СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ КАУДАЛЬНОЙ НЕЙРОСЕКРЕТОРНОЙ СИСТЕМЫ (КНСС) ПОЗВОНОЧНЫХ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/30 A61P5/00 

Описание патента на изобретение RU2224528C2

Изобретение относится к медицине и касается способа получения биологически активных веществ, а именно пептидов КНСС [1] из сырья животного происхождения.

Известен способ получения биологически активного вещества из сырья животного происхождения, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью [2]. Он включает гомогенизацию спинного мозга, экстрагирования биологически активного вещества раствором хлорида натрия, центрифугирования водной взвеси мозга, осаждения вещества сульфатом аммония, растворения осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования и лиофильной сушки вещества.

Недостатком данного способа является получение смеси других веществ вместе с биологически активными пептидами КНСС, что при их применении в медицинской практике может вызвать нежелательные побочные эффекты. Кроме того, получение активного вещества из осадка достигалось фильтрованием, значительно удлиняющим время выделения конечного продукта.

Задача изобретения: получение биологически активных пептидов КНСС позвоночных, очищенных от других веществ.

Достигается это путем гомогенизации пояснично-крестцового отдела спинного мозга позвоночных, экстрагирования биологически активных пептидов раствором хлорида натрия, осаждением пептидов сульфатом аммония, растворением осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования в УФ-спектре и лиофильной сушке пептидов.

Способ осуществляется следующим образом: гомогенизируют пояснично-крестцовый отдел спинного мозга позвоночных и экстрагируют пептиды при 10-15oС в течение, например, 25-30 минут в 0,8-1% растворе хлорида натрия в сочетании 1:10-1:15 с добавлением ЭДТА до 0,05%. Центрифугируют взвесь мозга в течение 25-30 минут при 6000-9000 об/мин при 5-10oС, дважды осаждают сульфатом аммония при 5-10oС.

При первом 9% насыщении осаждают высокомолекулярные белки, отбрасывают их и повторным насыщением экстракта сульфатом аммония до 39-40% осаждают биологически активные пептиды, растворяют осадок в 0,85-1%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре с получением очищенных пептидов, лиофилизируют их. Выход активных пептидов составляет 250 мкг на 1 кг сырья. Полученные таким способом пептиды обладают выраженной антиандрогенной (табл. 1) и антиэстрогенной (табл.2) активностью. Они имеют молекулярную массу 1300, что подтверждено методом тонкослойной хроматографии. Пептиды разрушаются протеазами, инактивируются при кипячении или содержании их в термостате при 37oС в течение 1 часа. Они осаждаются депротеинизирующими средствами: хлоридом натрия, сернокислым аммонием, тетрауксусной кислотой.

При использовании в качестве сырья пояснично-крестцового отдела спинного мозга предлагаемые в способе параметры температуры, среды, концентрации эстрагена, его соотношение с гомогенатом мозга, скорость центрифугирования являются оптимально допустимыми. Так использование мозга на всем протяжении увеличивает долю балластных веществ, энергии, объема исходного гомогената и времени получения конечного продукта. Экстрагирование ниже 10oС ведет к возрастанию времени экстракции пептидов более 1,5 часа, а выше 15oС происходит частичная их инактивация.

Концентрация раствора хлорида натрия менее 0,8% снижает степень экстракции пептидов, их выход и увеличивает время этого процесса, а выше 1% способствует осаждению части пептидов, снижая их выход.

Соотношение эстрагена с гомогенатом мозга менее 1:10 уменьшает степень экстракции пептидов и их выход, а увеличение больше чем 1:15 не дает положительного эффекта.

Центрифугирование взвеси мозга при скорости ниже 6000 об/мин ухудшает осаждение взвешенных частиц мозга и увеличивает время этого процесса до 1 часа, а скорость более 9000 об/мин не повышает эффективность отделения взвешенных частиц мозга.

Центрифугирование при 5-10oС необходимо для сохранения активности термолабильных пептидов. Снижение температуры менее 5oС удлиняет время осаждения взвешенных частиц до 1 часа, выше 10oС - приводит к снижению активности пептидов.

