СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОПРЕПАРАТОВ ИЗ ЖЕЛЧИ ДОЛГОСРОЧНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Российский патент 2024 года по МПК G01N1/30 G09B23/28 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биологии и может быть использовано для диагностических, научно-исследовательских целей и при изготовлении микропрепаратов для учебного процесса.

Существующие сегодня способы приготовления микропрепаратов из желчи носят временный характер и не могут быть использованы после длительного периода хранения для визуализации.

В клинической и лабораторной диагностике применяется классический способ изготовления микропрепарата: на плоское предметное стекло наносится капля биологического материала (желчь), а затем немедленно накрывается покровным стеклом [Методические указания МУК 4.2.3145-13. Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов]. В этом случае из-за тонкости покровного стекла полной герметизации в пространстве между двумя стеклами не возникает. Препарат такого типа завоздушивается и кристаллизуется, через несколько часов его визуализация затрудняется из-за выпадения кристаллов холестерина и желчных кислот. Препарат нативный, ни сразу, ни позже он не окрашивается. Сама желчь имеет цвет от соломенно-желтого до темно-коричневого цвета, затрудняющих визуализацию клеточных элементов, при их наличии в ней. Сами клетки не имеют пигмента и без специальных приемов и способов их невозможно увидеть и дифференцировать при микроскопическом исследовании. Нативные препараты, без окраски, в том числе из желчи, можно исследовать только с помощью световой микроскопии с опущенным конденсором. Кроме того, при микросокопии желчи невозможно установить наличие клеток, которые изначально находились в желчи из-за их перекрытия кристаллами желчи. В дальнейшем из-за цитолизиса желчными кислотами и набухания диагностически значимых клеток их невозможно идентифицировать при световой микроскопии с целью диагностики заболеваний. При этом в желчи в норме клетки не встречаются, допускается наличие лишь единичных лейкоцитов, попадающих из лимфатического русла (тканевые щели, лимфатические капилляры) при инвазивных вмешательствах с целью получения исследуемого материала [Ишманов М.Ю., Сертакова А.В., Соловьев А.М., Федяшина Н.А., Щербакова Е.В. 250 показателей здоровья. Справочник. Литрес. 2013. 718 с.]. При воспалительных процессах в желчь (дуоденальное содержимое) могут попадать из ближайших кровеносных сосудов разные форменные элементы: красные кровяные тельца, кровяные пластинки, лимфоциты, моноциты и нейтрофильные, эозинофильные и базофильные лейкоциты крови, атипичные клетки при разнообразных формах лейкозов, слущенные и поврежденные эпителиоциты желчевыводящих путей, онкологические клетки, могут встречаться бактериальные клетки и мицеллы грибов, патогенных для человека, дрожжевые грибы (Candida albicans, Candida non-albicans (Candida krusei, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida glabrata, Candida parapsilosis), Cryptococcus neoformans и другие) [Бурова С.А. Современные представления о грибковой патологии пищеварительного тракта. Лечащий врач - медицинский научно-практический журнал. № 12., 2003. С. 24-25.; Клабуков И.Д., Люндуп А.В., Дюжева Т.Г., Тяхт А.В. Билиарная микробиота и заболевания желчных путей. Вестник РАМН. № 72(3), 2017. С.172-179]. Установлено, что 60% бактерий, обнаруженных в желчном пузыре и желчевыводящих путях, являются грамположительными из них выявляются стафилококки (Staphylococcus epidermidis), и сарцины, в меньшем количестве – стрепотококки (Streptococcus faecium) [Данзанов Б. С., Бальхаев М. И., Дармаева Б.В., Бархутова Д.Д. Сравнительное исследование бактерий из желчного пузыря и конкрементов при остром холецистите и окружающих водоемов и почв. Acta Biomedica Scientifica, №. 3, 2009, С. 63-65.]. Большинство грамположительных бактерий являются условно-патогенными для организма человека, но при определенных условиях могут вызывать трудно излечимые заболевания, например при приобретении бактериями или их ассоциациями патогенных свойств или при иммунодефицитных состояниях. Заболевания верхнего отдела желудочно-кишечного тракта, билиарной системы, вызываемые условно-патогенной флорой, трудно выявлять врачам гастроэнтерологам, они плохо поддаются лечению из-за невозможности или сложности получения диагностического материала. При гнойном воспалении печени и желчевыводящих путей в желчи невозможно установить присутствие компонентов гноя: наличие сохраненных и погибших нейтрофильных лейкоцитов, выполняющих фагоцитарную функцию, сохраненных бактериальных клеток. В таком препарате можно лишь увидеть кристаллизацию желчи, однако провести иные типы исследований не представляется возможным. В современное время в желчь для консервации традиционно могут добавлять 5-8 капель 10% раствора нейтрального формалина, однако он деформирует клетки и убивает лямблии, информативность такой препарат не имеет [Ишманов М.Ю., Сертакова А.В., Соловьев А.М., Федяшина Н.А., Щербакова Е.В. 250 показателей здоровья. Справочник. Литрес. 2013. 718 с.] Также исследования желчеобразующей функции печени предлагается проводить пробу с метиленовым синим, при которой необходимо проглотить внутрь вечером 0,5 грамм метиленового синего, а затем при дуоденальном зондировании добавить сульфат магния, при соединении компонентов желчь окрашивается в синий цвет [Ишманов М.Ю., Сертакова А.В., Соловьев А.М., Федяшина Н.А., Щербакова Е.В. 250 показателей здоровья. Справочник. Литрес. 2013. 718 с.]. Однако, получить такую окрашенную желчь трудоемко, поскольку в организм человека попадают химические вещества с побочными эффектами, а именно сульфат магния может угнетать дыхательный центр и вызывать остановку дыхания [Справочник Видаль 2020. Лекарственные препараты в России. Видаль рус, 2020. 1120 с.].

