СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ РАНЕВОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, гнойной хирургии и может быть использовано для определения возбудителя раневой инфекции в послеоперационном периоде и осуществления обоснованного этиологического лечения.

Известны различные способы выявления Ch. trachomatis - цитологический, культуральный, иммуноферментный, прямой и непрямой иммунофлуоресценции, гибридизационный анализ. Объектом исследования при этом являются клетки цилиндрического эпителия урогенитального тракта, синовиальная жидкость, кровь (8, 9, 11).

Перечисленные способы имеют ряд недостатков. Цитологический способ позволяет выявить 9-15% случаев хламидийной инфекции. Культуральный способ дорогой, длительный и трудоемкий. Рост культуры можно наблюдать не раньше, чем через 3 суток. Иммуноферментные способы относительно недороги, но их отрицательными сторонами является то, что чувствительность в лучшем случае достигает 60-70%. Могут быть ложноположительные результаты, поэтому многие лаборатории используют дополнительный тест, например прямое связывание с флюоресцирующими антителами, для подтверждения положительных результатов. Проведенная суммированная оценка чувствительности описанных способов диагностики показала, что быстрые тесты имеют чувствительность 40-60%, иммуноферментный анализ (ИФА) - 50-70%, прямая иммунофлуоресценция (ПИФ) - 55-75%, культуральное исследование - 60-80% (4, 10).

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ детекции генов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием общих праймеров для всех бактериальных и грибковых патогенных микроорганизмов. Это праймеры 16S р-РНК бактерий и 18S р-РНК грибов (6). Их детекция позволяет определить наличие всех возможных возбудителей инфекционных осложнений одновременно в парапротезных тканях. Данный способ является высокочувствительным, но отражает наличие лишь инфицированности, не дифференцируя конкретного возбудителя. Эти праймеры не позволяют выявить Ch. trachomatis, так как хламидии относятся к классу простейших, облигатных внутриклеточных паразитов и определить методом полимеразной цепной реакции по указанным выше праймерам невозможно (1,2,3).

Задача изобретения: разработать способ выявления хламидии в ране, с целью установления этиологии раневого процесса и проведения специфического лечения.

При решении поставленной задачи имеет место положительный лечебный эффект. При установлении хламидиоза раны применяется этиотропное лечение, что позволяет купировать специфический воспалительный процесс, ускорить заживление раны и улучшить результаты лечения.

При использовании способа имеет место экономический эффект, который заключается в сокращении пребывания больного в стационаре, уменьшении стоимости лечения.

При использовании способа имеет место социальный эффект: снижается риск инвалидизации пациентов.

Поставленная задача решается за счет того, что детекцию ДНК С1. Trachomatis проводят в тканевых макрофагах, выделенных из грануляционной ткани, с использованием специфического праймера для ДНК хламидий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Технический результат достигается за счет использования метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладающей высокой чувствительностью, специфичностью, объектом исследования являются тканевые макрофаги, так как хламидии характеризуются облигатным внутриклеточным циклом развития.

Способ осуществляется следующим образом.

Фрагменты грануляционной ткани, полученные во время перевязки, измельчаются, подвергаются процессу гомогенизации. Клеточная суспензия дважды отмывается в физиологическом растворе, осаждается центрифугированием. Тканевые макрофаги выделяли методом адгезии к пластику (5). Клеточный осадок ресуспендируется в 10 мл культуральной среды RPMI-1640, с добавлением 2 мМ L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина, 10 мМ HEPES-буфера, 10% инактивированной сыворотки крови АВ IV группы и наслаивается на стерильную пластиковую чашку Петри. Клетки инкубируются в СO₂-инкубаторе при 37°С и 5% влажности в течение 2 часов, затем клетки, прилипшие к поверхности пластика, которые на 92-93% состоят из макрофагов, собираются, отмываются и используются для исследования. Работа ведется в асептичесих условиях, с использованием одноразовой посуды. 200 мкл клточной суспензии в физиологическом растворе смешивают с 200 мкл лизирующего буфера, состоящего из 0,2 М триоксиметиламинометана, 0,04 М натрия гидроокиси, 5% натрия додецилсульфата, инкубируют в течение 20 минут при 42°С. ДНК экстрагируют, добавляя в пробирку 200 мкл фенолхлороформовой смеси с изоамиловым спиртом. Смесь встряхивают, перемешивают, центрифугируют при 1200 об/мин в течение 5 мин. Отбирают 300 мкл водной фазы, добавляют 1/10 объема тРНК (5 мкг/мл), 1/10 объема 3М натрия ацетата и 2 объема охлажденного этанола, выдерживают 15 мин при -70°С, затем центрифугируют при 1200 об/мин 10 мин. Осадок растворяют в 25 мкл стерильной бидистиллированной воды и используют для проведения полимеразной цепной реакции. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определеннных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки (20 нуклеотидных пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах.

