СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЪЮВАНТА Российский патент 2013 года по МПК C12P1/02 A61K36/06 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при разработке, производстве и применении средств специфической профилактики (лечения) болезней в составе инактивированных или "живых" вакцин для профилактики (лечения) заболеваний, а также в составе смеси антигена при получении гипериммунных (иммунноспецифических) сывороток и их препаратов, и в частности для получения противовирусных вакцин, противобактерийных вакцин, получения высоко активных гипериммунных сывороток в том числе на низкоактивные антигены разного происхождения для создания диагностических иммуноферментных тест-систем, а также в составе других композиций для нормализации иммунного статуса организма животного.

Известен способ получения биологически активного продукта гепатопротекторного действия, включающий культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 48-72 ч с последующим отделением биомассы и получением культуральной жидкости, причем для культивирования используют посевной материал, полученный путем предварительного выращивания гриба вида Fusarium sambucinum в присутствии этанола, а при культивировании в качестве фактора усиления продуцирования метаболитов гепатопротекторного действия в питательную среду добавляют 0,5-1,5 об.% этанола (Патент РФ №2289957, МПК A23L 1/30, БИ №36, 2006).

Однако известный биологический продукт не обладает адъювантным действием (Адъювант /adjuvant/ - вещество или комплекс веществ, используемое для усиления иммунного ответа при введении одновременно с иммуногеном).

Известен способ получения адъюванта при взаимодействии солей алюминия с водными растворами щелочи (адъювант/сорбент) на основе геля гидроокиси алюминия (Ярилин А. А., Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - С.608. - ISBN 5-225-02755-5).

Известен также способ получения адъюванта (Фрейнда) путем культивирования живых клеток с последующим отделением продукта их жизнедеятельности (выделения из микобактерий туберкулеза липополисахаридов, сложных жирных кислот /дериваты ланолина/). Продукт жизнедеятельности смешивают с маслом и эмульгатором до получения стойкой эмульсии типа вода/масло, масло/вода или вода/масло/вода (Большая медицинская энциклопедия. Том 1 /Главный редактор академик Б.В.Петровский; издательство «Советская энциклопедия»; Москва, 1974. - 576 с.).

Известные способы получения адъюванта основаны на выполнении сложных технологических процедур, требующих длительного времени, кроме того известные адъюванты недостаточно эффективны, проявляют низкое качество целевого продукта, выявляемое в низкой степени стимуляции иммуногенности, высокой реактогенности, токсичности.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет повышения иммуногенной активности (устранения и/или значительного снижения реактогенности и токсичности конечного продукта, что повышает антигенную и иммуногенную активности, уменьшает неспецифическую нагрузку на иммунную систему организма и снижает реактогенность).

Задача настоящего технического решения достигается в способе получения адъюванта, характеризующегося тем, что гриб вида Fusarium sambucinum культивируют на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 ч с последующим отделением культуральной жидкости от биомассы гриба, причем культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15-20 мин при 800-1500 об/мин, а целевой продукт получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да.

Кроме того, в способе получения адъюванта предварительно перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110-115°С и давлении 1,3-1,5 атм по 1,5-2 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5-2,5 часа.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Впервые получен адъювант для получения противовирусных вакцин, противобактерийных вакцин, получения высоко активных гипериммунных сывороток из продукта жизнедеятельности гриба вида Fusarium sambucinum, что отвечает критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /сахароза/, 0,2% азота /аммоний азотнокислый NH₄NO₃/, 0,2% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м³. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 1 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 2. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /сахароза/, 0,3% азота /аммоний азотнокислый NH₄NO₃/, 0,3% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 2 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 3. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /сахароза/, 0,2% азота /аммоний азотнокислый NH₄NO₃/, 0,2% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м³. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110°С и с давлением 1,3 атм по 1,5 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 3 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 4. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /сахароза/, 0,3% азота /аммоний азотнокислый NH₄NO₃/, 0,3% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KH₂PO₄/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 115°С и с давлением 1,5 атм по 2 град/мин с последующей экспозицией в течение 2,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 4 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 5. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /глюкоза/, 0,2% азота /сульфат аммония (NH₄)₂SO₄/, 0,2% фосфора /натрий фосфорнокислый однозамещенный NaH₂PO₄/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м³. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 5 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 6. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /глюкоза/, 0,3% азота /сульфат аммония (NH₄)₂SO₄/, 0,3% фосфора /натрий фосфорнокислый однозамещенный NaH₂PO₄/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 6 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 7. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /глюкоза/, 0,2% азота /сульфат аммония (NH₄)₂SO₄/, 0,2% фосфора /натрий фосфорнокислый однозамещенный NaH₂PO₄/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м³. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110°С и давлении 1,3 атм по 1,5 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 7 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 8. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /глюкоза/, 0,3% азота /сульфат аммония (NH₄)₂SO₄/, 0,3% фосфора //натрий фосфорнокислый однозамещенный NaH₂PO₄/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 115°С и давлении 1,5 атм по 2 град/мин с последующей экспозицией в течение 2,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 8 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.

Пример 9. Адъювант 1-9, полученный по примерам 1-9, обеспечивает специфический иммунный ответ на введение гаптенов в сочетании (химическом соединении) с крупномолекулярным белком в значительно более высокой степени по сравнению с классическим адъювантом - полным адъювантом Фрейнда.

