СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ИЛИ ТОЛЕРАНТНОСТИ К НЕМАТОДАМ РАСТЕНИЯ И ЕГО ПОТОМСТВА, КОНСТРУКЦИЯ ДНК, КОДИРУЕМЫЙ ЕЮ СЛИТЫЙ ПРОТЕИН, ПОВЫШАЮЩИЙ УСТОЙЧИВОСТЬ К НЕМАТОДАМ РАСТЕНИЯ И ЕГО ПОТОМСТВА Российский патент 2004 года по МПК C12N15/82 C12N15/53 C12N9/02 

Настоящее изобретение относится к способу повышения устойчивости или толерантности к патогенам растений, предусматривающему трансформацию растения трансгеном, кодирующим слитый протеин, который состоит из двух или большего количества протеинов или доменов протеинов, собственная экспрессия которых приводит к повышению устойчивости или толерантности к патогенам. Изобретение проиллюстрировано на примере совместного введения в Arabidopsis thaliana двух различных ингибиторов протеиназ в виде слитого протеина, что приводит к повышению устойчивости или толерантности растения к паразитическим нематодам. В настоящем изобретении подразумевается, что полученные согласно изобретению трансгенные растения могут обладать толерантностью или устойчивостью не только к нематодам, но и к вирусам, грибам, бактериям, насекомым, клещам и т.п.

Нематоды являются основными паразитами растений, наносящими огромный урон сельскому хозяйству, который ежегодно составляет > 100 миллиардов долларов США.

Для снижения потребности в нематоцидах, некоторые из которых принадлежат к наиболее опасным пестицидам, применяемым в сельском хозяйстве, чрезвычайно важным является повышение устойчивости растений к паразитическим нематодам. Существует несколько возможных подходов к созданию трансгенных растений с повышенной устойчивостью к нематодам, которые включают стратегии, направленные на уменьшение инвазии и миграции, истощение питательных клеток и стратегии, приводящие к уменьшению пищевой активности нематод (Atkinson и др., Tibtech 13: 369-374, 1995). В этом последнем подходе могут использоваться ингибиторы протеиназ (ИП), которые являются важным элементом защиты растений в естественных условиях (Ryan, Annu. Rev. Phytopathol. 28: 425-429, 1990). Известно десять групп ИП, которые проявляют активность в отношении всех четырех характерных для растений классов протеиназ, а именно цистеин-, серин-, металло- и аспартилпротеиназ (Richardson, Methods in Plant Biochemistry 5: 259-305, 1991). В ЕР-А-502730 описано, что эффективная защита от нематод может быть достигнута с помощью включающих ИП трансгенных систем. Одной из предпочтительных для борьбы с нематодами характеристик ИП является их небольшой размер. Возможность применения ИП для защиты культурных растений с помощью трансгенов возрастает в связи с тем, что многие ИП не оказывают отрицательных воздействий при их потреблении людьми.

Ранее были клонированы кДНК, кодирующие цистеин- и серинпротеиназы пищеварительной системы галловых нематод, и было установлено, что их основная протеолитическая активность сосредоточена в кишечнике, а также было обнаружено, что такие ИП, как CpTI (ингибитор трипсина вигны китайской) и оризацистатин (Ос-I), обладают эффективностью в отношении этих протеиназ. Сайтнаправленный мутагенез позволил увеличить значение К_i Ос-I в результате делеции одной аминокислоты. Этот модифицированный цистатин (Ос-IΔD86) в виде трансгена обладал повышенной эффективностью в отношении галловой картофельной нематоды (Urwin и др., Plant J. 8: 121-131, 1995). При экспрессии в Arabidopsis он ограничивает рост как галловой свекловичной нематоды Heterodera schachtii, так и яванской галловой нематоды Meloidogyne incognita.

Потомство, полученное от скрещивания трансгенных растений табака, экспрессирующих CpTI и лектин гороха соответственно, обладало аддитивной активностью в отношении защиты от табачной листовертки (Boulter и др., Crop Protection, 9: 351-354, 1990). С помощью конструкций, включающих тандем промотор/ген, можно получить аналогичный результат без скрещивания растений. В природе возможно наличие двух дополнительных альтернативных путей, приводящих в экспрессии более чем одного ингибитора, а именно экспрессии бифункциональных ингибиторов (Wen и др., Plant. Mol. Biol. 18: 813-814, 1992), и состоящих из нескольких доменов ИП (Waldron и др., Plant. Mol. Biol. 23: 801-8142 1993).

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка способа повышения устойчивости или толерантности к патогенам, предусматривающего введение более одного протеина-эффектора устойчивости или толерантности. В контексте настоящего настоящего изобретения понятие устойчивость означает способность интродуцированного трансгена ограничивать или предотвращать размножение патогена в или на трансгенном растении. Понятие толерантность означает способность трансгенного растения противостоять или восстанавливаться после повреждающих воздействий, связанных с атакой патогена, и давать более высокий урожай. Как устойчивость, так и толерантность к патогену приводит к снижению вызванного патогеном повреждения культурного растения.

Таким образом, в изобретении предлагается способ повышения устойчивости или толерантности растения и его потомства, предусматривающий интеграцию в геном этого растения гена, кодирующего слитый протеин, включающий

(а) первый протеин или домен протеина с антипатогенной активностью,

(б) пептидный линкер и

(в) второй протеин или домен протеина с антипатогенной активностью.

В частности, объектами изобретения являются указанные выше способ, гены и протеины, отличающиеся тем, что

- дополнительные протеины или домены протеинов с антипатогенной активностью сливают со слитым протеином с помощью пептидных линкеров,

- по меньшей мере один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью обладает ингибирующей активностью в отношении протеиназ,

- по меньшей мере один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью представляет собой ингибитор Oc-IΔD86,

- по меньшей мере один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью представляет собой ингибитор протеиназы CpTI,

- ген функционально слит с последовательностью промотора, обеспечивающей экспрессию предпочтительно в корнях растений,

- пептидный линкер включает аминокислотную последовательность, которая протеолитически расщепляется растением,

- пептидный линкер включает аминокислотную последовательность, которая является устойчивой к протеолитическому расщеплению растением,

- пептидный линкер отличается тем, что он включает аминокислотную последовательность QASSYTAPQPQ,

- пептидный линкер отличается тем, что он включает аминокислотную последовательность VILGVGPAKIQPEG,

- пептидный линкер отличается тем, что он включает аминокислотную последовательность QASIEGRYTAPQPQ,

- повышается устойчивость или толерантность к нематодам.

Изобретение также относится к трансгенным растениям, которые могут быть получены указанным выше способом. В частности, изобретение относится к растению, экспрессирующему слитый протеин, кодируемый молекулой ДНК по изобретению.

Кроме того, согласно изобретению можно применять указанные молекулы ДНК для повышения устойчивости или толерантности к патогенам растения или потомков растения.

Ниже более подробно поясняются термины, часто используемые при описании изобретения.

Понятие "растение" относится к любому растению, в частности к семенному материалу растений. Структурной и физиологической единицей растений являются растительные клетки, состоящие из протопласта и клеточной оболочки.

Понятие "растительная клетка" относится к любой клетке, которая либо является частью растения, либо получена из растения. Примеры клеток включают дифференцированные клетки, являющиеся частью живого растения, дифференцированные клетки в культуре, недифференцированные клетки в культуре, клетки недифференцированной ткани, такой как каллюс или опухоли, дифференцированные клетки семян, зародышей, побегов или пыльцы. В частности, растительные клетки могут предствалять собой отдельные выделенные клетки или культивируемые клетки либо части высокоорганизованной структуры, такой как, например, ткань растения или орган растения.

Группа клеток может быть организована в структурную или функциональную единицу, называемую тканью растения. Это понятие включает, но не ограничиваясь только ими, органы растения, семена растения, культуру ткани и любые группы растительных клеток, организованные в структурные и/или функциональные единицы.

Понятие растительный материал относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или к частям цветка, плодам, пыльце, пыльцевым трубкам, семяпочкам, зародышевым мешкам, яйцеклеткам, зиготам, зародышам, семенам, отводкам, к культурам клеток или тканей или к любой другой части или продукту растения.

