Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)е
Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в селекции растений. Введение в геном растения молекулы ДНК, кодирующей протопорфириноген-оксидазу, обеспечивает придание трансформируемому растению устойчивости к гербицидам. 4 с. и 2 з.п. ф-лы, 5 табл.
1. Выделенная молекула ДНК, кодирующая протопорфириноген-оксидазу (протокс) растения, выбранная из группы, включающей фермент протокс сои с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:12, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:11, фермент протокс хлопчатника с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:16, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:15, фермент протокс сахарной свеклы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:18, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:17, фермент протокс рапса с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:20, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:19, фермент протокс риса с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:22, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:21, фермент протокс сорго с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:24, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:23, и фермент протокс пшеницы с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:10, или кодируемый нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:9.2. Выделенная молекула ДНК по п.1, кодирующая протокс, нуклеотидная последовательность которого гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы последовательностей, представленных в SEQ ID NO:9, в SEQ ID NO:11, в SEQ ID NO:15, в SEQ ID NO:17, в SEQ ID NO:19, в SEQ ID NO:21 или в SEQ ID NO:23; или протокс, имеющий по крайней мере одну аминокислотную модификацию, которая происходит в положении, выбранном из группы, включающей (а) положение, соответствующее аланину в положении 164 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (б) положение, соответствующее глицину в положении 165 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (в) положение, соответствующее тирозину в положении 370 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (г) положение, соответствующее цистеину в положении 159 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (д) положение, соответствующее изолейцину в положении 419 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:6; (е) положение, соответствующее валину в положении 356 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (ж) положение, соответствующее серину в положении 421 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (з) положение, соответствующее валину в положении 502 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (и) положение, соответствующее аланину в положении 211 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (к) положение, соответствующее глицину в положении 212 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (л) положение, соответствующее изолейцину в положении 466 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10; (м) положение, соответствующее пролину в положении 369 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (н) положение, соответствующее аланину в положении 226 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (о) положение, соответствующее тирозину в положении 432 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (п) положение, соответствующее валину в положении 517 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:12; (р) положение, соответствующее тирозину в положении 428 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; (с) положение, соответствующее пролину в положении 365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16; и (т) положение, соответствующее тирозину в положении 449 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:18; или протокс, имеющий две модификации, первая из которых происходит в указанном выше положении, а вторая происходит в положении, выбранном из группы, включающей: (I) положение, соответствующее серину в положении 305 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (II) положение, соответствующее треонину в положении 249 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (III) положение, соответствующее пролину в положении 118 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (IV) положение, соответствующее аспарагину в положении 425 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и (V) положение, соответствующее тирозину в положении 498 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.3. Способ получения трансгенного растения и потомства трансгенного родительского растения, включающий трансформацию родительского растения выделенными молекулами по пп.1 и 2 и необязательно передачу признака толерантности к гербицидам потомству трансгенного родительского растения с использованием известных методов селекции.4. Способ получения выделенной молекулы ДНК по любому из пп.1 и 2, который включает (а) получение нуклеотидного зонда, обладающего способностью специфически гибридизоваться с геном или мРНК протокса растения, причем зонд включает область, соседнюю с кодирующей последовательностью протеина протокса растения, длиной по крайней мере 10 нуклеотидов; (б) зондирование других кодирующих последовательностей протокса в популяциях клонируемых фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК из выбранного организма с использованием нуклеотидного зонда, полученного согласно стадии (а), и (в) выделение и размножение молекулы ДНК, которая включает область ДНК, кодирующую протеин, обладающий ферментативной активностью протопорфириноген-оксидазы (протокса).5. Способ получения растений, тканей растений, семян растений и частей растений, которые продуцируют устойчивую к ингибиторам форму фермента протокса растения, заключающийся в том, что выделенными молекулами ДНК по пп.1 и 2 трансформируют клетки растения с последующим получением растений, тканей растений, семян растений и частей растений с помощью методов прямой селекции, при которых устойчивые к гербицидам линии выделяют, изучают свойства и размножают.6. Способ по п.5, отличающийся тем, что выделенные молекулы по пп.1 и 2 получают следующим образом: (а) получают библиотеку геномной или кДНК из пригодного организма-источника с использованием приемлемого клонирующего вектора; (б1) гибридизуют библиотеку с молекулой-зондом; (б2) выявляют позитивные гибридизации зонда с клонами ДНК из библиотеки, которые представляют собой клоны, потенциально содержащие нуклеотидную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности протопорфириноген-оксидазы (протокса) или используют ДНК, полученную на стадии (а) в качестве матрицы для ПЦР с праймерами, представляющими собой маловырожденные части аминокислотной последовательности протопорфириноген-оксидазы (протокса).
Приоритет п.1 в части SEQ ID NOs:9-12 от 28.02.96, в части SEQ ID Nos:15-24 - от 27.02.97; п.2 в части признаков (а)-(д) и (1)-(V) от 28.02.96, в части признаков (е)-(т) - от 27.02.97; п.3 - от 28.02.96 или от 27.02.97 в соответствии с приоритетом пп.1 и 2; пп.4-6 - от 27.02.97.
