ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA ETHANOLICA - ПРОДУЦЕНТ БИОМАССЫ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/16 C12N1/16 C12R1/72 

Изобретение относится к области биотехнологических производств и представляет новый штамм дрожжей, используемый для производства биомассы путем его выращивания на питательных средах, содержащих в качестве источника углерода этанол или этанолсодержащие субстраты.

Эффективность производства дрожжевой биомассы определяется прежде всего активностью культивируемого штамма-продуцента: высокой скоростью его роста и высоким выходом по субстрату.

Производственно-ценным признаком штамма является его термотолерантность и способность развиваться, обеспечивая требуемое качество получаемой биомассы без снижения продуктивности при изменении в широком интервале температуры выращивания, так как в промышленных условиях часто имеют место колебания показателей процесса по этому параметру, обычно приводящие к снижению активности производственной культуры.

Указанные признаки, наряду с конкурентоспособностью по отношению к дрожжам других видов при нестерильном производстве, а также санитарно-гигиенические свойства штамма /апатогенность величина ПДК и др./, определяют целесообразность его использования в промышленности.

Для производства биомассы на средах с этанолом и этанолсодержащими субстратами используются различные штаммы дрожжей рода Candida /1,2/.

Задача состояла в селекции штамма дрожжей, характеризующегося расширением диапазона температуры выращивания без снижения показателей продуктивности и содержания истинного белка в биомассе, а также повышения конкурентоспособности при условиях производства. Технический результат, который может быть получен при использовании данного штамма, заключается в возможности ведения процесса ферментации в широком интервале температур при увеличении производительности процесса и обеспечении доминирования продуцента, а также расширения фонда этанолассимилирующих культур продуцентов биомассы. Заявляемый Штамм ВКМ У-2752 выделен из популяции производственной культуры опытно-промышленной установки Башкирского БХК. В качестве определителя, на основании которого штамм был идентифицирован, использован Barnett Y.A. Payhe R.W. Jarrow D. Jeests. Characteristics and identification, Cambridge University Press,125,1983.

Штамм хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов под номером ВКМ У-2752.

Морфологические признаки:
клетки в жидкой глюкозо-пептонной среде на 3-и сутки овальные, встречаются удлиненные /3-4/х/7-15/мм, одиночные, в коротких цепочках;
псевдомицелий через 7-6 суток /культура на стекле на морфологическом агаре/ хорошо развитый, древовидноветвящийся;
штрих /через 3 недели/ на сусло-агаре гладкий, блестящий край лопастной, цвет кремовый;
колонии на сусло-агаре через 3-е суток слабовыпуклые, гладкие, блестящие, край ровный, центр слегка приподнят, окраска серовато-белая;
аскоспор, баллистоспор, телестоспор не образует.

Физиологические признаки.

Ассимилирует: Д-глюкозу,этанол, глицерин /медленно/, молочную, янтарную, лимонную /слабо /, глюконовую /cлабо / кислоты.

Не ассимилирует: Д-галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффиназу,мелицитозу инулин, крахмал, Д-ксилозу, L-арабинозу,D-арабинозу,Д-рибозу, L-рамнозу, эритрит, аденит, дульцит, Д-маннит, сорбит, -метил-глюкозид, инозит, ксилит, арабит, глюкуроновую кислоту, метанол.

Сбраживает глюкозу /медленно /. Не сбраживает галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, мелибиозу, трегалозу.

Рост на углеводородах отсутствует.

Растет на среде без витаминов при максимальной температуре 43^oС.

Наиболее активный рост наблюдается в интервале температуры культивирования 30-42^oС. Максимальная скорость роста при разных режимах культивирования достигала 0,25-0,63 ч^-1, максимальный выход биомассы / 97%/, содержащий 45% истинного белка, обеспечивается при температуре среды 39^oС и скорости разбавления 0,45 ч^-1. Отмечено практически полное отсутствие цианидрезистентности.

Штамм непатогенен и конкурентоспособен.

Заявляемый штамм Candida ethanolica ВКМ У-2752 по сравнению с выбранным прототипом относится к другому виду дрожжей Candida и отличается рядом признаков.

Морфологические отличия.

Клетки более крупные /3-4/x/7-15/ мкм, чем у дрожжей С, valida (2,0-6,2)х(3,0-2,0)мкм. Колонии слабо выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, центр слегка приподнят, окраска cеровато-белая в отличие oт известного штамма, имеющего плоские, бархатистые или слабоопущенные, или гладкие с ровным краем, либо-неправильной формы, беловато-серые.

Отличие по физиологическим и технологическим признакам.

Заявляемый штамм характеризуется большей степенью термотолерантности, имеет более широкий интервал температуры культивирования-30-43^oC. Максимальная скорость роста /0,63 ч^-1/ превосходит на 20% скорость роста штамма прототипа, при этом последний уступает заявляемому штамму дрожжей по максимально достигнутому выходу на 7% что определяет преимущества нового штамма по продуктивности.

Отсутствие альтернативных путей окисления субстрата у штамма ВКМ У-2752 объявляет более высокую эффективность использования этанола.

Существенным отличием заявляемого штамма ВКМ У-2752 является также способность активно расти практически без изменения скорости роста /0,56-0,63 ч^-1/ в широком диапазоне температуры культивирования от 32 до 40^oC, что определяет большую конкурентоспособность штамма при длительном культивировании в неасептических условиях производства. Использование штамма, относящегося к виду С.ethanolica, ранее не применяемому в промышленном производстве, расширяет фонд этанолассимилирующих культур-продуцентов биомассы.

Штамм С. ethanolica ВНМ У-2752 испытан при разных условиях культивировании в режимах рН-стата, хемостата и разной плотности популяции в сравнении со штаммом прототипом и другими промышленными штаммами.