Растение или клетка, в геном которых стабильно включена рекомбинантная ДНК, обозначают как трансгенное растение или клетка.

Понятие трансформация относится к интродукции нуклеиновой кислоты в клетку, в частности к стабильной интеграции молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.

Понятие рекомбинантная ДНК относится к одной или к нескольким молекулам ДНК, образованным путем соединения сегментов ДНК из различных источников и полученным с помощью метода рекомбинантной ДНК, как это описано, например, у Sambrook и др. в "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2-е изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, США (1989). Метод рекомбинантной ДНК позволяет получить рекомбинантную ДНК in vitro и перенести ее в клетки, где она может экспрессироваться или размножаться (см. Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, под ред. Juo, CRC Press, Boca Raton (1996), например путем переноса ДНК в протопласт (-ы) или клетку(-и) в различных формах, включающих, например, (1) очищенную ДНК в кольцевой, линейной или суперспиральной формах, (2) ДНК, входящую в нуклеосомы или хромосомы либо в ядра или в их части, (3) ДНК, образующую комплекс или связанную с другими молекулами, (4) ДНК, включенную в липосомы, сферопласты, клетки или протопласты, или (5) ДНК, перенесенную из организмов, отличных от организма-хозяина (например, Agrobacterium tumefaciens). Эти и другие различные методы интродукции рекомбинантной ДНК в клетки известны в данной области и могут применяться для получения трансгенных клеток или трансгенных растений по настоящему изобретению.

Первоначальное встраивание рекомбинантной ДНК в геном растения R⁰ осуществляют не традиционными методами селекции растений, а с помощью технических методов, представленных в настоящем описании. После первоначального встраивания трансгенные потомки могут быть размножены с использованием в основном традиционных методов селекции.

Понятие "ген" относится к дискретной области хромосомы, содержащей регуляторную последовательность ДНК, ответственную за контроль экспрессии кодирующей последовательности, которая транскрибируется и транслируется, приводя к получению определенного полипептида или протеина. В частности, понятие "ген" относится к кодирующей последовательности и связанным с ней регуляторным последовательностям, когда кодирующая последовательность транскрибируется с получением РНК, такой как мРНК, рРНК, тРНК, snPHK (малая ядерная, snurps-PHK), смысловая РНК или антисмысловая РНК. Примерами регуляторных последовательностей являются промоторные последовательности, 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности и терминирующие последовательности. Могут присутствовать дополнительные элементы, такие как, например, интроны.

Понятие "кодирующая последовательность" относится к молекуле ДНК, которая после транскрипции и трансляции приводит к образованию полипептида или протеина.

Понятие "экспрессия" относится к транскрипции и/или трансляции в растении эндогенного гена или трансгена. В случае антисмысловых конструкций, например, понятие "экспрессия" может относиться только к транскрипции антисмысловой ДНК.

Молекулу ДНК, содержащую по меньшей мере две гетерологичные части, например части, происходящие из ранее существовавших последовательностей ДНК, которые не являются связанными в их ранее существовавших состояниях, иногда называют химерным геном. Такие молекулы предпочтительно получают с помощью метода рекомбинантной ДНК.

В частности, понятие "гетерологичный" в контексте настоящего описания обозначает "отличающийся по происхождению, т.е. встречающийся в естественных условиях или полученный путем синтеза". Так, например, если клетку-хозяина трансформируют нуклеотидной последовательностью, которая не встречается в нетрансформированной клетке-хозяине, то считается, что эта нуклеотидная последовательность является гетерологичной по отношению к клетке-хозяину. Трансформирующая нуклеиновая кислота может содержать гетерологичный промотор, гетерологичную кодирующую последовательность или гетерологичную терминирующую последовательность. В альтернативном варианте трансформирующая нуклеиновая кислота может быть полностью гетерологичной или может включать любую возможную комбинацию гетерологичных и эндогенных нуклеотидных последовательностей.

Предлагаемый в изобретении способ основан на конструировании генов, кодирующих слитые протеины-эффекторы или домены протеинов, и, например, касается борьбы с нематодами с помощью конструкций, в которых слиты такие ИП, как CpTI и Ос-IΔВ86. Эти ИП выбраны постольку, поскольку они обладают разными ингибирующими характеристиками, что позволяет достичь заметных воздействий в отношении галловых нематод. Так, CpTI оказывает воздействие на выживание различных полов, a Oc-IΔD86 подавляет рост, в частности развитие женских особей нематод. Трансгенная экспрессия этих слитых протеинов приводит к снижению популяции атакующего патогена в течение одного поколения по меньшей мере на 25%, предпочтительно на 50%, что в отношении нематод было установлено по количеству вновь отложенных яиц. Без заметного снижения уровня воспроизводства вредителя потеря урожая, вызванная патогеном, может быть снижена на 25%, предпочтительно на 50%.

Основной принцип этого подхода основан на применении пептидных линкеров, которые позволяют обоим ИП транслироваться в виде слитого протеина. Особенности линкера определяют механизм введения, т.е. ИП могут встраиваться в виде слитого протеина или раздельно вследствие протеолитического расщепления. Стратегии, основанные на применении таких линкеров, обладают более широкими возможностями, чем только борьба с нематодами. Они представляют собой новую основу для группировки защитных генов с целью повышения эффективности и продолжительности действия трансгенной устойчивости или толерантности.

С целью повышения устойчивости или толерантности предлагаемый способ предусматривает интеграцию в геном растения гена, кодирующего слитый протеин, который включает

(а) первый протеин или домен протеина с антипатогенной активностью,

(б) пептидый линкер,

(в) второй протеин или домен протеина с антипатогенной активностью и

(г) необязательно один или большее количество протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью, слитых с одним либо с одним или несколькими пептидным линкерами.

Предпочтительными протеинами или доменами протеинов с антипатогенной активностью являются ИП, токсины Bacillus thuringiensis, связанные с патогенезом протеины, хитиназы, глюканазы, пептиды, включая литические пептиды, тионины, коллагеназы, липазы, лектины, инактивирующие рибосомы протеины, ингибиторы пектиназ, ингибиторы липаз, ингибиторы α-амилаз, протеин-ингибитор полигалактуронидазы, пататин, перматин, лизозим, холестериноксидаза, протеин оболочки вируса, антитела, одноцепочечные антитела, продукты авирулентных генов и гены, обусловливающие устойчивость, а также другие протеины, снижающие уровень воспроизводства или повреждений, вызванных насекомыми, нематодами, вирусами, бактериями или грибами. Отсутствуют данные о том, что слитые протеины или домены протеинов встречаются в виде слитых протеинов в природе. Соответствующие им последовательности генов предпочтительно происходят из генома более чем одного организма и для их соединения необходимо использование метода рекомбинантной ДНК. По сравнению с увеличением количества копий одного и того же домена-эффектора, что по существу приводит к повышению концентрации эффектора, различные домены двух или большего числа протеинов-эффекторов позволяют получить синергетическое или аддитивное действие. Если один или большее число протеинов или доменов протеинов соответствуют домену, кодируемому конкретной геномной областью подлежащего трансформации растения, интеграция слитой конструкции по настоящему изобретению должна непременно происходить в другую геномную область. Особенно предпочтительными являются протеины или домены протеинов, обладающие антипатогенной активностью в отношении более одного патогена культурных растений, или антипатогенные протеины, противостоящие группам болезней, таким как болезни, вызываемые грибами р. Fusarium и нематодами р. Meloidogyne.

