Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ @ А @ ) Советский патент 1992 года по МПК A61K39/12 A61K39/29 

Изобретение относится к вирусологии, медицинской биохимии и молекулярной биологии и может быть использовано в медицинской промышленности для создания высокочувствительных диагностикумов для

определения маркеров вируса гепатита В, для изготовления вакцины против гепатита В. а также в лабораторной научно-исследовательской работе.

Пригодность препаратов поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) для указанных целей определяется их чистотой, нативностью, биологической (иммунологической) активностью и иммунореактивностью.

Известны способы очистки HBsAg из плазмы и (или) сыворотки HBsAg-положи- тельных доноров, включающие фракционирование исходного материала сульфатом аммония, фракционирование этанолом по Кону, осаждение полиэтиленгликолем, кри- опреципитацию, равновесное центрифугирование, скоростное зональное центрифугирование, обработку п.ротеолити- ческими ферментами, экстракцию хлороформомилиалифатическимифторсодержащими углеводородами, хрома- тографические методы, в том числе биоспецифическую хроматографию (1-4).

Однако эти способы имеют ряд недостатков. 8 качестве исходного материала авторы используют сыворотку или плазму с высоким (не ниже 80-150 мкг/мл) содержанием HBsAg, Значительная часть методик включает обработку высокими концентрациями протеолитических ферментов или ор- ганическими растворителями, что отрицательно сказывается на нативности препаратов. Большинство методов не по- зволяют получить препараты высокой чистоты. Практически все методы не обеспечивают получение препаратов с высокой иммунореактивностью, концентрацией, а также стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препаратов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ, описанный в (5).

Он позволяет выделять HBsAg из различных биологических жидкостей, Метод включает в себя фракционирование сыворотки или плазмы HBsAg-положительных доноров сульфатом аммония, диализ HBsAg содержащей фракции против физиологического раствора хлористого натрия, два равновесных центрифугирования в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ обогащенного материала и окончательную очистку препарата осуществляют ультрацентрифугированием и гельфильтрацией.

Фракционирование исходной плазмы или сыворотки проводят двухступенчато с добавлением сульфата аммония в виде насыщенного раствора на первой ступени до (27-28%) от насыщения, а на второй - до (42,0-42,5%) от насыщения. Равновесное центрифугирование гомогенного раствора

хлористого цезия проводят последовательно дважды с начальными плотностями (1,19-1,24) г/см3 и (1,25-1.26) г/см3 соответственно.

Использование этого метода позволяет получить препарат HBsAg с химической чистотой не ниже 90%, с довольно высокой биологической (иммунологической) активностью (титр в ВИЭФ 1/256-1/512) и с иммунореактивностью 80-85%.

Препараты, полученные по прототипу, были апробированы в радиоиммунологической тест-системе на иммунореактивность по способу (6).

Основной недостаток способа заключается в том, что он не позволяет получить препарате иммунореактивностью выше 80- 85%.

Цель изобретения - повышение имму- нореактивности и чистоты препарата при выделении из сыворотки или плазмы HBsAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg.

Поставленная цель достигается тем, что в способе, включающем двухступенчатое фракционирование сыворотки HBsAg положительных доноров сульфатом аммония, диализ против хлорида натрия, два центрифугирования диализата в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием, после первого центрифугирования дополнительно проводят диализ против раствора хлорида натрия и центрифугирование при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часов, а повторный диализ проводят против раствора соляной кислоты с рН 1,9-2,3 и в полученный диализат вносят пепсин в количестве 3-15 мкг/мг белка.

Экспериментально установлено, что применение после первого равновесного центрифугирования диализа против физиологического раствора хлорида натрия и последующегодифференциальногоцентрифугирования при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часа позволяет получить дополнительную очистку целевого препарата.

Подобранное экспериментальным путем количество пепсина (3-15 мкг/мг белка) позволяет увеличить степень очистки препарата и при этом сохранить его биологическую (иммунологическую) активность.

Использование дифференциального ультрацентрифугирования позволяет сконцентрировать препарат и провести его очистку от продуктов ферментативного гидролиза.

