дополнительно диспергировали в течение 2 часов с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства с избыточным давлением (1,100 кг/см²) с последующей стерилизацией фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат по настоящему изобретению. Средний диаметр комплексных частиц препарата по настоящему изобретению составлял 124 нм, при измерении с использованием устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Помимо этого, когда распределение размера диаметра частиц для данного препарата по настоящему изобретению измеряли с помощью устройства для измерения диаметра частиц (LA-910, Ноriba Ltd., далее применяли его же), в котором используется метод лазерного дифракционного рассеяния, были получены результаты, показанные на фиг.1. В соответствии с данными результатами, пик распределения размера диаметра частиц находился при 139 нм и крупные частицы не были обнаружены.

Пример 5
Сорок граммов мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, добавляли к 4,8 г соединения А и 8,0 г очищенного лецитина яичного желтка, смешанным посредством перемешивания, диспергировали смесь в течение 30 минут с помощью небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления, а затем доводили водой для инъекций объем раствора до 250 мл, получая дисперсионный раствор катионного носителя. К 250 мл данной дисперсии при перемешивании одновременно постепенно добавляли по каплям семьдесят пять мл водного раствора, содержащего 400 мг поли I, и 75 мл водного раствора, содержащего 400 мл поли С, и дополнительно диспергировали в течение 2 часов с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления (1,100 кг/см²) с последующей стерилизацией фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат по настоящему изобретению. Средний диаметр комплексных частиц препарата по настоящему изобретению составлял 138 нм, при измерении с использованием устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Пример 6
Один мл водного раствора, содержащего 100 мкг коммерчески доступного ДНК плазмидного вектора (pMC1neo), нагревали на водяной бане при 70^oС при перемешивании в течение 3 часов. К этому раствору при перемешивании добавляли два мл дисперсионного раствора, содержащего 2 мг коммерчески доступного липофектина (торговое название), аналогичным образом нагретого до 70^oС, и смесь диспергировали в течение 10 минут при 70^oС с использованием ультразвукового диспергирующего устройства зондового типа с последующей стерилизацией фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат по настоящему изобретению. Средний диаметр комплексных частиц в данном препарате по настоящему изобретению составлял 145 нм, при измерении с использованием устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Пример 7
В качестве исходных материалов использовали отдельную цепь РНК поли I и поли С, среднее число оснований в каждой из которых составляло примерно 1500.

Сорок граммов мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, добавляли к 1,2 г соединения А и 2,0 г очищенного лецитина яичного желтка, смешанным посредством перемешивания, и диспергировали смесь в течение 30 минут с помощью небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления, а затем доводили водой для инъекций объем раствора до 250 мл, получая дисперсионный раствор катионного носителя. К 250 мл данной дисперсии при перемешивании постепенно одновременно добавляли по каплям семьдесят пять мл водного раствора, содержащего 100 мг поли I, и 75 мл водного раствора, содержащего 100 мл поли С, и дополнительно диспергировали в течение 2 часов с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства с избыточным давлением (1,100 кг/см²) с последующей стерилизацией фильтрованием через 0,2 мкм мембранный фильтр, получая препарат по настоящему изобретению. Средний диаметр комплексных частиц препарата по настоящему изобретению составлял 134 нм, при измерении с использованием устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния. Кроме того, не имелось частиц с диаметром 1 мкм или больше.

Пример 8
Препарат настоящего изобретения со средним диаметром частиц, составляющим 130 нм, получали способом, аналогичным описанному в примере 7, при давлении диспергирования 800 кг/см², с использованием 200 мг поли I со средним числом оснований примерно 350 и 200 мг поли С со средним числом оснований примерно 350.

Пример 9
Препарат настоящего изобретения со средним диаметром частиц, составляющим 150 нм, получали способом, аналогичным описанному в примере 7, при давлении диспергирования 800 кг/см², с использованием 200 мг поли I со средним числом оснований примерно 1450 и 200 мг поли С со средним числом оснований примерно 1450.

Пример 10
Препарат настоящего изобретения со средним диаметром частиц, составляющим 135 нм, получали способом, аналогичным описанному в примере 7, при давлении диспергирования 800 кг/см², с использованием 400 мг поли I со средним числом оснований примерно 80 и 400 мг поли С со средним числом оснований примерно 80.

Сравнительный пример 1 (получение обычным способом, соответствующее примеру 4).