Некоторые виды нематод создают места кормежки, в которых происходит модификация растительной клетки, и питаются в одном месте в течение нескольких часов или существенно дольше. Они включают виды родов Meloidogyne, Globodera, Heterodera, Rotylenchulus, Tyienchulus, Naccobus, Xiphinema, Longidorus, Paralongidorus, Cryphodera, Trophotylenchulus, Hemicycliophora, Criconemella, Verutus и Heliocotylenchus. Виды нематод, которые, как считается, питаются в одном месте более ограниченный промежуток времени, включают представителей таких родов, как Pratylenchus, Radopholus, Hirschmanniella, Trichodorus, Paratrichodorus, Ditylenchus, Aphelenchoides, Scutellonema и Belonolaimus. С точки зрения борьбы с видами указанных выше родов и других фитопатогенных видов нематод из родов Dorylamulus и Tyienchulus особый интерес представляют ИП, коллагеназы, ингибиторы пектиназы, лектины, пататин и холестериноксидаза. Многие ИП являются образующимися в процессе хранения семени протеинами, которые накапливаются по мере развития семени и могут рассматриваться в качестве протеинов, содержание которых в зрелом семени является одним из наиболее высоких. Для применения согласно изобретению в качестве наиболее предпочтительных могут рассматриваться ингибиторы цистеин- и серинпротеиназы пищеварительной системы нематод, локализованные в кишечнике нематод.

Особый интерес представляют цистеинпротеиназы, поскольку они не являются пищеварительными ферментами млекопитающих. Особенно эффективным является оризацистатин (Ос-I). Сайтнаправленный мутагенез Ос-I позволил повысить значение К_i в результате делеции одной аминокислоты. Этот модифицированный цистатин (Ос-IΔВ86) в виде трансгена обладал повышенной эффективностью в отношении галловой картофельной нематоды (Urwin и др., Plant J. 8: 121-131, 1995). При экспрессии в Arabidopsis он ограничивает рост как галловой свекловичной нематоды Heterodera schachtii, так и яванской галловой нематоды Meloidogyne incognita. Воздействие одного ИП на представителей двух основных групп нематод, имеющих экономическое значение, позволяет разработать стратегию развития широкомасштабной устойчивости для борьбы с очень широким спектром различных нематод-вредителей целевой культуры. Это является противоположным по отношению к ограниченному кругу видов-мишеней, устойчивость к которым обусловливают многие встречающиеся в естественных условиях гены. Так, например, ген устойчивости HI, который присутствует в таких сортах, как Marts Piper, обусловливает качественную устойчивость в отношении одной галловой картофельной нематоды (Globodera rostochiensis), но не защищает от других близкородственных видов (G. pallida).

Функцией пептидного линкера является соединение антипатогенных протеинов или доменов протеинов без нарушения их свойств. Длина встречающихся в естественных условиях линкеров, как правило, составляет примерно от 3 до 15 аминокислот. Наиболее часто встречающиеся в естественных условиях линкеры, которые являются наиболее предпочтительными обычными линкерами, представляют собой пентапептиды, состоящие только из Gly, Ser и Thr. Глицин обеспечивает гибкость, а две другие аминокислоты являются полярными и обеспечивают взаимодействие с растворителем или образуют водородную связь с азотом основной цепи. Это обеспечивает определенную конформационную и энергетическую стабильность. Маловероятно, что они взаимодействуют с какой-то другой частью связанных протеинов или доменов протеинов, и маловероятно, что они успешно расщепляются протеазами хозяина. В качестве предпочтительных аминокислот также рассматриваются Ala, Pro, Asp, Lys, Gin и Asn. Исключено использование гидрофобных остатков, таких как Arg и Glu, соответственно наиболее крупных основных и кислотных остатков. Линкеры, которые могут успешно расщепляться широко распространенными протеазами, часто имеют одну или несколько этих указанных в качестве нежелательных составляющих. Так, например, последовательность Gly-Gly-X, где Х часто обозначает остаток аминокислоты с гидрофобной боковой цепью, может быть местом протеолитического расщепления. Эти данные и перечень потенциально пригодных линкеров приведены у Р. Argos в J. Mol. Biol. 211, 943-958, 1990. Характеристики, свойственные расщепляемым линкерам, в данном контексте не рассматриваются. Линкеры нашли применение во многих областях. Наиболее близким к настоящему изобретению является применение линкеров для экспрессии в растениях функционально активных молекул антител, таких как одноцепочечные антитела. В растениях экспрессировали как полные, так и созданные посредством генной инженерии антитела. Одноцепочечный фрагмент F_V (ScFv) антител может быть сконструирован путем соединения вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и вариабельной области легкой цепи (V_L) гена антитела (V). Одним из способов решения этой проблемы является использование пептидного линкера.

Большое количество пептидов было создано с помощью компьютерных программ и скрининга библиотек трехмерных пептидных последовательностей. Приемлемый линкер представляет собой встречающийся в естественных условиях иммуноглобулиновый линкер со следующей примыкающей аминокислотной последовательностью: KESGSVSSEQLAQFRSLD (Bird и др., Science 242, 423-427, 1988; SEQ ID N0:12). В другом пептиде, имеющем аминокислотную последовательность EGKSSGSGSESKP (Bird и др.. Science 242, 423-427, 1988; SEQ ID N0:13), доминируют Gly, Ser и Thr. Он с успехом использован для экспрессии ScFv в растениях (Owen и др., Biotechnology 10, 790-794, 1992). Линкер, имеющий аминокислотную последовательность GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0:14), был рекомендован для ScFv антител на основе определения евклидова расстояния между С-концом У_Н-домена и N-концом V_L-домена (Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5879-5883, 1988).

Этот линкер обладает гибкостью и при этом сохраняет стабильность и конформацию в растворе (Argos, J. Mol. Biol. 211, 943-958, 1990).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения из кодирующих последовательностей ИП Ос-IΔП86 и CpTI создают тандем и соединяют в рамке считывания последовательностью пептидного линкера, созданной таким образом, чтобы она была подвержена протеолизу. Используемая последовательность пептидного линкера соответствует 14 аминокислотам (VILGVGPAKIQFEG; SEQ ID N0:l) центральной "спейсерной" области металлотионеинподобного протеина гороха, т.е. PsMTa (Evans и др., FEBS 262: 29-32, 1990). Известно, что эта "спейсерная" область чувствительна к действию протеиназ (Кillе и др., FEBS 295: 171-175, 1991, и Tommey и др., FEBS 292: 48-52, 1991). Как CpTI, так и Oc-IΔD86 присутствовали в основном в виде отдельных протеинов при экспрессии в трансгенных растениях Arabidopsis. Известны данные о многих других протеинах, чувствительных к протеолитическому расщеплению, и несколько их последовательностей, имеющих важное значение, были охарактеризованы (Uhlen и др., Meth. Enzymol. 185: 129-143, 1990, и Foresberg и др., J. Prot. Chem. 11: 201-211, 1992).

Естественным примером применения чувствительного к протеолитическому расщеплению линкера является мультицистатин картофеля, PML, который представляет собой восемь доменов цистатина, расположенных в виде тандема и связанных с последовательностями, чувствительными к протеолитическому расщеплению (Waldron и др., Plant. Mol. Biol. 23: 801-812, 1993). При этом, однако, отсутствуют данные о том, что PML является фрагментом растений, но он накапливается в неактивной форме в виде кристаллов в субфеллогеновом слое клубней. Вероятно, он приобретает активность после фрагментации в кишке определенных видов насекомых. Он не пригоден для применения при борьбе с нематодами, поскольку маловероятно, чтобы они могли проглотить этот протеин с молекулярной массой 86,8 кДа.

Рыльце персидского табака Nicotiana alata содержит необычный ИП (NA-PI-II). Он экспрессируется в виде протеина-предшественника с рассчитанной молекулярной массой 41,6 кДа, который расщепляется в 6 сайтах с образованием 7 пептидов. Все пептиды, кроме первого, имеют одинаковый размер и форму N-концевой последовательности, а седьмой пептид не несет функционально активного ингибируещего сайта, способного ингибировать либо химотрипсин, либо трипсин. Сайты, выделяющие в результате процессинга функционально активные ИП, не были определены.