Таким образом, двухступенчатое фракционирование исходной сыворотки или плазмы с помощью насыщенного раствора сульфата аммония, диализ против хлорида натрия, два центрифугирования диализата в градиенте плотности раствора CsCI, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием в совокупности с дополнительным проведением после первого центрифугирования диализа против раствора хлорида натрия и центрифугирования при 17000-33000 хд в течение не менее 1,5 часов, проведением повторного диализа против раствора соляной кислоты с рН 1.9- 2,3 и внесением в полученный диализат пепсина в количестве 3-15 мкг/мл белка дают возможность получить препарат HBsAg с иммунореактивностью не ниже 90% {по прототипу 80-85%), с химической чистотой не ниже 95% (не ниже 90% по прототипу) и высокой биологической (иммунологической) активностью (1/512-1/1024) по данным ВИ- ЭФ (1/256-1/512 по прототипу) с концентрацией препарата в растворе 1-2 мг/мл.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Поясняет реализацию способа со средними значениями режимов стадий. Берут 500 мл плазмы или сыворотки, содержащей HBsAg по данным ВИЭФ 1/8, добавляют 190 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и выдерживают в течение 2-3 ч при 2-10°С. По истечении заданного времени проводят центрифугирование на центрифуге G2-2I Beckman, ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 хд) при температуре 5°С 30 мин. Осадок отбрасывают, к надосадочной жидкости приливают 176 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и выдерживают в течение 2-3 ч при 2-10°С, центрифугируют на центрифуге G2-2I Beckman, ротор IA-14,12000 об/мин (22100 хд)30 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок растворяют в 200 мл дистиллированной воды, доводят объем до 500 мл дистиллированной водой, приливают 366 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают, выдерживают в течение 2-3 ч при 2-10°С и центрифугируют в тех же условиях. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в 200 мл дистиллированной воды и диализуют против 5 л 0,14 М раствора хлористого натрия при комнатной температуре (18-25°С) в течение 48 ч с четырехкратной сменой диализного раствора. Диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 Beckman. ротор IA-14, 12000 об/мин (22100 хд), при 20°С. 1 ч, осадок отбрасывают. Осветленный диализат доводят до 300 мл 0,14 М раствором хлористого натрия.

Затем в полученном растворе растворяют хлористый цезий до плотности 1,21 г/см3 и проводят центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор 70 Ti, 60000 об/мин - 275000 хд, при 20°С, 60 часов). Образовавшийся градиент плотности рас0 твора хлористого цезия разделяют на фракции объемом по 1 мл. Фракции, содержащие HBsAg по данным ВИЭФ, объединяют, диализуют против 2 л 0,14 М раствора хлористого натрия в течение 20 часов с

5 четырехкратной сменой диализного раствора. Диализат центрифугируют на центрифу- reG2-21 Beckman, ротор IA-20,18000об/мин (25300 хд), при 20°С, 2 ч, осадок отбрасывают. В надосадочную жидкость доливают ди0 стиллированную воду до 160 мл, добавляют хлористый цезий до плотности 1,26 г/см3 и проводят второе равновесное центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор 70.1 Ti, 60000 об/мин 5 260000 xg, 20°C, 60 ч). Образовавшийся градиент плотности раствора хлористого цезия разделяют на фракции объемом по 1 мл. Фракции, содержащие HBsAg в ВИЭФ объединяют и диализуют против 2 л раствора

0 соляной кислоты с рН 2,0 в течение 20 ч с четырехкратной сменой диализного раствора, диализат осветляют центрифугированием на центрифуге G2-21 Beckman, ротор IA-20, 18000 об/мин (25300 хд), 20°С, 60

5 мин. В осветленный раствор вносят протео- литический фермент (пепсин, Serva, ca 15 milli Anson units/mg) из расчета 10 мкг/мг белка в растворе, перемешивают и выдерживают при 37°С в термостате в тече0 ние 14 ч.

Проводят дифференциальное центрифугирование (центрифуга Z-8-70 Spinco, Beckman, ротор SW 55 Ti, 55000 об/мин - 290000 xg, 10°C, 150 мин). Образовавшийся

5 на дне пробирок осадок растворяют в 5 мл 0,14 М раствора хлористого натрия.

Полученный таким образом препарат HBsAg имеет следующие характеристики: объем 5 мл, концентрация белка 2,3 мг/мл,

0 химическая чистота 97%. иммунореактив- ность92%, титр в ВИЭФ 1/1024.

Пример 2. Поясняет необходимость диализа и осветления HBsAg содержащих фракций после первого равновесного цент5 рифугирования в градиенте плотности хлорида цезия.

