СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЛЕГКОЙ ФРАКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а конкретно к лабораторной технике выявления легкой фракции эритроцитов, что может быть использовано врачами-лаборантами клинико-диагностических, гематологических и гемостазиологических лабораторий для диагностики анемических синдромов и расстройства системы гемостаза (синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания - ДВС-синдрома).

Известен способ определения легкой фракции эритроцитов, основанный на разделении пула эритроцитов путем центрифугирования образцов крови в градиенте плотности раствора фиколверографина заданной удельной плотности (Баркаган З.С., Тамарин И.В. Оценка степени повреждения эритроцитов при диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови./ Лаб. дело. -1988. - 4. - С. 35-39). Однако метод имеет существенные недостатки. Он относится к категории макрометодов, и для его выполнения требуется значительное количество реагентов, а также большой объем анализируемой крови (2 мл). Кроме того, процедура определения легкой фракции эритроцитов по этому методу занимает много времени и является достаточно трудоемкой.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является микрометод обнаружения легкой фракции эритроцитов, предложенный А.М. Лившицем (Лившиц А. М. Экспресс-метод определения степени повреждения эритроцитов//Лаб. дело. - 1992. - С.25-27). При выполнении способа-прототипа требуется капиллярная кровь, которую получают при проколе пальца. Кровь по одной капле помещают в 4 лунки планшета, в которые последовательно вносят по 0,25 мл раствора верографина 4-х заданных концентраций - 1,115, 1,1170, 1,1225 и 1,1280 г/см³. Содержимое каждой лунки перемешивают. Четыре капилляра заполняют полученными смесями. Каждый из капилляров с одного из торцов герметизируют и центрифугируют 10 минут при 15 000 об./мин, после чего оценивают результаты теста.

Способ-прототип также имеет недостатки: для его реализации требуется значительное количество исходного (ампульного) раствора верографина на этапе приготовления верографина 4-х заданных концентраций, процедура подготовительных мероприятий при выполнении метода в 4-х капиллярах с растворам верографина различной удельной плотности является достаточно трудоемкой. Для выполнения теста требуется капиллярная кровь, которую получают путем прокола мякоти фаланги пальца, то есть необходима дополнительная процедура, когда у больного исследуется полный комплекс показателей системы гемостаза и кровь при этом забирают из локтевой вены для приготовления плазмы. Кроме того, как показали наши исследования, воспроизводимость этой методики оказалась неудовлетворительной.

Задачей настоящего изобретения является упрощение процедуры выявления легкой фракции эритроцитов, повышение воспроизводимости способа и снижение затрат времени и средств на его выполнение.

Поставленная задача решается за счет того, что у больного из вены забирают кровь, готовят цитратный образец крови известным методом, гематокритный капилляр наполовину заполняют цитратной кровью, а вторую половину капилляра - водным раствором верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³, капилляр со стороны раствора верографина герметизируют и центрифугируют в течение 9-10 мин в гематокритной центрифуге при ускорении 15000-15500 g. При этом после окончания процедуры центрифугирования образца появление розового облачка над плотным седиментом эритроцитов оценивают как наличие в крови легкой фракции эритроцитов (тест положительный), а отсутствие такового (над седиментом эритроцитов надосадочный слой прозрачен) - как отрицательный.

Способ выявления легкой фракции эритроцитов осуществляют следующим образом. У больного из вены забирают кровь, готовят цитратный образец путем смешивания цельной крови с 3,8% водным раствором цитрата натрия в соотношении 9: 1, гематокритный капилляр наполовину заполняют цитратной кровью (приблизительно 50 мкл), а вторую половину капилляра - водным раствором верографина (приблизительно 50 мкл) с удельной плотностью 1,1315 г/см³ (рабочий раствор верографина). При этом используют методику подготовки раствора верографина согласно патенту на изобретение 2134421 (Преснякова М.В., Сидоркин В. Г. , Сидоркина А.Н. Способ подготовки раствора верографина для обнаружения легкой фракции эритроцитов). Для приготовления раствора верографина заданной плотности применяют микрометод - смешиваемые жидкости отмеривают с помощью цифрового электронного или механического пипеточного дозатора, а объем добавляемого к воде исходного (ампульного) верографина рассчитывает по формуле
(1+X)•Y=(1•0,998)+Z•X,
где 1 - объем воды в мл (1 мл);
Х - объем исходного (ампульного) верографина, добавляемого к воде (в мл);
Y - заданная плотность смеси воды с ампульным верографином (г/см³);
0,998 - удельная плотность воды при 20^oС (г/см³);
Z - удельная плотность исходного (ампульного) верографина (г/см³).