Молекулы, подверженные такому же процессингу, также существуют в организме животных, и одним из примеров является профилаггрин, участвующий в конечной дифференцировке эпидермиса млекопитающих.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения из кодирующих последовательностей ИП Ос-IΔВ86 и CpTI создают тандем и соединяют в рамке считывания последовательностью пептидного линкера, созданной таким образом, чтобы она была устойчива к протеолизу. Используемая последовательность пептидного линкера соответствует 11 аминокислотам (QASSYTAPQPQ; SEQ ID N0:2) фермента галактозооксидазы грибов, которые связывают первые два домена фермента. Известно, что эта область имеет жесткую структуру (Ito и др.. Nature 350: 87-91, 1991), и отсутствие данных о ее протеолитическом расщеплении позволяет предположить, что линкер не чувствителен к быстрому протеолизу. В Arabidopsis конструкция, которая обеспечивает экспрессию слитого протеина Ос-IΔВ86 и CpTI, сохраняет первичную целостность в виде протеина с молекулярной массой 23 кДа. Описаны другие полужесткие линкеры, такие как глюкоамилаза 1 (Kramer и др., J. Chem. Soc. Farad. Trans. 89: 2595-2602, 1993), которые могут применяться для осуществления этой же функции. Последовательность линкера галактозооксидазы может быть модифицирована с целью приобретения чувствительности к протеолитическому расщеплению. Так, последовательность модифицированного линкера QASIEGRYTAPQPQ (SEQ ID NO: 11) протеолитически расщепляется в грибной системе экспрессии.

Кодирующую последовательность слитого протеина по изобретению функционально связывают с обеспечивающим экспрессию в растении промотором. Предпочтительные промоторы включают конститутивные, индуцибельные, регулируемые временными параметрами, регулируемые параметрами, связанными со стадией развития, регулируемые химическим путем, предпочтительные для определенной ткани и/или тканеспецифичные промоторы.

Предпочтительные конститутивные промоторы включают промоторы 35S и 19S CaMV (Farley и др., US 5352605). Дополнительный предпочтительный промотор получают из любого одного или из нескольких генов актина, которые, как известно, обеспечивают экспрессию в большинстве типов клеток. Содержащие промоторы кассеты экспрессии, описанные у McElroy и др., Мо1. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991), могут быть легко модифицированы для экспрессии кодирующей последовательности и особенно предпочтительны для применения в однодольных растениях-хозяевах.

Еще один предпочтительный конститутивный промотор получают из гена убикитина, который представляет собой еще один продукт гена, для которого известна способность накапливаться во многих типах клеток. Промотор убикитина клонировали из нескольких видов для применения в трансгенных растениях [например, в подсолнечнике (Binet и др., Plant Science 79: 87-94 (1991)), в кукурузе (Christensen и др., Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)]. Промотор убикитина кукурузы исследовали в трансгенных системах однодольных растений, и его последовательность и векторы, сконструированные для трансформации однодольных растений, описаны у Christiansen и др. в ЕР-А 342926.

Тканеспецифичные или тканепредпочтительные промоторы, пригодные для экспрессии кодирующей последовательности в растениях, в частности в кукурузе и сахарной свекле, представляют собой промоторы, которые обеспечивают экспрессию в корне, сердцевине растения, листе или пыльце. Примерами являются промотор TUB1 гена b1-тубулина Arabidopsis thaliana (Snustad и др., Plant Cell 4: 549, 1992), промоторная область PsMT_A гена металлотионеинпободного гена Pisum sativum (Evans и др., FEBS Letters 262: 29, 1990), промоторы RPL16A и ARSK1 Arabidopsis thaliana и другие промоторы, описанные в WO 97/20057 и WO 93/07278. Другим пригодным промотором является фрагмент промотора wunl картофеля (Siebertz и др., Plant Cell 1: 961-968, 1989), который индуцируется в тканях, окружающих место ранения. Кроме того, пригодными для обеспечения экспрессии и также предпочтительными являются индуцируемые химическим путем промоторы (см. WO 95/19443).

В химерных генах по настоящему изобретению кроме промоторов могут применяться различные терминаторы транскрипции. Терминаторы транскрипции ответственны за прекращение транскрипции за трансгеном и за его правильное полиаденилирование. В одном из предпочтительных вариантов осуществления кодирующую последовательность функционально связывают с ее собственной встречающейся в естественных условиях последовательностью сигнала полиаденилирования. Пригодными терминаторами транскрипции являются таковые, для которых известно, что они функционируют в растениях, и они включают терминатор 35S CaMV, терминатор tml, терминатор Е9 гена rbcS гороха и другие, известные в данной области. Пригодные терминирующие области, такие как терминирующие области октопинсинтазы и нопалинсинтазы, могут быть получены из Ti-плазмиды A. tumefaciens. Они также описаны у Rosenberg и др., Gene 56: 125 (1987); Guerineau и др., Mol. Gen. Genet. 262: 141-144 (1991); Proudfoot, Cell, 64: 671-674 (1991); Sanfacon и др.. Genes Dev., 5: 141-149; Mogen и др.. Plant Cell, 2: 1261-1271 (1990); Munroe и др., Gene, 91: 151-158 (1990); Ballas и др., Nucleic Acid Res., 17: 7891-7903 (1989); Joshi и др. NucleicAcid Res., 15: 9627-9639 (1987).

Кроме того, было установлено, что многочисленные последовательности усиливают экспрессию единицы транскрипции гена, и эти последовательности могут использоваться в сочетании с кодирующей последовательностью для усиления экспрессии в трансгенных растениях. Было установлено далее, что различные интронные последовательности усиливают экспрессию, особенно в клетках однодольных растений. Так, например, было установлено, что интроны гена кукурузы Adhl значительно усиливают экспрессию гена дикого типа под контролем родственного ему промотора при интродукции в клетки кукурузы (Callis и др., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)). Интронные последовательности обычно встраивают в растительные трансформирующие векторы, как правило, в нетранслируемую лидерную последовательность.

Конструкции также могут включать регулятор, такой как сигнал ядерной локализации (Kalderon и др.. Cell 39: 499-509 (1984); Lassner и др., Plant Molecular Biology 17: 229-234 (1991)), растительную трансляционную консенсусную последовательнсть (Joshi C.P., Nucleic Acids Research, 15: 6643-6653 (1987)), интрон (Luehrsen и Walbot, Mol. Gen. Genet, 225: 81-93 (1991)) и т.п., функционально связанные с соответствующей нуклеотидной последовательностью.

Предпочтительно в конструкцию кассеты экспрессии включают 5'-лидерную последовательность. Такие лидерные последовательности могут служить для усиления трансляции. Трансляционные лидерные последовательности известны в данной области и включают лидерные последовательности пикорнавирусов, например EMCV-лидер (5'-некодирующая область энцефаломиокардита) (О. EIroy-Stein, T.R. Fuerst и В. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130, (1989)), лидерные последовательности потивирусов, например TEV-лидер (вирус табачной гравировки) (Allison и др., MDMV-leader (Maize Dwarf Mosaic Virus), Virology, 154: 9-20 (1986)), и лидерную последовательность протеина, связывающего тяжелую цепь человеческого иммуноглобулина (BiP) (Macejak D.G. и Sarnow P., Nature, 353: 90-94, (1991)), нетранслируемую лидерную последовательность мРНК покровного протеина вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling, S.A. и Gebrke L., Nature, 325: 622-625, (1987)), лидерную последовательность вируса мозаики табака (TMV) (Gallie D.R. и др., Molecular Biology of RNA, стр. 237-256, (1989)) и лидерную последовательность вируса хлорозной мозаики кукурузы (MCMV) (Lommel S.A. и др., Virology, 81: 382-385 (1991)). Они также описаны у Della-Cioppa и др., Plant Physiology, 84: 965-968 (1987)).

