СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ ИНГИБИНА-А ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК C07K1/36 C07K2/00 A61K35/50 A61K38/17 

Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано для получения и очистки ингибина-А.

Из практики медицины известен способ выделения и очистки белка («Способ получения антимикробного пептида ареницина», заявка №2006121111/13 от 16.06.2006; патент №2316595), заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 в питательной среде, разрушении полученных клеток, выделении телец включения, содержащих гибридный белок His8-TrxL-Ar2; очистке гибридного белка методом аффинной хроматографии, солюбилизации белка и расщеплении бромцианом в кислой среде, разделении полученных продуктов реакции, очистке целевого продукта методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Недостатком способа является низкий выход рекомбинантного пептида, составляющий 5 мг с 1 л клеточной культуры, двукратное использование хроматографии, что повышает стоимость способа.

Известен также способ получения концентрата фактора IX системы свертывания крови из патента «Концентрат фактора IX системы свертывания крови и способ его получения», заявка №2000117508/14 от 05.07.2000; патент №2163140; включающий: сорбцию фактора IX из продуктов донорской плазмы на анионообменнике ДЕАЕ - Toyopearl, промывание анионообменника, центрифугирование, фильтрацию, сорбцию на колонке с анионообменником, элюцию в ступенчатом градиенте ионной силы 200-360 ммоль Na⁺/л 0,01-0,02 М Трис-HCl буферным раствором с рН 7,0-7,5, содержащим 0,05-0,07 М глицин и 0,05-0,06 М трехзамещенный цитрат натрия, разведение стартовым буфером (рН 7,2-7,8) до концентрации белка 0,35-0,50%, стерилизующую фильтрацию.

Недостатком указанного способа является низкий выход целевого продукта и низкая воспроизводимость, что приводит к необходимости повышения затрат на получение целевого продукта.

Известен также способ получения РНП (низкомолекулярных рибонуклеопептидов) из ядер клеток из патента «Средство, стимулирующее репарирование повреждений, обладающее ткане-, органо- и стадиеспецифичностью и противовирусной активностью», заявка №2003101855/13 от 24.01.2003, патент №2238756; включающий: отмывание тканей печени крупного рогатого скота от клеток крови в физиологическом растворе, гомогенизацию при низкой температуре в течение 5 минут в растворе, содержащем 0,01 М Трис-HCl буфер рН 8,5, 0,001 М хлористого кальция, 0,001 М ЭДТА и 0,6% Тритона Х-100, центрифугирование, выделение фракции цитоплазматической РНП, промывание, суспензирование в растворе ацетата натрия, содержащего 0,02 М Трис-HCl буфера рН 5,0, 0,001 М ЭДТА и 0,5% додецилсульфата натрия, приливание смеси фенол-хлороформ (1:1), прогревание в течение 10 минут на водяной бане при температуре 40°С, охлаждение, центрифугирование при 5000 об/мин в течение 20 минут, отбирание верхней фазы, приливание 350 мл смеси фенол-хлороформ (1:1), прогревание, центрифугирование, добавление равного объема ацетатного буфера и смеси фенол-хлороформ, прогревание при температуре 50°С, охлаждение, центрифугирование, последовательное повторение этой процедуры при 60, 70 и 80°С, депротеинизацию фаз центрифугатов, приливание 2,5 объема охлажденного этанола, отделение осадка, промывание этанолом, стерилизацию фильтрацией.

Недостатком данного способа является многостадийность, низкая степень его воспроизводимости в связи с невозможностью автоматизации, что затрудняет технологический процесс и повышает стоимость целевого продукта.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ «Очистки и частичной характеристики ингибина в свиной фолликулярной жидкости», описанный в журнале «Biochemical and biophysical research communications", Vol.133, №1, 1985, November 27, 1985, 120-127, заключающийся в приготовлении экстракта из биологических тканей, последовательном осаждении белка органическими растворителями и сульфатом аммония, проведением обращенно-фазовой ВЭЖХ и гель-проникающей ЖВХ.

Недостатками прототипа являются маленькие объемы (в мкл и мкг), многостадийность, двукратное использование хроматографии, низкая степень воспроизводимости, что затрудняет технологический процесс и повышает стоимость способа.

Задачей предлагаемого изобретения является упрощение технологического процесса получения и очистки ингибина-А.

Поставленная задача решается тем, что кусочки плаценты измельчают и гомогенизируют, добавляют физиологический раствор в соотношении 1:2, к полученной массе добавляют бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляют на сутки в холодильнике при t +4°C, затем смесь центрифугируют с эфиром 1:3 в течение 10-12 минут при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно, надосадочную жидкость, содержащую ингибин, помещают в колбе в холодильник при t +4°C на сутки, затем еще раз центрифугируют и определяют общий белок в надосадочной жидкости, полученный раствор смешивают с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге в течение 45-50 мин при 10000 об/мин, полученный осадок растворяют в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8, наносят на колонку лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером, пропускают весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии, колонку промывают 1 М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером, затем элюируют связанный на колонке ингибин-А 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0, элюат диализуют и концентрируют.

