СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАСИТЕЛЯ ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ Российский патент 2004 года по МПК A61K49/10 

Предлагаемое изобретение относится к гистохимии, конкретно к технологии получения красителя, используемого в гистологической технике для избирательного окрашивания нейросекреторной субстанции крупноклеточных ядер гипоталамуса и нейрогипофиза, бета-базофилов гипофиза, В-клеток панкреатических островков, эластических волокон, муцина, гранул тучных клеток при изучении биологических объектов в морфологической диагностике заболеваний.

Известен способ получения красителя альдегид-фуксина по Гомори, согласно которому альдегид-фуксин получают из фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, воздействуя на него паральдегидом в среде этилового спирта и соляной кислоты (Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М.: ИЛ, 1962. - С.733; Лилли Р. Патогистологическая техника и прикладная гистохимия. - М.: Мир, 1969. - С. 514-515). Применение данного раствора, содержащего альдегид-фуксин, ограничивается несколькими днями между созреванием красителя и его порчей, что является недостатком.

Известен способ получения альдегид-фуксина по Роза (Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. - М.: ИЛ, 1962. - С.733-734). Способ состоит в переводе в осадок альдегид-фуксина, который образуется при взаимодействии фуксина основного для фуксинсернистой кислоты с паральдегидом в среде этилового спирта и соляной кислоты, путем добавления воды и хлороформа. Осадок альдегид-фуксина отделяют фильтрованием и высушивают. Выход сухого красителя не превышает количества взятого в реакцию фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, что является недостатком этого способа. Это удорожает конечный продукт - альдегид-фуксин.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому, принятому за прототип, является способ получения альдегид-фуксина в сухой форме по Габу (Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. - Медицина, Ленинградское отделение, 1962. - С.272). Этот способ заключается в образовании альдегид-фуксина при взаимодействии в водном растворе фуксина основного для фуксинсернистой кислоты с паральдегидом и соляной кислотой. Продукт реакции самопроизвольно выпадает в осадок, который отфильтровывают и высушивают. Выход красителя в сухой форме также не превышает количества взятого в реакцию фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, что является недостатком данного способа.

Задачей изобретения является увеличение выхода целевого продукта при усилении его красящих свойств.

Задача решается тем, что в известном способе получения альдегид-фуксина по Габу, включающем взаимодействие в водной среде фуксина основного для фуксинсернистой кислоты с паральдегидом и соляной кислотой, последующим отделением осадка и его сушкой, эту реакцию проводят при дополнительном введении в среду реагирования медного купороса при его весовом соотношении с фуксином основным для фуксинсернистой кислоты 1,0:0,3-1,0:0,4 соответственно.

Способ осуществляют следующим образом.

В 96,5 г дистиллированной воды последовательно растворили 0,3 г фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, 1,0 г медного купороса и к раствору добавили 1,2 г соляной кислоты (уд. вес 1,2) и 1,0 г паральдегида. Раствор оставили в стеклянной посуде с закрытой пробкой на 6 суток при температуре плюс 20^oС. Через 6 суток образовавшийся осадок отделили путем фильтрации через бумажный фильтр и высушили в термостате при температуре 56^oС в течение 24 ч. Высушенный осадок представлял собой мелкий порошок черного цвета, нерастворимый в воде, но хорошо растворимый в этиловом спирте. Выход красителя в сухой форме составил 0,5 г.

Опытным путем установлено, что увеличение количества вводимого в реакцию медного купороса выше 1,0 г не ведет к увеличению выхода целевого продукта. В то же время уменьшение количества вводимого медного купороса ниже 1,0 г ведет к уменьшению выхода красителя. Получаемый заявляемым способом порошок оказался красителем, сохранившим в себе красящие свойства, присущие альдегид-фуксину.

Пример 1. В 96,3 г дистиллированной воды последовательно растворили 0,3 г фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, 1,2 г медного купороса и к раствору добавили 1,2 г соляной кислоты (уд. вес 1,2) и 1,0 г паральдегида. Раствор оставили в стеклянной посуде с закрытой пробкой на 6 суток при температуре плюс 20^oС. Через 6 суток образовавшийся осадок отделили путем фильтрации через бумажный фильтр и высушили в термостате при температуре 56^oС в течение 24 ч. Высушенный осадок представлял собой мелкий порошок черного цвета, нерастворимый в воде, но хорошо растворимый в этиловом спирте. Выход красителя в сухой форме составил 0,5 г.