Описанные выше гены, кодирующие слитые протеины, могут быть интродуцированы в растительную клетку различными известными в данной области методами. Для специалиста в данной области техники очевидно, что выбор конкретного метода может определяться типом растения, подлежащим трансформации. Пригодные методы трансформации растительных клеток включают микроинъекцию (Crossway и др., BioTechniques 4: 320-334 (1986)), электропорацию (Riggs и др., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83:5602-5606 (1986)), опосредуемую Agrobacterium трансформацию (Hinchee и др., Biotechnology 6: 915-921 (1988) (данные о трансформации кукурузы см. также у Ishida и др., Nature Biotechnology 14: 745-750 (июнь 1996)), непосредственный перенос гена (Paszkowski и др., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Hayashimoto и др., Plant Physiol. 93: 857-863 (1990) (рис)) и метод баллистического ускорения частиц с использованием устройств, выпускаемых фирмами Agracetus, Inc., Мэдисон, шт. Висконсин, и Dupont, Inc., Уилмингтон, шт. Дэлавер (см., например, Sanford и др., патент US 4945050 и МсСаbе и др., Biotechnology 6: 923-926 (1988)). Они также описаны у Weissinger и др.. Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); у Sanford и др., Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (лук); у Svab и др., Ргос. Natl. Acad. Sci, USA 87: 8526-8530 (1990) (хлоропласт табака); у Christou и др., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988) (соя); у McCabe и др., Bio/Technology 6: 923-926 (1988) (соя); у Klein и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (1988) (кукуруза); у Klein и др., Bio/Technology 6: 559-653 (1988) (кукуруза); у Klein и др., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (кукуруза); у Fromm и др., Bio/Technology 8: 833-939 (1990); у Gordon-Kamm и др.. Plant Cell 2: 603-618 (1990) (кукуруза); у Koziel и др., Biotechnology 11: 194-200 (1993) (кукуруза); у Shimamoto и др., Nature 338: 274-277 (1989) (рис); у Christou и др., Biotechnology 9: 957-962 (1991) (рис); у Datta и др., Bio/Technology 8: 736-740 (1990) (рис); в ЕР-А-332591 (ежа сборная и другие Poolideae); у Vasil и др., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) (пшеница); у Weeks и др., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) (пшеница); у Wan и др., Plant Physiol. 104: 37-48 (1994) (ячмень); у Jahne и др., Theor. Appl. Genet. 89: 525-533 (1994) (ячмень); у Umbeck и др., Bio/Technology 5: 263-266 (1987) (хлопчатник); у Casas и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216 (декабрь 1993) (сорго); у Somers и др., Bio/Technology 10: 1589-1594 (декабрь 1992 г.) (овес); у Torbet и др., Plant Cell Reports 14: 635-640 (1995) (овес); у Weckes и др., Plant Physiol, 102: 1077-1084 (1993) (пшеница); у Chang и др., WO 94/13822 (пшеница); у Nehra и др., The Plant Journal 5: 285-297 (1994) (пшеница).

Один из особенно предпочтительных методов интродукции рекомбинантных молекул ДНК в сахарную свеклу с помощью опосредованной Agrobacterium трансформации можно найти у Konwar, J. Plant Biochem. & Biotech. 3: 37-41, 1994.

В любых методах трансформации, основанных на непосредственном переносе гена, на технологии бомбардировки частицами или на опосредованном Agrobacterium переносе, целесообразно, но необязательно, использовать маркеры для селекции или для скрининга, которые позволяют осуществлять отбор по признаку устойчивости к антибиотикам (например, к канамицину, гигромицину или метотрексату) или гербицидам (например, фосфинотрицину). Однако выбор маркера для селекции или для скрининга не имеет решающего значения для практической реализации изобретения. Примерами являются ген nptII, который обусловливает устойчивость к канамицину и родственным антибиотикам (Vieira и Messing, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan и др., Nature 304: 184-187 (1983)), ген bar, который обусловливает устойчивость к гербициду фосфинотрицину (White и др., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spencer и др., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), ген hph, который обусловливает устойчивость к антибиотику гигромицину (Blochinger и Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), и ген dhfr, который обусловливает устойчивость к метотрексату (Bourouis и др., ЕМВО J. 2: 1099-1104 (1983)). Для трансформации могут использоваться одни и те же виды или различные виды ДНК (т.е. котрансформация), и обе эти методики пригодны для применения, например, с последовательностями, кодирующими ИП.

В других (одном) вариантах осуществления настоящего изобретения описанный выше слитый протеин включает

(а) первый протеин или домен протеина с антипатогенной активностью,

(б) пептидый линкер,

(в) второй протеин или домен протеина с антипатогенной активностью и

(г) необязательно один или большее количество протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью, слитых с одним либо с одним или несколькими пептидным линкерами,

и конструкции ДНК, кодирующие эти протеины, которые могут применяться для повышения устойчивости или толерантности к патогену растения и его потомков, к которым относят полученное половым или вегетативным путем следующее поколение, включающее потомство растений, но не ограниченное им.

Патогены, такие как нематоды, наносят экономический ущерб большинству известных в мире культурных растений. К ним относятся сельскохозяйственные культуры умеренного климата, такие как картофель, сахарная свекла, овощные культуры (включая томаты, огурцы, капусту, цветную капусту, сельдерей, салат, морковь, свекловичные культуры, пастернак, нут и чечевицу), масличные культуры, зернобобовые культуры, кукуруза, пшеница, ячмень, овес, рожь и другие злаковые, пастбищные и кормовые культуры (включая широкий диапазон травянистых культур, красный и белый клевер и люцерну), лесные деревья, листопадные и орехоплодные деревья, ягодные культуры и виноградники, включая культурный виноград, декоративные и луковичные культуры, чесночные, луковые и культуры закрытого грунта.

К таким растениям относятся также субтропические и тропические культуры, такие как рис и другие злаковые (включая пшеницу, ячмень, кукурузу, овсы, сорго и просо), корневые и клубнеплоды (включая картофель, батат, маниок съедобный, яме, таро), съедобные бобовые растения, овощные культуры (включая томаты, огурцы, огурец вестиндский, канталупу и другие виды дынь, арбуз, капусту, цветную капусту, перец стручковый, баклажан, чеснок, луки, сельдерей, тыквы, парниковые и бутылочные тыквы, салат, нут и чечевицу), арахис, цитрусовые, субтропические и тропические плодовые деревья, кокосовая и другие пальмы, кофе, какао, чай, банановые, съедобный банан и банан текстильный, сахарный тростник, табак, ананас, хлопчатник и другие тропические волокнистые культуры, а также широкий спектр пряностей.

Эти двудольные или однодольные растения, трансгенно экспрессирующие слитые протеины по настоящему изобретению, а также потомство этих растений и их семенной материал, являются еще одним предпочтительным объектом настоящего изобретения. Еще одним объектом является поступающий в продажу пакет, включающий семенной материал указанных растений. Предпочтительным является поступающий в продажу пакет, к которому прилагаются инструкции по применению входящего в него семенного материала.

Генетические признаки, сконструированные в описанных выше трансгенных растениях, передаются с помощью полового размножения или вегетативного роста и, таким образом, могут сохраняться и передаваться по наследству потомству растений. Обычно указанное сохранение и передачу потомству осуществляют с использованием известных сельскохозяйственных методов, разработанных для этих конкретных целей, таких как обработка почвы, посев или сбор урожая. Также могут применяться специализированные способы, такие как гидропоника или выращивание в закрытом грунте. Поскольку выращиваемые культурные растения подвержены нападению и повреждениям, которые вызываются насекомыми или инфекциями, а также подвержены конкуренции со стороны сорных растений, для улучшения урожая проводят мероприятия по борьбе с сорняками, болезнями растений, насекомыми, нематодами и другими вредными факторами. К ним относятся механические способы, такие как обработка почвы или удаление сорняков и зараженных растений, а также применение средств защиты растений, таких как гербициды, фунгициды, гаметоциды, нематоциды, регуляторы роста, агенты, способствующие созреванию, и инсектициды.

Кроме того, преимущества генетических признаков трансгенных растений и семян по изобретению могут быть использованы при селекции растений с целью выведения растений с улучшенными свойствами, такими как толерантность к вредителям, гербицидам или стрессу, с улучшенной питательной ценностью, повышенной урожайностью или улучшенным строением, способствующим уменьшению потерь от полегания или осыпания. Для различных стадий селекции характерно целенаправленное вмешательство человека, такое как отбор линий, подлежащих скрещиванию, непосредственное опыление родительских линий или отбор соответствующего потомства растений.