Предлагаемый способ получения и очистки ингибина-А человека успешно апробирован на 63 образцах плаценты человека в практической работе кафедры общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицинской академии в течение 2009 года.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Первичный экстракт плаценты

Для приготовления экстракта кусочки плаценты измельчали и гомогенизировали, добавляя физиологический раствор в соотношении 1:2. (Общий объем 1200 мл, общий белок 31640 мг, ингибина-А 164 мг, выход 100%, степень очистки 1.)

Бутанольная фракция

К полученной массе добавляли бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляли на сутки в холодильнике (+4°С). Затем смесь центрифугировали с диэтиловым эфиром (1 часть эфира и 3 части гомогената) в течение 10 минут при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно. Надосадочную жидкость (445 мл), содержащую ингибин, помещали в колбе в холодильник (+4°С) на сутки. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок в надосадочной жидкости (7680 мг), количество ингибина-А 95 мг.

Выход 57,9%, степень очистки 2,3.

Преципитация сульфатом аммония

Полученный раствор смешивали с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугировали в рефрижераторной центрифуге в течение 45 мин при 10000 об/мин. Полученный осадок растворяли в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8. (Общий объем 115 мл, общий белок 855 мг, количество ингибина-А 73 мг, выход 44,5%, степень очистки 16,5.)

Аффинная хроматография

Эта стадия очистки ингибина-А основана на обнаруженной нами способности лектина клещевины (рицина) преципитировать ингибин-А. Представляет собой аффинную хроматографию ингибина-А на иммобилизованном лектине клещевины. Через колонку (2×14 см) лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером, пропускали весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии. Далее колонку промывали 1 М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером, а затем элюировали связанный на колонке ингибин-А 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объема 13 мл (общий белок 32 мг, количество ингибина-А 27 мг, выход 16,3%, степень очистки 138,8).

Примеры с использованием разных эфиров

Пример 1

Первичный экстракт плаценты

Для приготовления экстракта кусочки плаценты измельчали и гомогенизировали, добавляя физиологический раствор в соотношении 1:2. (Общий объем 1200 мл, общий белок 31640 мг, ингибина-А 164 мг, выход 100%, степень очистки 1.)

Бутанольная фракция

К полученной массе добавляли бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляли на сутки в холодильнике (+4°С). Затем смесь центрифугировали с дипропиловым эфиром (1 часть эфира и 3 части гомогената) в течение 10 минут при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно. Надосадочную жидкость (445 мл), содержащую ингибин, помещали в колбе в холодильник (+4°С) на сутки. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок в надосадочной жидкости (7680 мг), количество ингибина-А 95 мг.

Выход 57,9%, степень очистки 2,3.

Преципитация сульфатом аммония

Полученный раствор смешивали с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугировали в рефрижераторной центрифуге в течение 45 мин при 10000 об/мин. Полученный осадок растворяли в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8. (Общий объем 115 мл, общий белок 855 мг, количество ингибина-А 73 мг, выход 44,5%, степень очистки 16,5.)

Аффинная хроматография

Эта стадия очистки ингибина-А основана на обнаруженной нами способности лектина клещевины (рицина) преципитировать ингибин-А. Представляет собой аффинную хроматографию ингибина-А на иммобилизованном лектине клещевины. Через колонку (2×14 см) лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером, пропускали весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии. Далее колонку промывали 1 М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером, а затем элюировали связанный на колонке ингибин-А 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объема 13 мл (общий белок 32 мг, количество ингибина-А 27 мг, выход 16,3%, степень очистки 138,8).

Пример 2

Первичный экстракт плаценты

Для приготовления экстракта кусочки плаценты измельчали и гомогенизировали, добавляя физиологический раствор в соотношении 1:2. (Общий объем 1200 мл, общий белок 31640 мг, ингибина-А 164 мг, выход 100%, степень очистки 1.)

Бутанольная фракция

К полученной массе добавляли бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляли на сутки в холодильнике (+4°С). Затем смесь центрифугировали с этилпропиловым эфиром (1 часть эфира и 3 части гомогената) в течение 12 минут при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно. Надосадочную жидкость (445 мл), содержащую ингибин, помещали в колбе в холодильник (+4°С) на сутки. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок в надосадочной жидкости (7680 мг), количество ингибина-А 95 мг.

Выход 57,9%, степень очистки 2,3.

Преципитация сульфатом аммония

Полученный раствор смешивали с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугировали в рефрижераторной центрифуге в течение 50 мин при 10000 об/мин. Полученный осадок растворяли в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8. (Общий объем 115 мл, общий белок 855 мг, количество ингибина-А 73 мг, выход 44,5%, степень очистки 16,5.)

Аффинная хроматография

Эта стадия очистки ингибина-А основана на обнаруженной нами способности лектина клещевины (рицина) преципитировать ингибин-А. Представляет собой аффинную хроматографию ингибина-А на иммобилизованном лектине клещевины. Через колонку (2×14 см) лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером, пропускали весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии.

Далее колонку промывали 1 М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером, а затем элюировали связанный на колонке ингибин-А 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объема 13 мл (общий белок 32 мг, количество ингибина-А 27 мг, выход 16,3%, степень очистки 138,8).