Пример 2. В 96,8 г дистиллированной воды последовательно растворили 0,3 г фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, 0,7 г медного купороса и к раствору добавили 1,2 г соляной кислоты (уд. вес 1,2) и 1,0 г паральдегида. Раствор оставили в стеклянной посуде с закрытой пробкой на 6 суток при температуре плюс 20^oС. Через 6 суток образовавшийся осадок отделили путем фильтрации через бумажный фильтр и высушили в термостате при температуре 56^oС в течение 24 ч. Высушенный осадок представлял собой мелкий порошок черного цвета, нерастворимый в воде, но хорошо растворимый в этиловом спирте. Выход красителя в сухой форме составил 0,4 г.

Таким образом, новым отличительным признаком в предлагаемом способе является введение медного купороса в предлагаемом соотношении с фуксином основным для фуксинсернистой кислоты, который, взаимодействуя с компонентами раствора, ведет к увеличению выхода целевого продукта при усилении его красящих свойств, т.е. к достижению основной задачи изобретения.

Для получения окрашенных препаратов с использованием полученного красителя депарафинированные срезы тканей окисляют смесью 3,0 г насыщенного водного раствора марганцевокислого калия с 3,0 г 3% серной кислоты и 44,0 г дистиллированной воды в течение 15 с. Затем срезы обесцвечивают в 2% водном растворе метабисульфита калия в течение 30 с и промывают в дистиллированной воде. Срезы окрашивают в растворе, содержащем 0,1 г полученного сухого красителя, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и 100 г 70% этилового спирта. Продолжительность окраски 15 мин, после чего срезы промокают фильтровальной бумагой и через спирты (70%, 96%, 100%) и ксилол заключают препараты в канадский бальзам.

При изучении окрашенных таким образом препаратов гипоталамуса, гипофиза, поджелудочной железы, желудка, кишечника, матки, нервных ганглиев установлено, что полученный по предлагаемому способу краситель обладает способностью эффективно окрашивать в фиолетовый цвет нейросекреторную субстанцию паравентрикулярных и супраоптических ядер гипоталамуса, нейросекреторных путей и нейрогипофиза, бета-базофилы гипофиза, В-клетки панкреатических островков, эластические волокна, а также базальные мембраны эпителиальных структур и микрососудов, липофусцин и муцины. Краситель, полученный согласно изобретению, красит срезы так же, как и альдегид-фуксин, полученный по способу Роза и по способу Габу, но из-за усиления его красящих свойств концентрацию красителя в растворе уменьшали в 5 раз.

Так, результаты окраски названных структур полностью совпадают как в отношении избирательности их окраски, так и ее интенсивности. Это имеет место при полном соблюдении идентичности условий проведения окраски за исключением уменьшения концентрации полученного красителя в красящем растворе в 5 раз.

Установлено, что из 1,0 г фуксина основного для фуксинсернистой кислоты по способу Роза получают 0,64 г сухого красителя, по способу Габу - 0,9 г, тогда как, согласно изобретению, выход красителя составляет 1,5 г, то есть соответственно в 2,34 и 1,67 раза больше. Это связано с усложнением структуры красителя за счет медного купороса.

Изобретение относится к гистохимии. Проводят взаимодействие в водной среде фуксина основного для фуксинсернистой кислоты с паральдегидом и соляной кислотой при дополнительном введении медного купороса при его весовом соотношении с фуксином основным для фуксинсернистой кислоты 1,0:0,3-1,0:0,4 соответственно с последующим отделением осадка и его сушкой. Изобретение позволяет увеличить выход целевого продукта и усилить его красящие свойства.

Способ получения красителя для гистологических срезов, включающий приготовление водного раствора на основе фуксина основного для фуксинсернистой кислоты, соляной кислоты и паральдегида, выдерживание раствора и последующие отделение осадка и сушку, отличающийся тем, что в водный раствор дополнительно вводят медный купорос при его весовом соотношении с фуксином основным для фуксинсернистой кислоты 1,0:0,3-1,0:0,4 соответственно.