В зависимости от требуемых свойств выбирают различные методы селекции. Соответствующие методы хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваясь только ими, гибридизацию, инбридинг, возвратное скрещивание, многолинейное скрещивание, смешивание сортов, межвидовую гибридизацию, методы анэуплодии и т.д. Методы гибридизации также включают стерилизацию растений с целью получения растений с мужской или женской стерильностью с помощью механических, химических или биохимических способов. Перекрестное опыление растения с мужской стерильностью пыльцой различных линий гарантирует, что геном растения с мужской стерильностью, но обладающего женской фертильностью будет постоянно приобретать свойства обеих родительских линий. Таким образом, трансгенные семена и растения по настоящему изобретению могут применяться для селекции улучшенных линий растений, что, например, позволяет увеличить эффективность обычных методов, таких как обработка гербицидом или пестицидом, или дает возможность отказаться от этих методов благодаря модифицированным генетическим признакам этих растений. В альтернативном варианте могут быть получены новые культурные растения с улучшенной толерантностью к стрессу благодаря оптимизации генетического "аппарата", что позволяет получить урожай продуктов лучшего качества по сравнению с продуктами, полученными от растений, которые не обладают способностью сопротивляться аналогичным вредным условиям в процессе их развития.

При производстве семян качество прорастания и однородность семян являются важными характеристиками продукта, в то время как качество прорастания и однородность семян, собираемых и продаваемых фермером, не являются важными. Поскольку трудно выращивать культурное растение вне контакта с семенами другого культурного и сорного растения, для борьбы с передающимися с семенами болезнями и для получения семян с хорошим прорастанием производителями, занимающимися выращиванием, кондиционированием и продажей чистых семян, разработаны довольно обширные и целенаправленные способы производства семян. Так, обычно фермер практикует покупку сертифицированного семенного материала, удовлетворяющего определенным стандартам качества, а не использует семенной материал, полученный от его собственной культуры. На материал, который используют в качестве семенного, обычно наносят защитное покрытие, включающее гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскициды или их смеси. Обычно применяемые защитные покрытия включают такие соединения, как каптан, карбоксин, тирам (TMTD®), металаксил (Apron®) и пиримифосметил (Actellic®). При необходимости эти соединения изготавливают в виде препаративной формы вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению адьювантами, обычно применяемыми в технологии изготовления препаративных форм и предназначенными для защиты от повреждения, вызванного бактериями, грибами или вредителями, относящимися к царству-животных. Защитные покрытия могут быть нанесены путем пропитывания материала для размножения жидкой композицией или путем нанесения покрытия из объединенной влажной или сухой композиции. Также возможны другие способы нанесения, такие как обработка почек или плодов.

Еще одним объектом изобретения являются новые сельскохозяйственные методы, такие как описанные выше, для которых характерно применение трансгенных растений, трансгенного растительного материала или трансгенного семенного материала по настоящему изобретению; эти методы описаны более подробно в приведенных ниже примерах, которые не ограничивают объем изобретения.

В этих примерах получение нуклеиновых кислот, манипулирование с ними и их анализ осуществляют согласно стандартным методикам, описанным у Sambrook и др. в "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2-е изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, США (1989).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение кассет экспрессии, содержащих два ингибитора

Слитые протеины, содержащие кодирующие области как Oc-IΔD86, так и CpTI, разделенные последовательностью линкера, получают с помощью двухстадийной ПЦР. Кодирующую область Oc-IΔD86 получают с помощью ПЦР-амплификации известной конструкции (Urwin и др., Plant J. 8: 121-131, 1995), используя олигонуклеотидный праймер PI (5'-ATGTCGAGCGACGGACGGCCGGTGCTTGGC-3; SEQ ID NО:3), соответствующий 5'-концу кодирующей области, и второй праймер Р2 (5'-GATCTTCGCCGGACCGACGCCAAGAATCACGGCATTTGCACTGGCATC-3'; SEQ ID NО:4), комплементарный 3'-концу кодирующей области Oc-IAD86 и подчеркнутой 5'-области расщепляемой протеазами последовательности линкера, получаемой из растительной металлотионеинподобной последовательности гена PsMTa (Evans и др., FEBS 262: 29-32, 1990). Аналогично этому ген CpTI бинарного вектора pROK/CpTI+5, содержащий кДНК CpTI под контролем промотора 35S CaMV (Hilder и др., Nature 330: 160-163, 1987), амплифицируют, используя праймер Р3 (5'-GTCGGTCCGGCGAAGATCCAGTTTGAAGGTAGTAATCATCATGATGAC-3'; SEQ ID NО:5), который создан для кодирования подчеркнутой 3'-области расщепляемой протеазами последовательности линкера PsMTa и 5'-конца кодирующей области CpTI, вместе с праймером Р4 (5'- TTCTTACTCATCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3'; SEQ ID N0:6), комплементарным 3'-концу кодирующей области CpTI.

Амплифицированные последовательности Ос-IΔD86 и CpTI содержат комплементарную область длиной 18 пар оснований на их 3'- и 5'-концах соответственно, и их соединяют с помощью метода ПЦР SOEing (Но и др., Gene 77: 51-59, 1989, и Horton и др., Gene 77: 61-68, 1989), используя праймеры Р1 и Р4. Это приводит к тому, что Ос-IΔD86 и CpTI разделяются в результате расщепления линкера, имеющего аминокислотную последовательность VIL↑GVGPA↑KIQ↑FEG, где стрелками обозначены предполагаемые сайты расщепления (слитый протеин Ос-IΔD86\PsMTa\CpTI).

Аналогичный способ применяют для получения фрагмента ДНК, кодирующего Oc-IΔD86 и CpTI со встроенным нерасщепляемым линкером (слитый протеин Oc-IΔD86\go\CpTI), полученным из последовательности гена галактозооксидазы (McPherson и др., 1992) с помощью, с одной стороны, пары праймеров, включающей вышеуказанный праймер Р1 и праймер Р5 (5'-CTGGGGGGCTGTGTAAGAACTAGCTTGGGCATTTGCACTGGCATC-3'; SEQ ID N0:7), а с другой стороны, с помощью пары праймеров, включающей праймер Р6 (5'-AGTTCTTACACAGCCCCCCAGCCTGGTAGTAATCATCATGATGAC-3'; SEQ ID N0:8) и указанный выше праймер Р4 (последовательность, кодирующая линкер, подчеркнута). Эта нерасщепляемая линкерная последовательность кодирует пептид, имеющий последовательность QASSYTAPQPQ.

Амплифицированные слитые конструкции сначала клонируют в векторе PCRII (фирма Invitrogen, Леек, Нидерланды), а затем с целью секвенирования и исследования экспрессии встраивают в сайт Smal вектора экспрессии pQE32 (фирма Qiagen). Затем их переносят из вектора pQE32 в виде PstI (дефосфорилированные с помощью полимеразы Т4 концы)/BamHI-фрагмента для замещения гена GUS вектора рВН21 (фирма Clontech Laboratories Inc.) после расщепления с помощью SstI (дефосфорилированные с помощью полимеразы Т4 концы)/BamHI. Слитые последовательности находятся под контролем промотора 35S CaMV вектора рВI121.

Пример 2: Получение кассет экспрессии, содержащих один ингибитор

Последовательность, кодирующую зрелый ингибитор трипсина вигны китайской (CpTI), амплифицируют из плазмиды pUSSR (Hilder и др., Nature 220: 160-163, 1987) с помощью полимеразной цепной реакции, используя олигонуклеотидные праймеры, сконструированные на основе опубликованной последовательности, но с добавлением сайтов, распознаваемых рестриктазами (подчеркнуты), с целью облегчения клонирования в векторе экспрессии. Применяют следующие праймеры:

5' -ACTATGGATCCAGTAATCATCATGATGACTC-3' (SEQ ID N0:9) и

5' -ATATTAAGCTTTTCTTACTCATCATCTTC-3^> (SEQ ID N0:10).

Продукт длиной 246 пар оснований непосредственно клонируют в экспрессионном векторе pQ30 (с помощью системы "QIAexpression", фирма Qiagen), используя встроенные в праймеры сайты BamHI и HindIII.

