СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 C12P19/30 C12P19/34 

Группа изобретений относится к биотехнологии, может найти применение в медицине, медицинской микробиологии, биологии, ветеринарии и касается способа детекции хламидий.

Хламидии являются широко распространенными облигатными внутриклеточными паразитами, вызывающими широкий спектр тяжелых заболеваний человека и животных. Хламидии способны к существованию в организме в персистентной форме без каких-либо клинических проявлений, но обладают способностью к спонтанной активации, особенно в случаях ослабления иммунного статуса человека. В настоящее время принята таксономическая система, разделяющая 9 видов хламидий. Среди них особенно важное для медицины значение имеют Chlamydia trachomatis, являющаяся инфекционным агентом слепящей трахомы, урогенитальных патологий, офтальмии новорожденных и лимфогрануломы венерум, и Chlamydophila pneumoniae, являющаяся, по последним данным, причиной более чем половины всех пневмоний в мире, а также предположительно связанная с рядом сердечно-сосудистых патологий (в частности, с ишемической болезнью сердца, атеросклерозом, болезнью Альцгеймера и астмой.

Также могут инфицировать человека и представители других видов, в норме являющихся патогенами животных, - Chlamydophila psittaci (возбудитель широкого спектра орнитозов), Chlamydophila abortus (чаще всего вызывает абортивные реакции у крупного рогатого скота), Chlamydophila felis (инфекционный агент конъюнктивитов и ринитов домашних кошек) и Chlamydophila pecorum (возбудитель широкого спектра заболеваний копытных животных, в том числе свиней).

Для остальных трех видов - Chlamydia muridarum (инфекционный агент пневмонии мышей), Chlamydia suis (возбудитель ряда заболеваний европейской дикой свиньи) и Chlamydophila caviae (вызывает заболевания слизистого эпителия морских свинок) не зафиксировано случаев инфицирования человека.

Детекция хламидий представляет собой сложную задачу ввиду как крайне широкого спектра клинических проявлений, так и недостатков традиционно использующихся методов детекции. Перспективным подходом для детекции хламидий является ДНК-диагностика, основанная на полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время ПЦР является наиболее чувствительным способом индикации микроорганизмов, способным потенциально обнаруживать единичные бактериальные частицы. Преимуществами данного типа детекции также являются прямое определение собственно возбудителя, а не белков-маркеров, являющихся продуктом его жизнедеятельности, высокая специфичность, высокая скорость получения результата, а также возможность диагностики хронических и латентных инфекций, что особенно важно в случае хламидий. Прямое определение ДНК хламидий может служить не только основой для выявления инфицированности в любой его форме (персистентной или активной), но и для анализа генетических вариантов возбудителя.

Однако большинство публикаций, посвященных разработке ПЦР-методов детекции хламидий, построены на выявлении только одного вида хламидий.

Так, известен способ детекции хламидий вида С. trachomatis с применением ПЦР с использованием двух праймеров и матрицы в виде участка ДНК хламидий с получением амплификата с последующим определением полученных продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в агарозном геле (Griffais R, Thibon M., Detection of Chlamydia trachomatis by the polymerase chain reaction. Res Microbiol 1989 Feb;140(2): 139-41) [1].

Однако данный известный способ малоэффективен для клинического применения, так как на практике в большинстве случаев возникает вопрос о комплексной диагностике широкого спектра хламидийных инфекций.

Известен способ детекции хламидийной инфекции путем одновременного выявления всех представителей семейства Chlamydiaceae, включающий детекцию хламидий в исследуемом материале путем проведения одноэтапной ПЦР с использованием двух праймеров и матрицы в виде участка ДНК хламидий с получением амплификата с последующим определением полученных продуктов амплификации. В данном известном способе продукты амплификации определяют методом горизонтального электрофореза в агарозном геле (Everett K.D., Andersen A.A., Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCR-RFLP, Int J Syst Bacteriol 1999 Apr; 49 Pt 2:803-13) [2] - прототип.

Однако данный метод детекции, основанный на ПЦР-амплификации участка гена, кодирующего РНК 16S-субъединицы рибосомы, не пригоден для использования в практической диагностике, т.к. ввиду большей консервативности гена 16S-RNA по сравнению с геном отр2 ПЦР-система, используемая в данном известном способе, специфична не только для представителей семейства Chlamydiaceae, но и для ряда родственных хламидиям организмов, принадлежащих к семействам Simkaniaceae, Parachlamydiaceae и Waddliaceae, а также для представителей рода Mycoplasma.