Смысл уравнения заключается в следующем: масса объема смеси (1 мл воды+Х мл ампульного верографина) с запланированной удельной плотностью смеси (Y) в левой части уравнения равна массе 1 мл воды+массе добавленного (X мл) ампупьного верографина исходной удельной плотности (Z). После преобразования уравнения находят X.

Для приготовления рабочего раствора верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³ по формуле рассчитывает количество матричного (ампульного) раствора верографина, которое следует добавить к 1 мл дистиллированной воды. Уравнение приобретает следующий вид:
(1+X)•1,1315=(1•0,9982)+(1,3594•X).

Преобразуют уравнение
1,1315+1,1315X=0,9982+1,3594Х;
1,1315-0,9982=1,3594Х-1,1315Х;
0,1333=0,2279Х;
X=0,1333:0,2279=0,585.

Следовательно, для получения рабочего раствора верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³ к 1 мл воды следует добавить с помощью цифрового пипеточного микродозатора 0,585 мл (585 мкл) ампульного верографина с исходной плотностью 1,3594 г/см³. Общий объем смеси составляет 1,585 мл.

При этом смесь верографина с водой готовится по мере необходимости для использования раствора в течение одного рабочего дня. Так как общий объем приготовленной смеси составляет около 1,5 мл, то этого достаточно, чтобы выполнить 20-25 анализов. Следует заметить, что плотность исходного (ампульного) раствора верографина (Z) из партии приобретенного препарата определяют заранее один раз с помощью пикнометра на аналитических весах известным методом. Полученную величину используют всякий раз при подготовке рабочего раствора верографина.

Процедуру заполнения гематокритного капилляра образцом крови и рабочим раствором верографина выполняют следующим образом. Пробирку с цитратной кровью наклоняют под углом 45^o, нижней открытой частью гематокритного капилляра аккуратно касаются поверхности крови. При этом кровь поднимается по капилляру и постепенно его заполняет. Когда капилляр приблизительно наполовину заполнится анализируемым образцом, капилляр извлекают из пробирки и аналогично тем же открытые концом касаются поверхности приготовленного водного раствора верографина заданной удельной плотности. Верографин поднимается по капилляру вверх, продвигая вперед столбик крови. По завершении процедуры заполнения капилляра открытый торец гематокритного капилляра со стороны раствора верографина герметизируют, например пластилином, и осторожно, не встряхивая, помещают в гематокритную центрифугу.

Капилляр с образцом крови центрифугируют в течение 9-10 мин в гематокритной центрифуге при ускорении 15000-15500 g. В варианте конкретного выполнения методики использована гематокритная центрифуга "Jouan A-13" (Франция), имеющая скорость вращения ротора 12 000 об./мин и ускорение 15290 g. При использовании иной центрифуги с близкими рабочими параметрами оптимальные результаты получают несколько варьируя длительность процедуры центрифугирования в пределах от 9 до 10 мин.

После окончания процедуры центрифугирования образца появление розового облачка над плотным седиментом эритроцитов оценивают как наличие в крови легкой фракции эритроцитов (тест положительный), а отсутствие такового (над седиментом эритроцитов надосадочный слой прозрачен) - как отрицательный.

Удельная плотность раствора верографина в дистиллированной воде 1,1315 г/см³ найдена экспериментальным путем при исследовании образцов крови здоровых людей и пациентов, находившихся на лечении в Российском ожоговом центре на базе Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии по поводу тяжелой термической травмы. При этом у пострадавших, у которых по данным анализа совокупности различных показателей, характеризующих различные звенья состояния системы гемостаза, был диагностирован ДВС-синдром, тест на наличие в крови легких (поврежденных) эритроцитов был положительным.

Как показали результаты обследования пациентов с термической травмой (свыше 1000 человек) и здоровых людей (более 400 человек), предложенный способ позволял адекватно оценить наличие или отсутствие в образцах крови легкой фракции эритроцитов. Позитивные результаты теста всегда положительно коррелировали с другими данными лабораторного обследования состояния системы гемостаза больных, свидетельствующими о развитии у пострадавших синдрома ДВС.

Вышеизложенное иллюстрируется примерами.

Пример 1.