В нашем случае метод с окрашиванием основным фуксином в большей степени применим для пузырной желчи, порции В, фазы IV, ее кислотность составляет 6,5-7,5 рН. Однако, при необходимости можно применять его для исследования базальной желчи, слабощелочной, получаемой в начале метода фракционного (многомоментного) дуоденального зондирования, а также печеночной желчи, порция С, кислотность 7,5-8,2 – щелочная рН, но в этом случае необходимо использовать кислый фуксин на спиртовом растворе. Окрашивание клеток в желчи происходит в этом случае по принципу реакции нейтрализации [Дроздов А. А., Зломанов В. П., Мазо Г. Н., Спиридонов Ф. М. Неорганическая химия в трех томах. Под редакцией академика Ю. Д. Третьякова. Том 2. М.: Издательский центр «Академия», 2004. с 178.], а спирт служит фиксатором для препарата, стабилизируя клетки в том состоянии, в котором они находились в организме человека. При немедленном добавлении основного фуксина в желчь, этот гистологический краситель, который является основным, и будет окрашивать ядра клеток, частично оседать вокруг цитолеммы клеток, после чего их можно легко обнаружить при световой микроскопии. Идентификацию клеток в окрашенных препаратах можно будет осуществлять при цитологическом исследовании, позволяя направлять ход диагностических мероприятий. Кроме животных клеток, полученных из организма человека в окрашенных микропрепаратах желчи возможно визуализировать бактериальные клетки, оценить их количество. Краситель фуксин окрашивает грамположительные бактерии, что облегчает их дифференциальную диагностику. При классической окраске бактерий по Граму, требуется фиксировать препарат над огнем горелки, что в нашем случае неприменимо. При окраске бактериальных клеток по Граму применяется бихромная окраска с карболовым раствором генцианового фиолетового и водным раствором фуксина [Gram H.C. Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten (нем.) // Fortschritte der Medizin : magazin. - 1884. - Bd. 2. - S. 185-189.] В процессе окрашивания препарат необходимо обесцвечивать в этиловом спирте и промывать водой. Большое количество операций при проведении окраски бактериальных клеток по Граму в желчи приведет к ее распаду и кристаллизации, и исследуемый материал будет утрачен. В нашем случае при немедленном нанесении на поверхность желчи спиртового раствора фуксина мы получаем фиксацию и окраску одновременно, причем как клеток организма человека, присутствующих в желчи, так и бактериальных клеток. В гистологии фуксином окрашивают амилоид и аксоны нейронов, а в ботанике этот краситель используется для прижизненной окраски ядер клеток растений [Фрайштат Д. М. Реактивы и препараты для микроскопии. - М.: Химия, 1980. - 480 с.]. Кроме того, данный реактив не является редким и дорогостоящим, и может приобретаться в необходимом количестве. В гистохимии существует способ окраски альдегидом фуксина по Гомори, при котором окрашиваются бета-клетки поджелудочной железы (инсулоциты), гранулы тиреотропного гормона в аденоцитах (бета-клетках) передней доли гипофиза, гранул тучных клеток, эластических волокон, главных клеток желудка и для выявления сульфатированных муцинов [Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., М., 1969; Лойда 3., Госсрау Р. и Шиблер Т. Гистохимия ферментов, Лабораторные методы, пер. с англ., с. 69, М., 1982; Меркулов Г. Курс патологогистологической техники, с. 122 и др., Л., 1969., Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е издание. Том 26]. При окрашивании фуксином клеток происходит одновременная окраска ядра и цитоплазмы, ввиду чего клетка легко обнаруживается в желчи. Ее некоторая идентификация возможна с помощью световой микроскопии, на основании форм и размеров ядра и цитоплазмы, наличия визуализируемых включений, органелл. При идентификации атипичных клеток в микропрепаратах желчи предлагаемый способ может служить методом выбора при диагностики рака печени, желчного пузыря, холангиокарциномы, исключая инвазивные процедуры, такие как биопсия. Также предлагаемый способ имеет значение для ранней диагностики рака желчевыводящей системы, поскольку рак желчного пузыря по данным ВОЗ находится на пятом месте среди других онкологических заболеваний, в России также от рака желчевыводящих путей значительная смертность [https://www.who.int/ru, Рак желчевыводящей системы. Клинические рекомендации. Общероссийский национальный союз «Ассоциация онкологов России», Общероссийская общественная организация «Российское общество клинической онкологии», 2020.]. Важно также отметить, что желательно использовать еще теплую желчь для окрашивания, поскольку при нагревании фуксин краснеет [Губен-Вейль, Методы органической химии, пер. с нем., 4 изд., т. 2. Методы анализа, М., 1963, с. 431-32; Идентификация органических соединений, пер. с англ., М., 1983, с. 195-96; Мазор Л., Методы органического анализа, пер. с англ., М., 1986, с. 122-24]. Указанное свойство нам будет полезно при изготовлении микропрепаратов по предлагаемой методике, так как клетки в еще теплой желчи, полученной из организма, сразу хорошо воспринимают и проявляют цвет красителя.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность многоразового использования его для учебных, научно-исследовательских и диагностический целей.