Техническим результатом, достигаемым настоящей группой изобретений, является специфическое определение наличия хламидий независимо от вида, сочетания видов и присутствия родственных хламидиям видов в пробе.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики хламидий, включающем детекцию ДНК хламидий путем проведения одноэтапной полимеразой цепной реакции с использованием двух праймеров и матрицы в виде участка ДНК хламидий с получением амплификата и с последующим определением продуктов амплификации, отличительной особенностью является то, что в качестве праймеров используют олигонуклеотид I:

и олигонуклеотид II:

При этом проводят 32 цикла ПЦР, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе диагностики хламидий, включающем детекцию ДНК хламидий путем проведения одноэтапной полимеразой цепной реакции с использованием двух праймеров и матрицы в виде участка ДНК хламидий с получением амплификата и с последующим определением продуктов амплификации, в качестве праймеров используют олигонуклеотид II:

и олигонуклеотид III:

При этом проводят 32 цикла ПЦР, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС.

Указанный технический результат достигается также тем, что в способе диагностики хламидий, включающем детекцию ДНК хламидий, с получением амплификата и с последующим определением продуктов амплификации отличительной особенностью является то, что проводят двухэтапную полимеразную цепную реакцию, причем на ее первом этапе используют два внешних праймера в виде олигонуклеотида I:

и олигонуклеотида II:

и матрицу в виде участка ДНК хламидий, а на втором этапе - два внутренних праймера в виде олигонуклеотида II:

и олигонуклеотида III:
,
а также матрицу в виде продукта амплификации, полученного на первом этапе, а определение продуктов амплификации осуществляется после проведения второго этапа полимеразной цепной реакции.

При этом на обоих этапах проводят 32 цикла ПЦР, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС.

Для создания метода специфической универсальной ПЦР-детекции хламидий был проведен компьютерный анализ геномов всех известных видов представителей семейства Chlamydiaceae. В результате был идентифицирован участок ДНК гена, кодирующего белок 2 наружной мембраны (отр2), протяженностью около 1600 нуклеотидов, фланкированный консервативными участками. Кроме того, внутри указанного участка содержался еще один консервативный участок. Для двух консервативных участков, которыми фланкирован идентифицированный участок гена отр2, были сконструированы два праймера: олигонуклеотид I из 21 нуклеотида:

и олигонуклеотид II из 27 нуклеотидов:

Для консервативного участка внутри фрагмента в гене отр2 был сконструирован третий праймер: олигонуклеотид III из 24 нуклеотидов:

Кроме того, для данного участка в качестве второго праймера был использован тот олигонуклеотид II из 27 нуклеотидов, который был сконструирован для одного из тех консервативных участков, которыми фланкирован идентифицированный фрагмент в гене оmр2.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие группу изобретений.

Пример 1
Отработку условий амплификации проводили на клонированных фрагментах хламидийной ДНК, полученных из культур клеток, зараженных представителями 9 видов семейства Chlamydiaceae и родственного ему семейства Simkaniaceae. Препараты культур клеток получены из Национального Общественного Института Здоровья, Финляндия и Калифорнийского Университета, США, а также из Государственного Института Стандартов и контроля лекарственных препаратов им. Тарасовича, Россия.

При проведении одноэтапной полимеразой цепной реакции с использованием в качестве праймеров олигонуклеотида I из 21 нуклеотида:

и олигонуклеотида II из 27 нуклеотидов:

и 9 матриц в виде ДНК представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae, а также 3 матриц в виде ДНК представителей видов Simkania negevensis, Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae с получением амплификата и с последующим определением продуктов амплификации, в тех случаях, когда в качестве матрицы использовалась ДНК хламидий, были получены видимые ампликоны размером примерно 1600 п.о. В случаях использования в качестве матрицы ДНК Simkania negevensis, Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae видимые ампликоны получены не были.

При этом проводили 32 цикла полимеразной цепной реакции, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oC и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС.

Пример 2
Проводилась одноэтапная полимеразная цепная реакция с использованием в качестве праймеров олигонуклеотида II из 27 нуклеотидов:

и олигонуклеотида III из 24 нуклеотидов:

и 9 матриц в виде ДНК представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae, а также 3 матриц в виде ДНК представителей видов Simkania negevensis, Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae с получением амплификата и с последующим определением продуктов амплификации. В тех случаях, когда в качестве матрицы использовалась ДНК хламидий, были получены видимые ампликоны размером примерно 1030 п.о. В случаях использования в качестве матрицы ДНК Simkania negevensis, Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae видимые ампликоны получены не были.

При этом проводили 32 цикла полимеразной цепной реакции, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС.

