СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОКЕФОРТИНА И ШТАММ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2004 года по МПК C12P17/18 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/80 

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии, и может быть использовано для получения алкалоида рокефортина, пригодного для использования в качестве биохимического реактива, а также в ветеринарии.

Рокефортин-10β-(1.1-диметил-2-пропенил)-3-(имидазол-4-илметилен)-5α, 10β, 11.11α-тетрагидро-2Н-пиразино[1^', 2^':1,5]пирроло[2,3-b]индол-]-1,4-(3Н, 6Н)- дион - вторичный метаболит (алкалоид, микотоксин) многих грибов рода Penicillium, для которого определены ярко выраженные нейротоксические, антибиотические и антипротозойные свойства.

Его продуценты широко распространены в природе и часто поражают продукты питания и корма, потребление которых может привести к отравлению. Особенно острой эта проблема является в ветеринарии, учитывая высокую чувствительность некоторых сельскохозяйственных и домашних животных к рокефортину (Schell М. М. // Veterinary Medicine. 2000. V.95. N.4. Р.283-286). Это обусловливает необходимость контроля содержания этого микотоксина в кормах. Рокефортин используется так же как хемотаксономический маркер при определении некоторых видов грибов рода Penicillium (Frisvad J.С., Filtenborg O. // Appl. Environment Microbiol. 1983. V.46. N.6. Р. 1301-1310).

Известны способы микробиологического получения алкалоида рокефортина культивированием различных грибов рода Penicillium.

Описано получение рокефортина путем культивирования микромицета Penicillium commune AUA 827 ( Wagener R.Е., Davis N.D., Diener U.I. // Appl. Environment. Microbiol. 1980. V.39. N.4. Р.882-887). Культуру выращивают в течение 7-10 суток поверхностно на среде, содержащей сахарозу (50 г/л) и дрожжевой экстракт (20 г/л) в качестве источника азота. Содержание рокефортина достигало 100 мг/л.

Количественная оценка проводилась методом тонкослойной хроматографии путем сравнения размера пятна с пятнами, содержащими известное количество вещества, величина ошибки метода может достигать 20%. Рокефортин выделяют из гомогената мицелия экстракцией хлороформом.

В этом способе кроме рокефортина гриб-продуцент синтезировал значительное количество другого метаболита - пенитрема А. Присутствие примесей этого биологически высокоактивного соединения в препаратах рокефортина крайне нежелательно при использовании последнего в качестве биохимического реактива. Кроме того, известно, что гриб Р.commune способен вызывать аллергические заболевания у человека. Внутриклеточная локализации алкалоида осложняет процедуру его выделения необходимостью разрушения мицелия.

Известен также способ получения рокефортина с помощью гриба Penicillium farinosum (=Penicillium сrustosum) ВКМ F-1746 (Дудина Л.П., Решетилова Т.А., Козловский А.Г., Ерошин В.К. //Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т.29. Вып.5. С.700-705). Продуцент выращивают глубинным способом при перемешивании и аэрации на среде Абе, содержащей (г/л): маннит - 50,0; янтарная кислота - 5,4; КН₂РО₄ - 10 MgSO₄•7Н₂О - 0,3, раствор аммиака - до рН 5,3. Длительность культивирования 5-8 суток. Предложенная авторами процедура дробной подтитровки рН среды в интервале 6-8 в процессе культивирования позволяет увеличить содержание внеклеточного рокефортина до 100 мг/л.

Основным недостатком этого метода является использование в качестве продуцента рокефортина патогенного гриба. Известно, что Р.crustosum относится к микроорганизмам III группы патогенности и вызывает пенициллиоз (СП 1.2.011-94, утв. Госкомсанэпиднадзором РФ).

Кроме того, биосинтез целевого продукта при культивирования Р.crustosum на среде Абе носит сложный характер с несколькими максимумами и минимумами. Высокая скорость изменения концентрации рокефортина при этом осложняет выбор оптимального момента выделения алкалоида и является важной причиной низкой воспроизводимости результатов ферментацией.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения рокефортина, включающий выращивание поверхностной культуры Penicillium roquefortii НРВ 111275 на жидкой среде, содержащей сахарозу (150 г/л) и дрожжевой экстракт (20 г/л) (Scott Р.М., Kennedy В.Р.С., Harwig J., Blanchfield В.J. // Appl. Environment. Microbiol. 1977. V. 33. N 2. Р.249-253). При этом происходит внутриклеточное накопление алкалоида до концентрации 100 мг/л.

Однако низкая скорость роста продуцента в предложенных условиях обуславливала большую продолжительность культивирования. Наибольшее содержание алкалоида наблюдалось на 16-20 сутки ферментации.