Последовательность, кодирующую Ос-I, амплифицируют из геномной ДНК Oryza sativa L. japonica с помощью полимеразной цепной реакции, используя праймеры Р7 (5'-ACATGTCGAATTCTTAGGCATTTGCACTGGC-3'; SEQ ID NO:15) и Р8 (5'-GAGGAGCCCGGGTCGAGCGACGGA-3'; SEQ ID NO:16). Интрон выделяют из гена с помощью метода ПЦР SOEing (Но и др., см. выше), причем для амплификации двух экзонов используют пары праймеров Р7/Р9 (5'-CTCGAACTCTAGAAGAGAATTGGCCTTGTTGTG-3'; SEQ ID NO:17) и Р8/Р10 (5'-AATTCTCTTCTAGAGTTC-3'; SEQ ID NO:18). Затем эти продукты соединяют вместе методом SOEn путем амплификации с помощью праймеров Р7 и Р8 и продукт клонируют в векторе Bluescipt, расщепленном с помощью SmaI/EcoRI. Затем сконструированный ген Ос-I клонируют в векторе экспрессии pQE типа IV (фирма Qiagen), используя сайты BamHI/HindIII.

Для получения замены одного кодона в гене Ос-I применяют метод "Unique Site Elimination" (фирма Pharmacia) с использованием праймера Р11 (5'-AAACCATGGATGTTCAAGGAGCTC-3'; SEQ ID N0:19).

Пример 3: Трансформация растений

Полученные из рВ1 плазмиды интродуцируют в компетентный штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 путем электропорации по методу, описанному у Shen и Forde, Nucleic Acids Res. 17: 83-85, 1989. Затем их интродуцируют в экотип Arabidopsis thaliana C24 путем опосредованной А. tumefaciens трансформации корней по методу, описанному у Clarke и др. Plant Mol. Biol. Rep. 10: 178-189, 1992. Собирают семена Т1 с отдельных растений с использованием метода Aracons of Beta-Tech, Гент, Бельгия, с целью гарантировать самоопыление. В этом исследовании также используют растения Arabidopsis, несущие конструкцию 35S/Oc-IΔD86 (Urwin и др., The Plant Journal 12: 455-461, 1997).

Пример 4: Экспрессия в Е. coli

Экспрессию созданных конструкций с одним или двумя эффекторами проводят по методу, описанному у Urwin и др., Plant J. 8: 121-131, 1995. Протеины экспрессируют в виде слитых протеинов, которые содержат 6xHis N-концов, кодируемых в векторах pQ30 и PQE32 соответственно, и очищают с помощью никельсодержащей смолы с исключением CpTI, выделяемого из слитого протеина Oc-IΔD86\PsMTa\CpTI. В последнем случае неочищенный гомогенат анализируют после удаления Oc-IΔD86, используя 6-His-Metky. Из значений, полученных для этих образцов CpTI, вычитают уровни ингибирования неочищенного гомогената нетрансформированного штамма Е. coli. Ос-IΔD86 определяют с помощью поликлонального антитела, описанного у Urwin с соавторами (Urwin и др., см. выше), а CpTI с помощью моноклонального антитела, описанного у Liddell и Сгуег в "A practical guide to monoclonal antibodies", John Wiley and Sons, New York, США, стр. 188, 1991.

В методах по оценке ингибирования цистеин- и серинпротеиназы применяют папаин и трипсин соответственно, используя в основном методику, описанную у Abrahamson и др., J. Biol. Chem. 262: 9688-9694, 1987, и применяя в качестве субстрата К-Сbz-Рhе-Аrg-7-амидо-4-метилкумарин. Флуоресценцию измеряют с помощью спектрофлуориметра Perkin Elmer SL50B, оснащенного планшет-ридером.

Пример 5: Определение экспрессии и поглощения нематодами

Экспрессируемые в Е. coli протеины очищают с помощью системы типа QIAexpress (Qiagen, Гильден, Германия) по способу, описанному Urwin и др., 1995, Urwin и др., Plant J. 8: 121-131, 1995.

Общую фракцию протеинов Arabidopsis, пригодную для анализа с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецисульфата натрия (ПААГ-ДСН), получают путем гомогенации материала корня с помощью ступки и пестика перед растворением в буфере, содержащем 0,15М NaCl, 10 мМ HEPES и 10 мМ ЭДТК, рН 7,4. Образцы протеина солюбилизируют перед электрофорезом кипячением в применяемом для ПААГ-ДСН буфере для загрузки (15% β-меркаптоэтанола, 15% ДСН, 1,5% бромфенолового синего, 50% глицерина). Экспрессию PI анализируют методом Вестерн-блоттинга по способу, описанному у Urwin с соавторами (The Plant Journal 12, 455-461, 1997), используя антитело, конъюгированное с пероксидазой из хрена, с целью облегчения применения системы хемолюминисценции на основе пероксидазы из хрена (HRPL), которую применяют согласно инструкциям производителя (National Diagnostics, Атланта, шт. Джорждия). Растворимую фракцию протеина собирают путем экстракции измельченного растительного материала в буфере (0,15 М NaCl, 10 мМ HEPES и 10 мМ ЭДТК, рН 7,4). Нерастворимый материал центрифугируют при 75000 об/мин в течение 15 мин (центрифуга типа Beckman Optima, ротор типа TLA100.2) для отделения растворимого (цитозоль) и нерастворимого материала. Дебрис интенсивно ресуспендируют в 100 мМ карбонате натрия, рН 11, центрифугируют, как описано выше, и собирают надосадочную жидкость, содержащую связанные с мембраной протеины. Дебрис промывают в указанном карбонатном буфере и ресуспендируют в используемом для ПААГ-ДСН буфере для загрузки. До проведения электрофореза все образцы кипятят в буфере для загрузки, используемом для ПААГ-ДСН.

Анализ методом Вестерн-блоттинга также применяют с целью продемонстрировать поглощение ингибиторов нематодами при питании на трансгенных растениях. Питающихся женских особей собирают вручную с корней Arabidopsis, что позволяет гарантировать отсутствие загрязнения растительным материалом. Примерно 70 нематод собирают с растений, экспрессирующих один или два ИП. Нематоды измельчают в микроцентрифужной пробирке и ресуспендируют в буфере, содержащем 0,15М NaCl, 10 мМ HEPES и 10 мМ ЭДТК, рН 7,4, а также содержащем смесь имеющихся в продаже ингибиторов протеаз (фирма Boehringer Mannheim, Льюис, Великобритания).

Образцы кипятят в используемом для ПААГ-ДСН буфере для загрузки и проводят анализ методом Вестерн- блоттинга, как описано выше.

Индуцированные CpTI и Oc-IΔD86 антитела реагируют с полосами протеинов с правильным значением М_r в гомогентах Arabidopsis, экспрессирующих отдельные конструкции ИП. Никакие антитела не дают заметную перекрестную реакцию ни с неродственным ИП в гомогенатах растений, ни с другими протеинами, присутствующими в образце. Как в Е. coli, так и в гомогенатах корней Arabidopsis конструкция Oc-IΔD86\go\CpTI позволяет получить основной продукт с молекулярной массой 23 кДа, который распознается обоими антителами и, следовательно, содержит оба ИП. Более слабый сигнал, соответствующий индивидуальному ИП с меньшей молекулярной массой, был обнаружен при использовании каждого из антител, что свидетельствует о низком уровне диссоциации слитого протеина. Для конструкции Oc-IΔD86\PsMTa\CpTI характерна обратная схема Вестерн-блоттинга, что свидетельствует о более высокой реактивности с продуктами, имеющими более низкие значения М_Г, чем имеющими более высокие значения М_Г. Это позволяет предположить, что расщепляемые ИП в основном находятся в этом классе. Анализ относительного ингибирования проводят с использованием продуктов Oc-IΔD86\PsMTa\CpTI и Oc-IΔD86\go\CpTI, полученных в Е. coli. Оба обеспечивают 95%-ное ингибирование активности папаина и трипсина, а это позволяет предположить, что молекула, включающая тандем ИП, ингибирует обе протеиназы и что оба ИП еще сохраняют эффективность после расщепления линкера, полученного из PsMTa.