Влияние адъюванта, приготовленного по заявляемому способу, на иммуногенность адгезивных антигенов эшерихий изучали в сравнительных опытах на кроликах. Для опытов использовали адгезивный антиген эшерихий (вакцина №1 - контроль 1), адгезивный антиген в смеси с гидроокисью алюминия в соотношении 7:3 (вакцина №2 - контроль 2), адгезивный антиген эшерихий в смеси с адъювантом, приготовленным по заявляемому способу, в соотношении 1:4 (вакцина 3 - опытная с адъювантом 1; вакцина 4 - опытная с адъювантом 2; вакцина 5 - опытная с адъювантом 3; вакцина 6 - опытная с адъювантом 4; вакцина 7 - опытная с адъювантом 5, вакцина 8 - опытная с адъювантом 6, вакцина 9 - опытная с адъювантом 7, вакцина 10 - опытная с адъювантом 8). Для проведения испытаний были сформированы шесть групп (две контрольных и четыре опытных) кроликов массой по 2,8-3,0 кг, по 9 голов в каждой группе. Каждому кролику опытных и контрольной групп вводили подкожно по 1 см³ соответствующей вакцины, через 7 дней повторяли введение подкожно кроликам соответствующих групп соответствующих вакцин в дозе по 3 см³.

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что адъювант, полученный по заявляемому способу, обеспечивает повышение иммунного ответа на адгезивные антигены эшерихий в 2-8 раз. По адъювантным свойствам заявляемый препарат значительно превышает адъювантные свойства гидроокиси алюминия в составе вакцин.

При производстве адъюванта полностью исключается необходимость проведения специальных операций по выделению, рафинированию минеральных масел или приготовлении геля гидроокиси алюминия, практически полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций.

Адъювант, приготовленный согласно изобретению, при более производительном и технологическом способе изготовления, обладает большей стимулирующей иммунитет потенцией, безвреден в составе вакцин и других продуктов иммунологического назначения, ареактогенен, может применяться как самостоятельно, так и в сочетании с масляными адъювантами или адъювантами-сорбентами на основе геля гидроокиси алюминия и других веществ.

Таблица 1 Титры кроличьих сывороток, полученных с использованием и без использования адъюванта, приготовленного по заявляемому способу Иммуноген Титры сывороток С применением заявляемого адъюванта С адъювантом Фрейнда KLH-CP-AOZ 30000-40000 5000-10000 KLH-NCA 30000-50000 4000-8000 KLH-QSA 30000-50000 2000-7000

Таблица 2 Результаты испытания активности адъюванта, приготовленного по заявляемому способу, с рекомбинантными белками Состав иммунизирующей смеси   Доза заражения ЛД₅₀ ИЭ* oprF + гидроокись алюминия PA 103 200 57,43 1,77 100 50 25 12,5 oprF + адъювант 1 PA 103 200 91,38 2,83 100 50 25 12,5 oprF + адъювант 2 PA 103 200 101,03 3,12 100 50 25 12,5 oprF + адъювант 3 PA 103 200 96,22 2,97 100 50 25 12,5 oprF + адъювант 4 PA 103 200 91,41 2,82 100 50 25 12,5 АВ + гидроокись алюминия PA 103 200 61,56 1,9 100 50 25 12,5 АВ + адъювант 1 РА 103 200 72,46 2,22 100 50 25 12,5 АВ + адъювант 2 PA 103 200 76,27 2,36 100 50 25 12,5 АВ + адъювант 3 PA 103 200 80,08 2,47 100 50 25 12,5 АВ + адъювант 4 PA 103 200 72,4 2,24 100 50 25 12,5 Контроль PA 103 200 32,42   100 50 25 12,5 6,25 * где ИЭ - индекс эффективности вакцинации.

Таблица 3 Титр антител к адгезивным антигенам эшерихий в пробах сыворотки крови кроликов опытной и контрольных групп Наименование вакцины Титр антител в РА Через 7 суток после второй вакцинации Через 14 суток после второй вакцинации Через 21 сутки после второй вакцинации Адгезивный антиген (контроль №1) 1:10 1:20 1:50 Адгезивный антиген + гидроокись алюминия (контроль 2) 1:20 1:100 1:200 Адгезивный антиген + адъювант Фрейнда (контроль 3) 1:20 1:100 1:200 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 1 1:100 1:200 1:400 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 2 1:100 1:200 1:400 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 3 1:100 1:400 1:800 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 4 1:100 1:400 1:800 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 5 1:100 1:200 1:400 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 6 1:100 1:200 1:400 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 7 1:100 1:400 1:800 Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 8 1:100 1:400 1:800

Изобретение относится к области микробиологии. Способ предусматривает культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 ч с последующим отделением культуральной жидкости от биомассы гриба. Причем культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15-20 мин при 800-1500 об/мин, а целевой продукт получают из супернатанта отделением пептидов с молекулярной массой от 3000-60000 Д. Также предварительно перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110-115°С и с давленикм 1,3-1,5 атм по 1,5-2 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5-2,5 часа. Адъювант, приготовленный согласно изобретению, обладает большей стимулирующей иммунитет потенцией, безвреден в составе вакцин и других продуктов иммунологического назначения, ареактогенен, может применяться как самостоятельно, так и в сочетании с масляными адъювантами или адъювантами-сорбентами на основе геля гидроокиси алюминия и других веществ. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 9 пр.

1. Способ получения адъюванта, характеризующийся тем, что гриб вида Fusarium sambucinum культивируют на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 ч с последующим отделением культуральной жидкости от биомассы гриба, причем культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15-20 мин при 800-1500 об/мин, а целевой продукт получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да.

2. Способ по п.1, где предварительно перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110-115°С и давлении 1,3-1,5 атм по 1,5-2 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5-2,5 ч.