Сорок граммов мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, добавляли к 1,2 г соединения А и 2,0 г очищенного лецитина яичного желтка, смешанным посредством перемешивания, и диспергировали смесь в течение 30 минут с помощью небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления, а затем доводили водой для инъекций объем раствора до 250 мл, получая дисперсионный раствор катионного носителя. 150 мл водного раствора, содержащего 200 мг двойной цепи поли I:С, имеющей примерно 200 пар оснований, постепенно добавляли по каплям в 250 мл указанного дисперсионного раствора при перемешивании, и смесь дополнительно диспергировали в течение 2 часов с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления (1,100 кг/см²), получая сравнительный препарат. Средний диаметр комплексных частиц данного сравнительного препарата составлял 182 нм, при измерении с использованием устройства для измерения диаметра частиц, использующего метод динамического светорассеяния.

Кроме того, когда распределение размера диаметра частиц в препарате по настоящему изобретению измеряли с помощью устройства для измерения диаметра частиц, в котором используется метод лазерного дифракционного рассеяния, аналогичным образом как в примере 4, были получены результаты, показанные на фиг.2. В соответствии с данными результатами, пик распределения размера диаметра частиц находился при 243 нм, однако 20% было обнаружено в виде крупных частиц с диаметрами 3-20 мкм, имеющими пик в распределении при 8000 нм, указывая на бимодальное распределение частиц.

Помимо этого, при попытке фильтрования данного сравнительного препарата через 0,2 мкм мембранный фильтр, только 50 мл препарата проходило через фильтр, приводя к забиванию фильтра, и стерилизацию фильтрованием осуществить не удалось.

Сравнительный пример 2 (получение обычным способом, соответствующим примеру 5).

Сорок граммов мальтозы, растворенной в 100 мл воды для инъекций, добавляли к 4,8 г соединения А и 8,0 г очищенного лецитина яичного желтка, смешанным посредством перемешивания, диспергировали в течение 30 минут с помощью небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления, а затем доводили водой для инъекций объем раствора до 250 мл, получая дисперсионный раствор катионного носителя. Сто пятьдесят мл водного раствора, содержащего 800 мг двойной цепи поли I:С, имеющей примерно 200 пар оснований, постепенно добавляли по каплям в 250 мл указанного дисперсионного раствора при перемешивании, и дополнительно диспергировали в течение 2 часов с использованием небольшого лабораторного эмульгирующего дисперсионного устройства высокого давления (1,100 кг/см²), собирая сравнительный препарат. Этот сравнительный препарат представлял собой белый, склонный к выделению в осадок суспензионный раствор, и он осаждался с агрегированием в течение 5 минут после собирания. Он был подобен суспензионному раствору конечного осадка. Диаметры частиц не могли быть измерены, потому что их размеры превышали диапазон измерений диаметра частиц для измерительного устройства, использующего метод динамического светорассеяния. Фильтрование стерилизацией через 0,2 мкм мембранный фильтр было невозможно.

Тест-пример 1
Биологическую активность препарата по настоящему изобретению, полученного в примере 4, и активность сравнительного препарата из сравнительного примера 1, оценивали по их суппрессивному (подавляющему) действию на пролиферацию раковых клеток шейки матки (Hela S3).

В этом эксперименте клетки Hela S3 высевали в 96-луночные планшеты при концентрации 10⁴ клеток/лунку, для которых подтверждалось прилипание к лункам после культивирования в течение 5 часов или более, с последующим добавлением каждого препарата к культуре, затем культивирование продолжали и через 3 дня после добавления препаратов методом МТТ подсчитывали число жизнеспособных клеток. Отношения ингибирования получали из следующей формулы и подсчитывали значения IC₅₀. Результаты представлены в таблице.

IС₅₀= [1-(значение поглощения в обработанной препаратом группе клеток/значение поглощения в группе клеток, обработанной физиологическим раствором)Х100%
Значения IC₅₀ представлены как концентрация суммарного количества полимеров нуклеиновых кислот, полученного при объединении поли I и поли С.

Как показано в таблице, различия в биологической активности между препаратом настоящего изобретения согласно примеру 4 и сравнительным препаратом согласно сравнительному примеру 1 не имеется.

Результаты изобретения
Настоящее изобретение, например, имеет следующие результаты.

(1) Могут быть получены гомогенные содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты высокого качества, не содержащие крупные комплексные частицы.

(2) Могут быть получены гомогенные содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты высокого качества, которые по существу не содержат крупные комплексные частицы. Этот результат является более необычным при более высоких концентрациях полимеров нуклеиновых кислот.