HBsAg выделяют из 500 мл плазмы, имеющей титр в ВИЭФ 1 /4 по примеру 1 до стадии объединения фракций, содержащих HB.sAg по данным ВИЭФ после первого

равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия. При этом определяют кратность очистки полученного объединенного препарата (6). Затем проводят диализ против 2 л 0,14 М раствора хлористого натрия в течение 20 ч с четырехкратной сменой диализного раствора, после чего диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 Beckman, ротор IA-20, 18000 об/мин (25300 хд), при 20°С, 2 ч, осадок отбрасывают и определяют кратность очистки в надосадочной жидкости, Результаты приведены в табл. 1.

Табл. 2 поясняет выбор времени центрифугирования.

Пример 3. Поясняет выбор рН раствора соляней кислоты. HBsAg выделяют из 500 мл плазмы, имеющей титр HBsAg в ВИ- ЭФ 1 /8, по примеру 1 до стадии выделения и объединения HBsAg содержащих фракций после второго равновесного центрифу- гирования в градиенте плотности хлористого цезия. Для проведения диализа готовят растворы соляной кислоты с рН (1,1), (1,5), (1,9), (2,3), (2,7) и проводят диализ против этих растворов в течение 20 часов с четырехкратной сменой диализных растворов. Диализат центрифугируют на центрифуге G2-21 Beckman, ротор IA- 20, 18000 об/мин (25300 хд), 20°С, 60 мин. В осветленном растворе определяют титр HBsAg по данным ВИЭФ (табл. 3).

Пример 4. Поясняет выбор концентрации пепсина.

HBsAg выделяют из плазмы, имеющей титр HBsAg в ВИЭФ 1/4, по примеру 1, до стадии осветления после диализа против раствора соляной кислоты. Далее в осветленный раствор вносят пепсин из расчета 2, 3, 10, 15, 30, 50 мкг/мг белка в растворе, выдерживают при 37°С в термостате в течение 14 ч, после чего проводят дифференциальное центрифугирование на центрифуге Z-8-70 Splnco, Beckman, ротор SW 55 TI, 55000 об/мин (290000 хд), 10°С, 150 мин.

Для каждой концентрации пепсина определяют содержание HBsAg в осадке по данным ВИЭФ (табл. 4).

Затем для каждой концентрации пепсина определяют иммунореактивность полученного препарата HBsAg (табл. 5).

Положительный эффект - социальный - заключается в обеспечении отечественной технологии высококачественным сырьем в производстве диагностикумов для выявления вируса гепатита В. Это позволит более полно выявлять носителей HBsAg среди Д0- норов, усилить контроль за качеством препаратов крови, обеспечить проведение специфической иммунопрофилактики в

группах повышенного риска по гепатиту В. Формула изобретения Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg), включающий двухступенчатое фракционирование сыворотки HBsAg-положительных доноров сульфатом аммония, диализ против хлорида натрия, два центрифугирования диализата в градиенте плотности раствора гаяогенида щелочного металла, повторный диализ и выделение целевого продукта дифференциальным центрифугированием, отличающийся тем. что, с целью повышения иммунореактивности и чистоты антигена, после первого центрифугирования дополнительно проводят диализ против раствора хлорида натрия и центрифугирование при 17000-33000 хд в течение не менее 1,5 ч, а повторный диализ проводят против раствора соляной кислоты с рН 1,9-2,3 и в полученный диализат вносят пепсин в количестве 3-15 мкг/мг белка.

Использование: изобретение может быть использовано для создания высокочувствительных диагностикумов для определения маркеров вируса гепатита В. Цель: повышение иммунореактивности препарата, а также обеспечение стандартно воспроизводимой чистоты и биологической активности препарата при выделении из сыворотки или плазмы HBsAg положительных доноров как с высоким, так и с низким содержанием HBsAg. Сущность изобретения: сыворотку HBsAg положительных доноров фракционируют сульфатом аммония. После первого равновесного центрифугирования в градиенте плотности раствора галогенида щелочного металла проводят диализ против раствора хлорида натрия. Диализат центрифугируют при (17000-33000) хд в течение не менее 1,5 часов. После второго равновесного центрифугирования проводят диализ против соляной кислоты с рН 1,9-2,3. Диализат подвергают гидролизу пепсином в ко- личестве 3-15 мкг/мл белка и центрифугируют. Положительный эффект: изобретение позволяет обеспечить отечественную технологию высококачественным сырьем для производства диагностикумов для выявления вируса гепатита В. w Ј 1 4 О СЛ

Стадия очистки

До диализа и центрифугирования После диализа и центрифугирования

Таблица 1

Кратность очистки препарата

1 1,2

45

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5