Больная П-ва А.А. 26 лет ( ист. б-ни 181147) поступила в Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии по поводу ожога пламенем II-IIIАБ степени на площади 20% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 22 ЕД. Тест повреждения эритроцитов отрицательный. Прочие показатели состояния системы гемостаза в пределах нормы. Выписалась из института на 43-и сутки после термической травмы в удовлетворительном состоянии.

Пример 2. Пациентка М-ва А.П. 59 лет ( ист. б-ни 186454) поступила в ННИИТО с ожогом паром I-II-IIIA степени на площади 20% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 20 ЕД. Тест-повреждения эритроцитов отрицательный. Другие показатели развернутой коагулограммы в норме, на 17-е сутки после ожога выписалась в удовлетворительном состоянии.

Пример 3.

Пострадавший Л-ин С.М. 57 лет ( ист. б-ни 184247) поступил в институт с ожогами IIIАБ-IV степени на площади 45% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 70 ЕД. Тест повреждения эритроцитов положительный, низкая активность антитромбина III (54%), по данным ортофенатролинового теста - в крови высокое содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов - 100 мг/л, положительный этаноловый тест (тест на наличие растворимых фибрин-мономерных комплексов и продуктов деградации фибрина и фибриногена), резко заторможен XIIa-зависимый фибринолиз (120 мин). По данным лабораторного анализа у больного острый ДВС-синдром. Пациент скончался на 6-е сутки после травмы.

Пример 4.

Больной Г-ин В. Р. 61 года ( ист. б-ни 179902) доставлен в Российский ожоговый центр с ожогами пламенем II-IIIAB-IV степени на площади 35% поверхности тела. Индекс тяжести поражения - 95 ЕД. Тест повреждения эритроцитов положительный. Результаты прочих анализов также свидетельствовали о наличии у пострадавшего синдрома ДВС - в крови низкое значение активности антитромбина III (56%), по данным ортофенантролинового теста - высокое содержание растворимых фибрин-мономерных комплексов (160 мг/л), положительный этаноловый тест. XIIа-зависимый фибринолиз заторможен (63 мин). Больной скончался на 30-е сутки после ожога.

Предложенный тест относится к категории микрометодов, отличается высокой воспроизводимостью получаемых результатов, требует для выполнения ничтожно малого количества верографина, характеризуется простотой процедуры проведения теста и минимальной затратой времени для его реализации.

Способ обнаружения легкой фракции эритроцитов в образце крови может быть эффективно использован в гемостазиологических лабораториях для диагностики диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдрома) в клиниках, где это грозное осложнение встречается наиболее часто (травматология и общая хирургия, комбустиология, акушерство и гинекология), а также быть полезным в гематологических клиниках для обнаружения атипично легких эритроцитов при диагностике предлейкозных анемических синдромов, аутоиммунной гемолитической анемии, гипопластической анемии.

Изобретение относится к медицине, а конкретно- к лабораторной технике выявления легкой фракции эритроцитов, что может быть использовано для диагностики анемических синдромов и расстройства системы гемостаза. Способ заключается в том, что у больного из вены забирают кровь, готовят цитратный образец крови известным методом, гематокритный капилляр наполовину заполняют цитратной кровью, а вторую половину капилляра - водным раствором верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³, капилляр со стороны раствора верографина герметизируют и центрифугируют в течение 9-10 мин в гематокритной центрифуге при ускорении 15000-15500 g. При этом появление розового облачка над плотным седиментом эритроцитов оценивают как наличие в крови легкой фракции эритроцитов (тест положительный), а отсутствие такового (над седиментом эритроцитов надосадочный слой прозрачен) - как отрицательный. Технический результат: упрощение процедуры выявления легкой фракции эритроцитов, повышение воспроизводимости способа и снижение затрат времени и средств на его выполнение.

Способ выявления легкой фракции эритроцитов, включающий забор крови и центрифугирование образца крови с раствором верографина, отличающийся тем, что кровь для анализа получают из вены, готовят цитратный образец крови, капилляр наполовину заполняют цитратной кровью, а вторую половину - водным раствором верографина с удельной плотностью 1,1315 г/см³, капилляр со стороны раствора верографина герметизируют, центрифугируют в течение 9-10 мин с ускорением 15000-15500 g и при появлении розового облачка над плотным седиментом эритроцитов - легкой фракции эритроцитов тест считают положительным, а при его отсутствии - отрицательным.