В случае выделения рокефортина его внутриклеточная локализация осложняет эту процедуру: необходимо механическое разрушение мицелия и многоступенчатая экстракция рокефортина с использованием двух органических растворителей - хлороформа и ацетона.

Известен продуцент рокефортина - штамм гриба Penicillium roquefortii ВКМ F-2389. (А. Г. Козловский, Т.А. Решетилова. Микробиология. 1984. Т.53, вып. 1, стр. 81-84). Однако низок уровень синтеза рокефортина, максимальное накопление требует около 10 суток культивирования.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в создании способа микробиологического получения алкалоида рокефортина с использованием нового штамма-продуцента.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в том, что существенно сокращен срок культивирования.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что используют штамм гриба Penicillium roquefortii f 39, культивируют его в условиях аэрации и перемешивании на среде, содержащей маннит, янтарную кислоту, мочевину, MgSO₄•7Н₂О, КН₂РО₄ и смесь микроэлементов в следующих количествах (г/л):
Маннит - 60,0-75,0
Янтарная кислота - 2,9-9,8
Мочевина - 2,0-5,0
MgSO₄•7Н₂О - 0,1-0,5
КН₂РО₄ - 0,5-1,5
Смесь микроэлементов - 1-5 мл/л среды
Вода - До 1 л
рН (доводит раствором NaOH) - 3,8-5,5
Выделение рокефортина осуществляют известными методами.

Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 был получен путем ультрафиолетового мутагенеза культуры Penicillium roquefortii ВКМ F-2389. Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 хранится в коллекции грибов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН.

Полученный мутантный штамм характеризовался высоким уровнем синтеза рокефортина и его долей в сумме алкалоидов (55-60% по сравнению с 15% у Р. roquefortii ВКМ F-2389). Морфологические свойства. Штамм гриба Penicillium roquefortii f39 (сусло-агар, 24С, 7 сут) образует компактные колонии 20-25 мм в диаметре с фестончатым краем, плоские, салатного цвета, растущий край белый, 1,0-2,0 мм шириной. Обратная сторона колонии телесного цвета. Культура имеет приятный грибной запах. Экссудат отсутствует. Конидиальные структуры дифференцируются относительно медленно. Кисточки типично асимметричные, несут длинные цепочки конидий. Конидиеносцы 200,0-300,0•4,5-5,0 мкм. Веточки 12,0-18,0•3,5-4,0 мкм. Метулы по 3-4 в мутовке, 10,0-12,0 • 3,5 мкм. Стеригмы 6,0-8,02,2-2,5 мкм. Конидии гладкие, шаровидные и полушаровидные, 3,5-4,0 мкм в диаметре.

Особенности развития штамма гриба Penicillium roquefortii f39 в сравнении с исходной культурой Р.roquefortii ВКМ F-2389 приведены в таблице
Кроме того, 1) пониженное содержание биомассы, 2) большое содержание внеклеточного рокефортина на единицу биомассы - до 3,5 мг/г (около 2,4 у дикого типа).

Вид Р.roquefortii не является патогенным, что указано в заключении Агентства по охране окружающей среды США (URL: http://www.ера. gov/opptintr/biotech/fra/fd008.htm).

Предлагаемый штамм характеризуется высокой активностью образования рокефортина притом, что выделение основного количества метаболита происходит в среду.

Биосинтез рокефортина культурой Р.roquefortii f 39 стимулируется описанным выше составом среды.

Маннит в сочетании с янтарной кислотой обеспечивает возможность глубинной ферментации и накопления целевого продукта в среде, а не в мицелии.

Введение в среду мочевины стимулирует и стабилизирует биосинтез рокефортина, т. к. позволяет избежать неоднократно описанных резких и непредсказуемых изменений концентрации рокефортина в процессе роста продуцента на среде Абе. Упрощается контроль ферментации и обеспечивается высокая воспроизводимость результатов.

Гидроксид натрия вводят в среду в процессе ее приготовления для нейтрализации янтарной кислоты и создания необходимого рН.

Микроэлементы вводят в среду в виде смеси, описанной в кн. "Методы общей бактериологии". Под ред. Ф. Герхардта и др. Т.1. 1983. М.: Мир, 347 с. Эта смесь имеет следующий состав, г:
ЭДТА - 50
ZnSO₄•7H₂O - 22
CaCl₂ - 5,54
MnCl₂•4H₂O - 5,06
FeSO₄•7H₂O - 4,99
(NH₄)₆Mo₇O₂₄•4H₂O - 1,1
CUSO₄•5H₂O - 1,57
CоCl₂•6H₂O - 1,61
Дистилированная вода - 1000 мл
Доводят рН до 6,0 с помощью КОН.