Пример 1. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного на протяжении пояснично-крестцового отдела, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 10 частями 0,8% раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 10oС в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь мозга в течение 25 мин на рефрижераторной центрифуге при 10oС со скоростью 9000 об/мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 15oС. Первым 9% насыщением сульфата аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют центрифугированием при 6000 об/мин на рефрижераторной центрифуге при 10oC в течение 20 мин и отбрасывают. Надосадочную жидкость вновь насыщают до 39% сульфатом аммония, осаждая биологически активные пептиды КНСС. Осадок получают путем центрифугирования при 10oС на рефрижераторной центрифуге в течение 30 мин со скоростью 9000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах от 220 до 280 нм и лиофилизуют чистые пептиды. Выход активного вещества составляет 25 мкг, т.е. 250 мкг на 1 кг сырья.

Пример 2. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного на протяжении пояснично-крестцового отдела, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 0,9%-ного раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 12oС в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь мозга в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге при 5oС со скоростью 8000 об/мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 15oС. Первым 10% насыщением сульфата аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют центрифугированием при 6000 об/мин на рефрижераторной центрифуге в течение 25 мин и отбрасывают. Вторым - 40% насыщением сульфатом аммония осаждают биологически активные пептиды КНСС. Осадок получают центрифугированием при 8000 об/мин при 7oС на рефрижераторной центрифуге в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Полученный осадок растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах от 230 до 280 нм и лиофилизуют чистые пептиды. Выход активного вещества составляет 25 мкг, т.е. 250 мкг на 1 кг сырья.

Пример 3. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного на протяжении пояснично-крестцового отдела, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 1%-ного раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 15oС в течение 25 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 28 мин на рефрижераторной центрифуге при 8oС со скоростью 7000 об/мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 14oС. Первым 10% насыщением сульфата аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют центрифугированием при 7000 об/мин на рефрижераторной центрифуге в течение 30 мин и отбрасывают. Вторым 39% насыщением надосадочной жидкости сульфатом аммония осаждают биологически активные пептиды КНСС. Осадок получают центрифугированием при 9000 об/мин при 10oС в течение 25 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Полученный осадок растворяют в 0,85%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах от 250 до 280 нм и лиофилизуют чистые пептиды. Выход активных пептидов составляет 25 мкг, т.е. 250 мкг на 1 кг сырья.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить время выделения, сэкономить энергию и получить биологически активные пептиды КНСС позвоночных в высокой степени чистоты.

Источники информации
1. Бахтинов А. Инкреторная функция каудального отдела спинного мозга и его физиологическое значение // Мед. Газета - 1997. - 22 - С.7
2. Бахтинов А.П. Патент РФ 2074726 на изобретение "Способ получения биологически активного вещества, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью".

Похожие патенты RU2224528C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНДРОГЕННОЙ И АНТИЭСТРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ 1993
  • Бахтинов Анатолий Петрович
RU2074726C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПЕПТИДОВ КАУДАЛЬНОЙ НЕЙРОСЕКРЕТОРНОЙ СИСТЕМЫ (КНСС) МЛЕКОПИТАЮЩИХ 2003
  • Бахтинов Анатолий Петрович
  • Лушкина Светлана Анатольевна
RU2272650C2
ВАРИАНТ СПОСОБА ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЛЮДЕЙ, СТРАДАЮЩИХ ЭСТРОГЕНО- И АНДРОГЕНОЗАВИСИМЫМИ ОПУХОЛЯМИ 2014
  • Бахтинов Анатолий Петрович
  • Бахтинов Алексей Анатольевич
RU2597779C2
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ, СТРАДАЮЩИХ ЭСТРОГЕНО- И АНДРОГЕНОЗАВИСИМЫМИ ОПУХОЛЯМИ 1997
  • Бахтинов А.П.
RU2163812C2
СПОСОБ ПРЕКРАЩЕНИЯ ТЕЧКИ У САМОК И ОСТРО ПРОЯВЛЯЮЩЕЙСЯ ОХОТЫ У САМЦОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ЖИВОТНЫХ 2014
  • Бахтинов Анатолий Петрович
  • Бахтинов Алексей Анатольевич
RU2558921C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИНГИБИНА-А ЧЕЛОВЕКА 2009
  • Николаев Александр Аркадьевич
  • Гудинская Наталья Игоревна
RU2434018C2
Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ @ А @ ) 1990
  • Калугин Евгений Олегович
  • Щеголев Александр Семенович
  • Голованова Тамара Валерьевна
  • Абдукаюмов Мелис
SU1776415A1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА 2013
  • Мандро Николай Михайлович
  • Федоренко Татьяна Валериевна
RU2553334C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА С ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ 1993
  • Кунижев С.М.
  • Кимова Э.Т.
  • Кузьминова Т.П.
  • Курганова А.Е.
  • Воротникова Т.С.
  • Иванова Л.Н.
RU2065273C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ 2011
  • Коханов Александр Владимирович
  • Белопасов Владимир Викторович
  • Меснянкин Александр Алексеевич
  • Ямпольская Ирина Сергеевна
  • Луцева Оксана Алексеевна
RU2492868C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 224 528 C2