(3) При восстановлении влагосодержания лиофилизованных препаратов, содержащих нуклеиновую кислоту комплексных препаратов, полученных согласно настоящему изобретению, могут быть восстановлены комплексные препараты, эквивалентные тем, которые существовали до сублимационной сушки.

(4) Могут быть обеспечены содержащие нуклеиновую кислоту комплексные препараты, которые могут проходить через 0,2 мкм стерилизующий фильтр приблизительно со 100%-ной эффективностью.

Краткое описание чертежей
На фиг.1 показано распределение диаметров комплексных частиц в препарате настоящего изобретения согласно примеру 4. Горизонтальная ось, левая вертикальная ось и правая вертикальная ось обозначают диаметр частиц (мкм), частоту повторения (%) и интегральную частоту повторения, соответственно.

На фиг. 2 показано распределение диаметров комплексных частиц в сравнительном препарате согласно сравнительному примеру 1. Горизонтальная ось, левая вертикальная ось и правая вертикальная ось обозначают диаметр частиц (мкм), частоту повторения (%) и интегральную частоту повторения, соответственно.

Способ получения препарата, содержащего комплекс катионного носителя с полимером нуклеиновой кислоты, заключается в том, что два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, способные, по крайней мере частично, образовывать двухцепочечные структуры, добавляют по отдельности, каждый в виде отдельной цепи, или к катионному носителю или к материалу, из которого будет образовываться катионный носитель, и все эти ингредиенты подвергают дисперсионной обработке. Технический результат: способ обеспечивает получение гомогенного композитного препарата хорошего качества, содержащего нуклеиновую кислоту, который может быть стерилизован посредством фильтрования, и отличается отсутствием крупных частиц размером 7 мкм или более, которые считаются небезопасными для человека. 3 с. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.

1. Способ получения содержащего нуклеиновую кислоту комплексного препарата, отличающийся тем, что два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, смешивают по отдельности в форме отдельной цепи с катионным носителем или с исходным материалом для катионного носителя перед образованием катионного носителя, а затем смесь диспергируют в водном растворе во время получения указанного содержащего нуклеиновую кислоту комплексного препарата.2. Способ по п.1, в котором оба средних числа оснований двух полимеров одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, колеблются в диапазоне 100-2000.3. Способ по п.1, в котором два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, представляют собой поли I и поли С.4. Способ по п.1, в котором катионный носитель представляет собой носитель лекарственных средств, содержащий 2-о-(2-диэтиламиноэтил)карбамоил-1,3-о-диолеоилглицерин и фосфолипиды в качестве обязательных компонентов.5. Способ по п.4, в котором фосфолипид представляет собой лецитин.6. Содержащий нуклеиновую кислоту комплексный препарат, полученный смешением двух полимеров одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, в форме отдельной цепи, с катионным носителем или с исходным материалом для катионного носителя перед образованием катионного носителя в водном растворе, и смесь диспергируют в водном растворе во время получения указанного содержащего нуклеиновую кислоту комплексного препарата, где комплекс содержит катионный носитель и два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, и где частица комплексного препарата имеет диаметр в среднем не более примерно 0,2 мкм в состоянии раствора, или его лиофилизированной форме.7. Содержащий нуклеиновую кислоту комплексный препарат по п.6 или его лиофилизированная форма, где частица комплексного препарата в среднем имеет диаметр не более примерно 150 нм, будучи в состоянии раствора.8. Комплексный препарат по п.7 или его лиофилизированная форма, где частицы комплексного препарата имеют диаметр не более примерно 200 нм, будучи в состоянии раствора.9. Содержащий нуклеиновую кислоту комплексный препарат, полученный смешением двух полимеров одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, в форме отдельной цепи, с катионным носителем или с исходным материалом для катионного носителя перед образованием катионного носителя в водном растворе, и смесь диспергируют в водном растворе во время получения указанного содержащего нуклеиновую кислоту комплексного препарата, где комплекс содержит катионный носитель и два полимера одноцепочечных нуклеиновых кислот, которые могут, по крайней мере частично, образовывать двойные цепи, и где частицы комплексного препарата могут проходить через стерилизующую фильтрующую мембрану размером 0,2 мкм, будучи в состоянии раствора или лиофилизированной форме.10. Комплексный препарат по пп.6-9 или его лиофилизированная форма, где концентрация полимеров нуклеиновой кислоты составляет 0,1-10 мг/мл в состоянии раствора.