Анализ методом Вестерн-блоттинга проводят с использованием гомогенатов корней широкого диапазона трансформированных линий. Для каждой из четырех конструкций для дальнейшего анализа выбирают одну линию. Каждая отобранная линия экспрессирует требуемый (-ые) ИП в количестве 0,4% от общего содержания протеина. Анализ поглощения ингибиторов нематодами, проведенный с использованием обоих антител, показал, что женские особи М. incognita поглощают Oc-IΔD86 и CpTI, паразитируя на растениях, экспрессирующих отдельные конструкции ИП. Кроме того, с помощью обоих антител выявлен интактный слитый протеин Oc-IΔD86\go\CpTI. Аналогично этому каждое антитело выявляло меньшие по размеру продукты, соответствующие отдельным ИП. Неожиданно никакие продукты ожидаемого размера не обнаружены в нематодах, взятых с растений, экспрессирующих конструкцию Oc-IΔD86\PsMTa\CpTI. Результаты, полученные для Н. schachtii, аналогичны таковым, полученным для М. incognita, за исключением того, что в нематодах не удалось обнаружить нерасщепленный продукт Oc-IΔD86\go\CpTI. Неудача в попытке выявить в нематодах продукты, полученные в результате экспрессии Oc-IΔD86\PsMTa\CpTI, неожиданно прдтверждает тот факт, что оба ингибитора присутствуют в растениях-хозяевах. Анализ методом Вестерн-блоттинга различных фракций растительного материала свидетельствует о том, что оба продукта Oc-IΔD86\PsMTa\CpTI представляют собой связанные с мембраной, но не интегрированные в нее протеины.

Пример 6: Заражение нематодами, восстановление почвы и ее анализ

Популяции Н. schachtii поддерживают на растениях капусты.

Четырехнедельные растения капусты заражают путем посадки растений в смесь песка и глины, зараженную яйцами Н. schachtii с плотностью 30 яиц/г. Растения капусты выращивают при 22°С и при нормальной продолжительности светового дня. Извлекают зараженную почву, применяемую для выращивания этих растений, и подсчитывают количество яиц/г. Готовят 3-кратное серийное разведение с помощью смеси 50% глины/песка, используя делитель для почвы, и полученный образец затем применяют для выращивания линии Arabidopsis С24 дикого типа. В предварительных экспериментах было установлено, что зараженность, составляющая 9 яиц/г, дает максимальное 5-кратное увеличение. Однако для последующих заражений использовали только по 5 яиц с целью гарантировать достаточный уровень заражения, но при этом предохранить растения от избыточного стресса.

Популяции М. incognita поддерживают на растениях томатов, которые выращивают при 16-часовом световом дне и температуре 24°С. Целые корневые клубеньки нарезают на мелкие кусочки и используют для получения серийного разведения с помощью смеси 50% глины/песка. Аликвотные количества серийных разведений используют для получения оптимального уровня заражения, при этом порцию "почвы" выдерживают при 10°С.

Чистый зараженный материал корня и галлы собирают, выращивая растения в смеси 50% глины/песка. Ручной сбор нематод на ранних стадиях эксперимента облегчают путем окраски корней кислым фуксином по методу, описанному у Urwin с соавторами (Urwin и др., The Plant Journal, 12: 455-461, 1997), за исключением того, что тонкие корни Arabidopsis не нуждаются в стадии очистки. Сбор галлов осуществляют, используя прибор для отмучивания Сейнхорста (Seinhorst, 1994). Плодовитость женских особей определяют путем подсчета вручную количества яиц, отложенных всеми особями и собранных с группы растений.

Зараженные растения Arabidopsis выращивают при 16-часовом световом дне и 22°С с интенсивностью облучения 6 ммолей фотонов·м^-2·с в вегетационных камерах типа Sanyo MLR3500. Цветочные горшки с растениями Arabidopsis C24 дикого типа и горшки с экспрессирующими ингибиторы растениями размещают случайным образом.

Пример 7: Модификация линкера галактозооксидазы

Аминокислотную последовательность линкерной области между доменом 1 и доменом 2 галактозооксидазы модифицируют, заменяя три кодона аминокислот AGT ТСТ ТАС, кодирующих аминокислотную последовательность SSY, на последовательность ТСТ АТС GAA GGT CGC (SEQ ID NO:20), которая кодирует аминокислотную последовательность SIEGR (SEQ ID NO:21). Первый код он просто заменяет существующий кодон Ser, а остальные 4 кодона кодируют фактор Ха сайта протеолитического расщепления. При этом использовали метод основанного на применении ПЦР мутагенеза, как это описано у Baron и др., J. Biol. Chem. 269: 25095-25105, 1994. Модифицированный ген галактозооксидазы экспрессируют в Aspergillus nidulans. Неожиданно с помощью электрофореза на полиакриламидном геле обнаружены две полосы протеинов, соответствующие по размеру домену 1 (примерно 16 кДа) и доменам 2+3 (примерно 52 кДа). Никакого протеина не обнаружено в положении, соответствующем полноразмерной галактозооксидазе. Результаты свидетельствуют о том, что модифицированный линкер галактозооксидазы чувствителен к расщеплению грибной протеиназой. Применение этого линкера или его других модификаций должно позволить растительным протеиназам образовывать в растениях многомерные молекулы.

Хотя изобретение подробно рассмотрено на примере конкретных вариантов его осуществления, для специалиста в данной области очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за объем изобретения, определяемый формулой изобретения.

Настоящее изобретение относится к генной инженерии в области защиты растений. Предложен способ повышения устойчивости или толерантности к нематодам растения и его потомства, предусматривающий интеграцию в геном этого растения гена, который кодирует слитый протеин. Далее предложена конструкция ДНК, кодирующая указанный слитый протеин, и слитый протеин, повышающий устойчивость или толерантность к нематодам растения и его потомства. Изобретение позволяет получить устойчивые к нематодам растения, способные передать данную устойчивость своему потомству. 3 с. и 10 з.п. ф-лы.

1. Способ повышения устойчивости или толерантности к нематодам растения и его потомства, предусматривающий интеграцию в геном этого растения гена, который кодирует слитый протеин, включающий (а) первый протеин или домен протеина с антипатогенной активностью, (б) пептидный линкер и (в) второй протеин или домен протеина с антипатогенной активностью, в котором, по меньшей мере, один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью обладает способностью ингибировать протеиназы.2. Способ по п.1, в котором дополнительные протеины или домены протеинов с антипатогенной активностью сливают со слитым протеином при помощи пептидных линкеров.3. Способ по п.1, в котором, по меньшей мере, один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью представляет собой ингибитор протеиназ Oc-IΔD86.4. Способ по п.3, в котором, по меньшей мере, один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью представляет собой ингибитор протеиназ СрТI.5. Способ по п.1, в котором ген функционально связывают с последовательностью промотора, обеспечивающего экспрессию предпочтительно в корнях растений.6. Способ по п.1, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность, протеолитически расщепляемую в растении.7. Способ по п.1, в котором пептидный линкер включает аминокислотную последовательность, стабильную по отношению к протеолитическому расщеплению в растении.8. Способ по п.1, в котором пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность QASSYTAPQPQ.9. Способ по п.6, в котором пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность VILGVGPAKIQFEG.10. Способ по п.6, в котором пептидный линкер имеет аминокислотную последовательность QASIEGRYTAPQPQ.11. Конструкция ДНК, обладающая способностью кодировать слитый протеин, который включает (а) первый протеин или домен протеина с антипатогенной активностью, (б) пептидный линкер и (в) второй протеин или домен протеина с антипатогенной активностью, в котором, по меньшей мере, один из протеинов или доменов протеинов с антипатогенной активностью обладает способностью ингибировать протеиназы.12. Конструкция ДНК по п.11, отличающаяся тем, что кодируемый ею слитый протеин включает дополнительные протеины или домены протеинов с антипатогенной активностью, слитые с ним при помощи пептидных линкеров.13. Слитый протеин, повышающий устойчивость к нематодам растения и его потомства, кодируемый ДНК по п.11.