Реферат патента 2004 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ КАУДАЛЬНОЙ НЕЙРОСЕКРЕТОРНОЙ СИСТЕМЫ (КНСС) ПОЗВОНОЧНЫХ

Изобретение относится к медицине и касается способа получения активных веществ, а именно пептидов КНСС из сырья животного происхождения, обладающих антиандрогенной и антиэстрогенной активностью. Пояснично-крестцовый отдел спинного мозга животных гомогенизируют в растворе хлорида натрия при соотношении 1:10, 1:15, экстрагируют экстракт, дважды насыщают сульфатом аммония и поэтапно центрифугируют в течение 25-30 мин при 6000-9000 об/мин, при первом осадок отбрасывают, а при втором его растворяют в 0,8-1%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах 220-280 нм и целевой продукт лиофилизируют. Технический результат: способ экологически безвреден, нетрудоемок, экономичен, сокращает время экстрагирования и получения осадка и позволяет получить активные пептиды высокой чистоты. 2 табл.

Формула изобретения RU 2 224 528 C2

Способ получения биологически активных пептидов каудальной нейросекреторной системы позвоночных, обладающих антиандрогенной и антиэстрогенной активностью, заключающийся в том, что пояснично-крестцовый отдел спинного мозга животных гомогенизируют с 0,8-1%-ным раствором хлорида натрия при соотношении 1:10, 1:15, экстрагируют в нем в течение 25-30 мин при 10-15°С, экстракт дважды насыщают сульфатом аммония и поэтапно центрифугируют 25-30 мин при 6000-9000 об/мин, при первом осадок отбрасывают, а при втором его растворяют в 0,8-1%-ном растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют в УФ-спектре в пределах 220-280 нм и целевой продукт лиофилизируют.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2004 года RU2224528C2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНДРОГЕННОЙ И АНТИЭСТРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ 1993
  • Бахтинов Анатолий Петрович
RU2074726C1
ТЕТРАПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНОВ, ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ 1999
  • Хавинсон В.Х.
  • Морозов В.Г.
  • Малинин В.В.
  • Григорьев Е.И.
RU2155063C1
БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ИЛИ ИХ ГЕОМЕТРИЧЕСКИЕ ИЛИ ОПТИЧЕСКИЕ ИЗОМЕРЫ, ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ С ОСНОВАНИЯМИ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВАМИ АНТАГОНИСТА ЛЕЙКОТРИЕНА В*004 1992
  • Ноал Коэн[Us]
  • Фердинанд Куо-Хен Ли[Cn]
  • Киз Алан Ягалофф[Us]
RU2067973C1
СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ТВОРОЖНОГО ПРОДУКТА 2002
  • Гурова Л.А.
  • Добровольский В.Ф.
  • Квасенков О.И.
RU2213485C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕЗОДОРИРУЮЩЕГО И ОСВЕЖАЙЦЩБОЗлкртс; • ДЕЙСТВИЯ ЗУБНЫХ ГИГИЕНИЧЕСКИХ СРЕДСТВ"" 0
SU249563A1
Дорожная спиртовая кухня 1918
  • Кузнецов В.Я.
SU98A1

RU 2 224 528 C2

Авторы

Бахтинов А.П.

Бахтинов А.А.

Даты

2004-02-27Публикация

2001-07-24Подача