В случае, когда требуется визуализировать клетки, определить их количество и дифференцировать, то предлагается способ изготовления микропрепаратов из желчи с окрашиванием спиртовым раствором основного фуксина для цитологического исследования.

Способ изготовления микропрепаратов из желчи включающий подготовку желчи, двух предметных стекол, спиртовой раствор основного фуксина и прищепки для просушивания гистологических препаратов.

Отличием является то, что на одно предметное стекло помещают каплю желчи (желательно еще теплую), наносят каплю спиртового раствора фуксина и плотно накрывают вторым предметным стеклом и совершают несколько круговых движений, не разъединяя стекла фиксируют их с помощью зажима для просушивания гистологических препаратов в роли зажима и в таком виде просушивают. Зажим для просушивания гистологических препаратов далее снимают и фиксируют препарат в чехол для хранения гистологических препаратов.

Зажим может выполнен в виде прищепки, фиксирующей в стабильном положении стекла. Чехол для хранения гистологических препаратов выполнен из силикона, что снижает вероятность его повреждения во время длительного использования.

Полученные микропрепараты можно использовать в диагностических, научно-исследовательских целях, при которых необходимо визуализировать клетки, а также посчитать их количество и некоторым образом их дифференцировать, необходимо сразу до фиксации желчи между предметными стеклами, добавить спиртовый раствор основного гистологического красителя фуксина поверх капли желчи и немедленно накрыть вторым предметным стеклом, в процессе распределения желчи краситель окрасит клетки, которые будут там присутствовать. Этиловый спирт будет выступать в качестве фиксатора клеток, которые не будут разрушаться, а также выступит в качестве среды, облегчающей проникновение красителя внутрь цитоплазмы и ядра клеток.

Долговечность сохранения препаратов, возможность их исследования через длительный промежуток времени, возможность визуализации препарата актуальна в сложных диагностических случаях, для дифференциальной диагностики заболевания, а также наличия, вида и количества собственных клеток организма и онкологических клеток, кроме того наличия и разновидности бактериальных клеток, которые могут находиться в желчи.

В учебном процессе долговечность препаратов упрощает работу преподавателю и учебно-вспомогательному персоналу. Препарат можно использовать несколько раз, изготовив однажды.

Пример. По указанному способу изготовлен микропрепарат из желчи в октябре 2015 года. В хорошем состоянии микропрепарат использовался на учебных занятиях и в научно-исследовательской работе в феврале 2024 года для демонстрации и идентификации клеток эпителия желчевыводящих путей, попавших в желчь у животных. В окрашенных препаратах желчи также были показаны клетки крови и бактериальные клетки, попавшие в желчь из-за острого гнойного воспаления при моделировании описторхоза у животных в эксперименте.

Изобретение относится к медицине и биологии. Раскрыт способ изготовления микропрепаратов из желчи долгосрочной визуализации для цитологического исследования, заключающийся в том, что проводят подготовку желчи, двух предметных стекол, спиртового раствора основного фуксина и зажима для просушивания гистологических препаратов, затем на одно предметное стекло помещают каплю желчи, наносят каплю спиртового раствора фуксина и плотно накрывают вторым предметным стеклом и совершают несколько круговых движений, не разъединяя стекла, фиксируют их с помощью зажима для просушивания гистологических препаратов и в таком виде просушивают. Изобретение обеспечивает возможность многоразового использования его для учебных, научно-исследовательских и диагностический целей. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

Способ изготовления микропрепаратов из желчи долгосрочной визуализации для цитологического исследования, включающий подготовку желчи, двух предметных стекол, спиртового раствора основного фуксина и зажима для просушивания гистологических препаратов, отличающийся тем, что на одно предметное стекло помещают каплю желчи, наносят каплю спиртового раствора фуксина, плотно накрывают вторым предметным стеклом и совершают несколько круговых движений, не разъединяя стекла, фиксируют их с помощью зажима для просушивания гистологических препаратов и в таком виде просушивают.