Осуществление способа иллюстрируется приведенными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Выращивают штамм Penicillium roquefortii f39 в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде следующего состава (г/л): маннит - 65,0; янтарная кислота - 5,4; мочевина - 3,0; MgSO₄• 7Н₂О - 0,3; КН₂РО₄ - 1,0; смесь микроэлементов - 2 мл/л; 10%-ный раствор NaOH - до рН 4,5; вода дистиллированная.

Объем среды в ферментере составляет 6,0 л. Культивирование проводят при перемешивании, температуре 22-35С, аэрации 30-40% от насыщения, в течение 7 сут.

Для определения концентрации рокефортина культуральную жидкость фильтруют, фильтрат дважды экстрагируют равными объемами хлороформа. Хлороформный экстракт обезвоживают, концентрируют в вакууме и анализируют методом ВЭЖХ. К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 68 мг/л.

Пример 2. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание маннита в среде - 60 г/л, янтарной кислоты - 5,2 г/л, рН среды - 5,2. Объем среды в ферментере составляет 7,0 л.

Культивирование проводят при температуре 22-24^oС, аэрации 30-40% от насыщения в течение 8 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 52 мг/л.

Пример 3. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ -2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание мочевины в среде - 5,0 г/л, рН среды - 4,0; MgSO₄•7Н₂О - 0,15; КН₂РО₄ - 1,5 г/л. Культивирование проводят при 25-28^oС, аэрации 40-50% от насыщения в течение 7 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 72 мг/л.

Пример 4. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ -2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание жирной кислоты - 2,9 г/л, мочевины в среде - 2,0 г/л; рН среды - 5,0. MgSO₄•7Н₂О - 0,3; КН₂РО₄ - 0,5 г/л. Культивирование проводят при 25-28^oС, аэрации 40-50% от насыщения в течение 7 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 55 мг/л.

Пример 5. Штамм Р.roquefortii f39 выращивают в ферментере АНКУМ-2 объемом 10 л на среде, указанной в примере 1, но содержание мочевины в среде - 3,5 г/л, рН среды - 4,5. MgSO₄•7Н₂О - 0,2; КН₂РО₄ - 0,8 г/л. Культивирование проводят при 25-28^oС, аэрации 40-50% от насыщения в течение 7 сут.

К концу ферментации содержание рокефортина в культуральной жидкости составляет 68 мг/л.

Таким образом, способ позволяет существенно сократить длительность процесса до 6-8 суток при высоком содержании целевого продукта (около 70 мг/л).

Предлагаемый способ отличается высокой степенью воспроизводимости, в нем используют непатогенный штамм, что важно для безопасности персонала.

Кроме того, обеспечивается стабильный уровень содержания рокефортина, без подтитровки рН среды. Целевой продукт накапливается в среде, что не требует разрушения мицелия и соответственно упрощает последующую стадию выделения.

Изобретение относится к области биотехнологии и микробиологии. Предложен новый штамм Penicillium roquefortii f39, который был получен путем ультрафиолетового мутагенеза культуры Penicillium roquefortii ВКМ F-2389. Полученный штамм характеризуется высоким уровнем синтеза рокефортина и его долей в сумме алкалоидов. Также предложен способ получения рокефортина, предусматривающий культивирования штамма Penicillium roquefortii f39 в условиях аэрации и перемешивания на среде, содержащей маннит, янтарную кислоту, мочевину, MgSO₄•7H₂O, КН₂PO₄ и смесь микроэлементов. Предложенный способ получения рокефортина с использованием нового штамма Penicillium roquefortii f39 позволяет существенно сократить срок культивирования и повысить выход целевого продукта. Предложенные изобретения могут быть использованы в ветеринарии, для получения алкалоида рокефортина, используемого в качестве биохимического реактива. 2 с.п.ф-лы.

1. Способ получения рокефортина, включающий культивирование гриба вида Penicillium roquefortii на среде, содержащей источники углерода и азота, и выделение известными методами, отличающийся тем, что из грибов вида Penicillium roquefortii используют штамм Penicillium roquefortii f39, культивируют его в условиях аэрации и перемешивания на среде, содержащей маннит, янтарную кислоту, мочевину, MgSO₄ × 7H₂O, КН₂РO₄ и смесь микроэлементов в следующих количествах, г/л:

Маннит 60,0-75,0

Янтарная кислота 2,9-9,8

Мочевина 2,0-5,0

MgSO₄ × 7H₂O 0,1-0,5

КН₂РO₄ 0,5-1,5

Смесь микроэлементов, мл/л среды 1-5

Вода, л До 1 л

рН (доводят раствором NaOH) 3,8-5,5