Пример 1. Периодическое культивирований этанолассимилирующего штамма С. ethanolica ВKМ У-2752 осуществляли в колбах на качалке при температуре среды от 30 до 42^oС с интервалом 2^o. Дрожжи выращивали на стандартной минеральной среде-9М, содержащей 1% /объемн. / этанола. Минеральный состав среды: NH₄H₂PO₄-10 г/л, K₂HPO₄-10 г/л, MgSO₄•7 H₂O-0,7 г/л. FeSO₄•7 H₂O-12,5 мг/л, MnSO₄•7 H₂O-12,5 мг/л, ZnSO₄•7 H₂O- -12,5 мг/л, NaCl-6,3 мг/л. Прирост биомассы /г/л АСВ/ оценивали через 24 часа от начала процесса.

Активность роста термотолерантных этанолассимилирующих штаммов ВКМ У-2752 при разной температуре в колбах на качалке приведена в табл.1.

Показана возможность культивирования штамма ВКМ У-2752 в широком интервале температуры среды при периодическом выращивании.

Пример N 2. Непрерывное культивирование штамма дрожжей C.ethanolica ВКМ У-2752 осуществляли в стерильных условиях в режиме РН-ауксостата с использованием ферментера "Анкум" при автоматическом регулировании температуры /39^oС/, рН /4,0/, растворенного кислорода /рО₂ 20% от насыщения/, подачи этанола /1,5% /, минеральной среды /г/л/: КН₂РО₄-1,5, NH₄Cl-1,0; MgSO₄•7 H₂O-0,45 и микроэлементов /мг/л/: FeSO4 FeSO₄4•6 H₂O-36; ZnSO₄•7 H₂O-18; CuSO₄•5 H₂O-7,55; MnSO₄•5 H₂O-15; COCl₂•6 H₂O-1; CaCl•2 H₂O-1. Результаты оценки максимальной скорости роста исследуем штаммо представлены в табл.2.

Пример 3. Непрерывное культивирование дрожжей С. ethanolica ВКМ У-2752 осуществляли в условиях, аналогичных примеру 2 при температурах культивирования от 30 до 44^oС с интервалом 2^oС.Характеристики максимальной удельной скорости роста штамма при разных температурах представлены в табл.3.

Подтверждена высокая степень термотолерантности штамма ВКМ У-2752 при непрерывном культивировании.

Пример N 4. Непрерывное культивирование дрожжей С.ethanolica ВKМ У-2752, осуществляли в стерильных условиях в режиме хемостата. В процессе культивирования использовали минеральную среду, аналогичную приведенной в примере 2 и содержащую 1% /объемн./ этанола. Выращивание штамма дрожжей C.ethanolica BKM У-2752 проводили при температуре 39^oС. Характеристики роста исследуемых дрожжей и качества биомассы представлены в табл.4.

Пример 5. Биомассу дрожжей С ethanolica ВКМ У-2752, полученную при культивировании в хемостатном режиме /пример 4/, анализировали на содержание аминокислот. Аминокислотный состав белка дрожжей C.ethanolica BKM У -2752 приведен в табл.5.

Показана полноценность белка дрожжей ВКМ У-2752 по составу аминокислот.

Пример 6. Периодическое культивирование термотолерантных этанолусваивающих дрожжей С. ethanolica ВКМ У-2572 проводили в ферментере "Анкум" с рабочим объемом 12 л.

Выращивание дрожжей при температуре 38±1^oC и рН 4,0+ 0,2 осуществляли на минеральной среде, содержащей мг/л: K₂SO₄-304,0; MgSO•7 H₂O-154,0; FeSO₄7 H₂O-15,6; ZnSO₄•7 H₂O-8,8; MnSO₄•5 H₂O-8,0 и Н₃PO₄-0,24 мл/л с добавлением 2,0% /объемн./ этанола.

В процессе выращивания измеряли интенсивность дыхания клеток исследуемых дрожжей амперометрическим методом с использованием полярографа Ур-7.

Для определения цианидрезистентности культур дрожжей при измерении интенсивности дыхания клеток в буферный раствор, содержащий фосфат калия/рН 6,5/ и глюкозу /1%/,добавляли в качестве ингибитора цианистокислый калий /I мкг/. Цианидрезистентность дрожжей выражали в путем сопоставления интенсивности дыхания клеток с добавлением ингибитора и без него. Результаты представлены в табл.6.

Установлено отсутствие альтернативных путей окисления этанола у штамма ВKМ У-2572, что объясняет его высокую продуктивность по сравнению с известным за счет повышения эффективности использования субстрата.

Таким образом, предлагаемое изобретение "Штамм дрожжей Сandida ethanolica MKМ У-2752- продуцент биомассы позволит повысить эффективность производства за счет расширения диапазона температуры культивирования, обеспечивающего доминирование штамма, при увеличении продуктивности по биомассе и белку. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6

Использование - микробиологическая промышленность, производство биомассы дрожжей. Сущность изобретения: термотолерантный штамм дрожжей Candida ethanolica ВКМ У-2752 D-продуцент биомассы на основе этанолсодержащего сырья, характеризуется высокой скоростью роста /0,46-0,63 час^-1 /, способностью развиваться при температуре 30-43^oС без добавления в среду дополнительных факторов роста и обеспечивать при высокой температуре культивирования снижение расходных показателей по органическому cубстрату и на охлаждение. Штамм хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМУ-27525D, непатогенен, конкурентоспособен. Штамм дрожжей С.ethanolica ВКМ У-2752 D может быть использован в биотехнологических производствах на основе этанолсодержащего сырья, а также при разработке перспективных технологий, связанных с переработкой биомассы. 6 табл.

Штамм дрожжей Candida ethanolica BKM У-2752 продуцент биомассы.