1 этап.

Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 94°С в течение 60 сек.

2 этап.

Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 65°С. Время отжига - 60 сек.

3 этап.

Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре -72°С. Время протекания синтеза - 90 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n - число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации (7).

Наличие специфического продукта ПЦР (ампликона) детектируют методом электрофореза в агарозном геле. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением по отношению к маркерным фрагментам и положительному ДНК-контролю. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии хламидий в клинической пробе.

Пример конкретного выполнения

Больной М. 53 л., поступил 20.11.2000 г. в отделение эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов Новосибирского НИИТО. При поступлении жалобы: боли в области левого бедра, невозможность опоры на левую ногу.

Из анамнеза: в 1971 г. автодорожная травма - закрытый вывих левого бедра. Лечение консервативное. В 1981 г. по поводу посттравматического левостороннего коксартроза 3 ст. выполнено эндопротезирование левого тазобедренного сустава эндопротезом К.М.Сиваша. В 1997 г. по поводу асептической нестабильности эндопротеза К.М.Сиваша проведено ревизионное эндопротезирование левого тазобедренного сустава цементным эндопротезом W.Link. В 1999 г. возник абсцесс на оперированном бедре. По этому поводу неоднократно оперирован. Развился остеомиелит бедренной кости. Воспалительный процесс удалось купировать ценой удаления бедренного компонента эндопротеза. Сформировалась неопорная левая нижняя конечность.

На основании жалоб, клинической картины, лабораторного и рентгенологического обследования выставлен диагноз: костный дефект проксимальной части бедренной кости после удаления бедренного компонента эндопротеза “W Link”, имплантированного по поводу асептической нестабильности эндопротеза К.М.Сиваша. Хронический остеомиелит левой бедренной кости в стадии ремиссии.

По результатам предоперационного обследования (общий анализ крови - эр - 4,6 × 10¹²/л; гем - 146 г/л; л - 7,1 10⁹/л, э-5, п-6 с-40 л-43 м-6; ЛИИ 0,18; абсолютное число лимфоцитов 3, 05×10⁹/л; СОЭ 16 мм/час. Биохимия крови - общий белок 83 г/л; мочевина 5,6 ммоль/л; общий билирубин 6,54 мкмоль/л; К плазмы - 4,4 ммоль/л; глюкоза крови 4,6 ммоль/л; АКТ А-47%; МА - 88%; ИИТ - 2,0; протромбиновый индекс 94%; фибриноген - 4,0 г/л.; общий анализ мочи: цвет - желтый; уд. вес-1018; прозрачность - сл. мутная; белок - отр.; сахар - отр.; реакция - кислая; лейкоциты - 1-3 в п/зр.; эп. плоский - 0-1 в п/зр) данных за воспалительный процесс не выявлено. Провокационное физиотерапевтическое воздействие УВЧ №7 на область левого бедра не привело к обострению воспалительного процесса. Руководствуясь клиническими данными и стандартными лабораторными исследованиями, определены показания к оперативному лечению и 30.11.2000 г. была проведена операция - удаление ацетабулярного компонента эндопротеза W. Link, ревизионное бесцементное эндопротезирование левого тазобедренного сустава с использованием антипротрузионного ацетабулярного компонента и ревизионного бедренного компонента с дополнительной фиксацией компонентов шурупами и костной аллосоломкой. В послеоперационном периоде проводились лечебные мероприятия, направленные на профилактику возможных осложнений со стороны раны (прием виферона в свечах через день в течение 10 дней, бактисубтил по 2 дозы 3 раза в день в течение всего периода нахождения в стационаре). Несмотря на проводимые мероприятия, послеоперационное течение осложнилось инфицированием гематомы. Поэтому возникли показания к ревизии эндопротеза. На операции выявлены участки некроза мягких тканей по ходу предыдущего доступа и патологические грануляции. Они были иссечены, полость промыта растворами антисептиков, рана дренирована сквозными хлорвиниловыми дренажами. К шейке протеза подведен микроирригатор для введения левомеколя. Рана круглосуточно промывалась раствором бетадина. Дренажи удалены через две недели. В посевах раневого отделяемого определялись Ps. Aeruginosa и St. Epidermidis, с чувствительностью к цефалоспоринам, клиндамицину. Но степень обсемененности раны была низкой и равнялась 2 степени. Такая низкая степень обсемененности раны не является этиологически значимой. Это заставило нас прибегнуть к поиску другого вида раневой инфекции. И при исследовании тканевых макрофагов, выделенных из грануляционной ткани раны, на наличие ДНК Ch. trachomatis методом ПЦР была получена положительная реакция.