Пример 3
Проводилась двухэтапная полимеразная цепная реакции с использованием на первом этапе двух внешних праймеров в виде олигонуклеотида I из 21 нуклеотида:

и олигонуклеотида II из 27 нуклеотидов:

и 9 матриц виде ДНК представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae, а также 3 матриц в виде ДНК представителей видов Simkania negevensis, Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae, а на втором этапе - двух внутренних праймеров в виде олигонуклеотида II из 27 нуклеотидов:

и олигонуклеотида III из 24 нуклеотидов:

и 12 матриц в виде продуктов амплификации, полученных на первом этапе, с определением продуктов амплификации после проведения каждого этапа полимеразной цепной реакции. При этом на первом этапе проводили 22 цикла ПЦР, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 20 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС, а на втором этапе - 27 циклов ПЦР, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 25 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС. Несмотря на то что при 22 циклах первого этапа ПЦР не удалось получить видимых ампликонов, при дальнейшем использовании в качестве матрицы полученного амплификата в последующей ПЦР (на втором этапе) в тех случаях, когда в качестве матрицы использовалась ДНК хламидий, были получены видимые ампликоны размером примерно 1030 п. о. В случаях использования в качестве матрицы на первом этапе ДНК Simkania negevensis, Mycoplasma hominis и Mycoplasma pneumoniae видимые ампликоны ни на первом, ни на втором этапе получены не были.

Таким образом, полученные результаты говорят о том, что предложенные способы детекции хламидий просты в исполнении, дешевле раздельных тест-систем и отличаются высокой специфичностью. Предложенные способы дают принципиальную возможность одновременно определять хламидии любого из 9-и видов в реакции ПЦР. Присутствие представителей других, даже близкородственных хламидиям видов не мешает определению.

Изобретение относится к биотехнологии, биологии, медицине и ветеринарии. Разработано три способа детекции представителей семейства Chlamydiaceae, заключающихся в детекции ДНК хламидий путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидных праймеров. Два способа предусматривают проведение одноэтапной ПЦР с использованием в первом способе праймеров
5'-CAAACTCATСAGACGAG(CT)AGT-3' (I)
и 5'-CTTTCAATGTTACAGAAAACTCTACAG-3' (II),
а во втором способе праймеров
5'-ATGCAAAATTACTGT(AT)TGGGTAAA-3' (III)
и 5'-CTTTCAATGTTACAGAAAACTCTACAG-3' (II).

Согласно третьему способу реакцию проводят в два этапа: первый с использованием праймеров
5'-CAAACTCATCAGACGAG(CT)AGT-3' (I)
и 5'-CTTTCAATGTTACAGAAAACTCTACAG-3' (II)
и второй с использованием праймеров
5'-CTTTCAATGTTACAGAAAACTCTACAG-3' (II)
и 5'-ATGCAAAATTAСTGT(AT)TGGGTAAA-3' (III).

На каждом этапе проводят 32 цикла полимеразной цепной реакции, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС. Использование этих способов позволяет осуществить специфическое определение в пробе наличия хламидий независимо от вида, сочетания видов и присутствия родственных хламидиям видов. 3 с. и 3 з.п.ф-лы.

1. Способ диагностики хламидийной инфекции, включающий детекцию ДНК хламидий в исследуемом материале путем проведения одноэтапной полимеразой цепной реакции с использованием двух праймеров и матрицы в виде участка ДНК хламидий с получением амплификата и с последующим определением полученных продуктов амплификации, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют олигонуклеотид I:

и олигонуклеотид II:

2. Способ диагностики хламидийной инфекции по п.1, отличающийся тем, что проводят 32 цикла полимеразной цепной реакции, которые включают один цикл стадии денатураци 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС. 3. Способ диагностики хламидийной инфекции, включающий детекцию ДНК хламидий в исследуемом материале путем проведения одноэтапной полимеразной цепной реакции с использованием двух праймеров и матрицы в виде участка ДНК хламидий с получением амплификата и с последующим определением полученных продуктов амплификации, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют олигонуклеотид II

и олигонуклеотид III:

4. Способ диагностики хламидийной инфекции по п.3, отличающийся тем, что проводят 32 цикла полимеразной цепной реакции, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС. 5. Способ диагностики хламидийной инфекции, включающий детекцию ДНК хламидий с получением амплификата и с последующим определением полученных продуктов амплификации, отличающийся тем, что проводят двухэтапную полимеразную цепную реакцию, причем на ее первом этапе используют два внешних праймера в виде олигонуклеотида I

и олигонуклеотидa II

и матрицу в виде участка ДНК хламидий, а на втором этапе два внутренних праймера в виде олигонуклеотида II

и олигонуклеотида III

и матрицу в виде продукта амплификации, полученного на первом этапе, а определение продуктов амплификации осуществляют после проведения второго этапа полимеразной цепной реакции. 6. Способ диагностики хламидийной инфекции по п.5, отличающийся тем, что на обоих этапах проводят 32 цикла полимеразной цепной реакции, которые включают один цикл стадии денатурации 4 мин при 95^oС и стадии отжига 2 мин при 60^oС, 30 циклов стадии элонгации 1 мин при 72^oС, стадии денатурации 40 с при 95^oС и стадии отжига 30 с при 60^oС и один цикл стадии элонгации 4 мин при 72^oС.