Пример 3

Первичный экстракт плаценты

Для приготовления экстракта кусочки плаценты измельчали и гомогенизировали, добавляя физиологический раствор в соотношении 1:2. (Общий объем 1200 мл, общий белок 31640 мг, ингибина-А 164 мг, выход 100%, степень очистки 1.)

Бутанольная фракция

К полученной массе добавляли бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляли на сутки в холодильнике (+4°С). Затем смесь центрифугировали с уксусноэтиловым эфиром (1 часть эфира и 3 части гомогената) в течение 11 минут при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно. Надосадочную жидкость (445 мл), содержащую ингибин, помещали в колбе в холодильник (+4°С) на сутки. Затем еще раз центрифугировали и определяли общий белок в надосадочной жидкости (7680 мг), количество ингибина-А 95 мг.

Выход 57,9%, степень очистки 2,3.

Преципитация сульфатом аммония

Полученный раствор смешивали с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугировали в рефрижераторной центрифуге в течение 50 мин при 10000 об/мин. Полученный осадок растворяли в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8 (общий объем 115 мл, общий белок 855 мг, количество ингибина-А 73 мг, выход 44,5%, степень очистки 16,5).

Аффинная хроматография

Эта стадия очистки ингибина-А основана на обнаруженной нами способности лектина клещевины (рицина) преципитировать ингибин-А. Представляет собой аффинную хроматографию ингибина-А на иммобилизованном лектине клещевины. Через колонку (2×14 см) лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером, пропускали весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии. Далее колонку промывали 1 М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером, а затем элюировали связанный на колонке ингибин-А 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0. Полученный элюат диализовали и концентрировали до объема 13 мл (общий белок 32 мг, количество ингибина-А 27 мг, выход 16,3%, степень очистки 138,8).

Из приведенных примеров видно, что выход и степень очистки от применения разных эфиров не изменяются. Использование разных эфиров не влияет на конечный продукт, так как эфир используется для удаления липидных фракций и повышает выход белковых компонентов. В своих исследованиях мы использовали диэтиловый эфир как наиболее дешевый и доступный.

Достигнут положительный эффект: разработан способ, характеризующийся упрощением технологического процесса, повышением выхода целевого продукта, увеличением объемов, уменьшением количества стадий и снижением стоимости целевого продукта, а также получен ингибин-А с высокой степенью очистки (138,8), повышенной удельной активностью и характеристиками (см. таблицу).

Стадия очистки Общий объем, содержащий ингибин-А Общий белок, мг Количество ингибина-А, мг Выход, % Степень очистки Первичный экстракт плаценты 1200 мл 31640 164 100 1 Бутанольная фракция 445 мл 7680 95 57,9 2,3 Преципитация сульфатом аммония 115 мл 855 73 44,5 16,5 Аффинная хроматография 13 мл 32 27 16,3 138,8

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения и очистки ингибина-А человека. Измельчают кусочки плаценты и гомогенизируют. Добавляют физиологический раствор в соотношении 1:2. К полученной массе добавляют бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляют на сутки в холодильнике при t +4°C. Затем смесь центрифугируют с диэтиловым эфиром 1:3 в течение 10-12 минут при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно. Надосадочную жидкость, содержащую ингибин, помещают в колбе в холодильник при t +4°C на сутки. Затем еще раз центрифугируют надосадочную жидкость и определяют общий белок в ней. Полученный раствор смешивают с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге в течение 45-50 мин при 10000 об/мин. Полученный осадок растворяют в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8. Наносят на колонку лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером. Пропускают весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии. Колонку промывают 1 М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером. Затем элюируют связанный на колонке ингибин-А 0,1 М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0. Элюат диализуют и концентрируют. Способ позволяет получать ингибин-А с выходом 16,3%, повышенной удельной активностью и высокой степенью очистки 138,8. 1 табл.

Способ получения и очистки ингибина-А, заключающийся в приготовлении экстракта из биологических тканей, последовательном осаждении белка органическими растворителями и сульфатом аммония, проведением хроматографии, отличающийся тем, что кусочки плаценты измельчают и гомогенизируют, добавляют физиологический раствор в соотношении 1:2, к полученной массе добавляют бутиловый спирт в расчете 1:10 и оставляют на сутки в холодильнике при t +4°C, затем смесь центрифугируют с диэтиловым эфиром 1:3 в течение 10-12 мин при 5000 об/мин в рефрижераторной центрифуге двукратно, надосадочную жидкость, содержащую ингибин, помещают в колбе в холодильник при t +4°C на сутки, затем еще раз центрифугируют и определяют общий белок в надосадочной жидкости, полученный раствор смешивают с равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге в течение 45-50 мин при 10000 об/мин, полученный осадок растворяют в ТРИС-HCl буфере с рН 7,8, наносят на колонку лектин-сефарозы, уравновешенную ТРИС-HCl буфером, пропускают весь объем растворенного осадка, полученного на предшествующей стадии, колонку промывают 1М раствором хлорида натрия, забуференного ТРИС-HCl буфером, затем элюируют связанный на колонке ингибин-А 0,1М раствором лактозы в боратном буфере рН 9,0, элюат диализуют и концентрируют.