Проводилась этиотропная, патогенетическая антибактериальная и инфузионная терапия, переливание эритромассы и плазмы, курс виферона. Рана зажила первичным натяжением. Больной в удовлетворительном состоянии 12.01.2001 г. (проведено 53 койко/дня) выписан на амбулаторное лечение. На момент выписки данных за воспалительный процесс нет. Общий анализ крови: эр - 3,7×10¹²/л; гем - 115 г/л; л - 5,5 10%, э-1, п-4 с-57 л-26 м-6; плазматические клетки - 1; ЛИИ 0,68; абсолютное число лимфоцитов 1,43×10⁹/л; СОЭ 55 мм/час. Биохимия крови: общий белок 60 г/л; мочевина 5,8 ммоль/л; молекулы средней массы - 0,354 (норма-300); общий билирубин 7,24 мкмоль/л; К плазмы - 5,1 ммоль/л; глюкоза крови 4,9 ммоль/л; АПТВ-33с; протромбиновый индекс 87%; фибриноген - 4,0 г/л. Общий анализ мочи: цвет - желтый; уд. вес - 1018; прозрачность - сл. мутная; белок - отр.; сахар - отр.; реакция - кислая; лейкоциты - 1-3 в п/зр.; эп.плоский - 0-1 в п/зр.

Список литературы

1. Брагина Е.Е., Дмитриев Г.А., Кисина В.И. Структурно-функциональные особенности жизненного цикла хламидий in vivo// Вестник дерматологии и венерологии, 1995, №6, с.18-20.

2. Брагина Е.Е., Дмитриев Г.А. Морфологические особенности строения элементарных и ретикулярных телец хламидий при персистирующем хламидиозе// Тезисы докладов научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ. - М., 1996, с.12-13.

3. Брагина Е.Е., Орлова О.Е., Дмитриев Г.А. Некоторые особенности жизненного цикла хламидий. Атипичные формы существования (обзор литературы) // 3ППП, 1998, №1, с.3-9.

4. Дубинина И.Г., Щербо С.Н. Роль метода полимеразной цепной реакции в генодиагностике// Новые генетические технологии. - М., 1998, с.20-39.

5. Иммунологические методы / Под ред. X.Фримеля. - М.: Мир, 1979, 518 с.

6. Кузьмин И.И., Кузьмин Р.И. Применение обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции для одновременной детекции бактериальных и грибковых возбудителей инфекционных осложнений эндопротезирования суставов// Тезисы докладов научно-практической конференции с международным участием “Новые технологии в медицине” (г. Курган, 19-21 сент., 2000).- Курган, 2000, с.159-160.

7. Щербо С.Н., Земляной Н.Ю., Балевой Л.С. и др. Инструкция по применению набора реактивов для выявления нуклеотидных последовательностей Хламидия трахоматис методом полимеразной цепной реакции ХламАм.- М., 1996.

8. Beatty W.L., Belinger T.A., Le K.D., Desai A.A., Morrison R.P., Byme G.I. Chlamydial persistence: mechanism of induction and parallels to a stress-relate response// Abstracts of Proceedings of the 8th International Symposium of Human Chlamydial Infections. Gouvieux-Chanrilly. France, 12-24 June 1994, p.415-418.

9. Ghaem-Maghami S., Lewis D.J. Hay P.E. Characterisation of immune responses to human genital Chlamydial infections //Abstracts ofProc 3rd Meet Eur Soc Chlam Res. - Vienna, Austria, 11-14 Sept 1996, p.81.

10. Ossewaarde J.M. New methods in diagnostic and epidemialogical research of Chlamydia trachomatis infections// Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 1995, №5, p.111-123.

11. Quinn TS. Advances in the molecular diagnosis of Chlamydia trachomatis // Proc 3 rd Meet Eur Soc Chlam Res. - Vienna, Austria, 11-14, Sept. 1996, p.263-7.

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии, ортопедии и гнойной хирургии и может быть использовано для определения возбудителя раневой инфекции в послеоперационном периоде. Сущность способа состоит в выявлении ДНК Chlamydia trachomatis в тканевых макрофагах, выделенных из грануляционной ткани раны методом полимеразно-цепной реакции. Техническим результатом является установление этиологии раневого процесса, своевременное применение этиотропного лечения.

Способ диагностики возбудителя раневой инфекции методом полимеразно-цепной реакции, отличающийся тем, что проводят детекцию ДНК Chlamydia trachomatis в тканевых макрофагах, выделенных из грануляционной ткани раны.