ШТАММ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК NICOTIANA TABACUM (SV. SAMSUN) - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ К ФЕРРИТИНУ СЕЛЕЗЁНКИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК C12N5/04 C12P21/08 C12N5/04 C12R1/91 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к выращиванию суспензионной культуры Nicotiana tabacum (sv. Samsun), синтезирующей антитела к ферритину человека.

Ферритин является раковоасссоциированным антигеном чешуеклеточного рака головы и шеи, гепатоклеточного рака, лимфогранулематоза (болезни Ходжкина) и других злокачественных новообразований. Антитела антиферритиновой специфичности позволяют решать задачу адресованной доставки цитотоксических агентов к опухолевым клеткам. Ферритиновые антитела могут служить также диагностическим тестом при лимфомах, уровень ферритина коррелирует с массой опухоли. Определение ферритина в тканях необходимо при диагностике грудной карциномы, инфаркта миокарда, гемохроматоза (Hoefhagel С.A. Radionuclide therapy revisited. Eur J Nucl Med. 1991. V.18. N6. P.408-31). Трансгенные растения имеют ряд преимуществ как источник моноклональных антител по сравнению с клетками человека и животных, рекомбинантными микроорганизмами или трансгенными животными. Это возможность быстрого и дешевого масштабирования, эффективная технология трансформации, высокая степень безопасности процесса, поскольку растения не являются переносчиками заболеваний человека.

В настоящее время источником получения моноклональных антител к ферритину селезенки человека служат гибридомная линия F11, полученная в результате слияния клеток миеломы X63-Ag8.653 со спленоцитами мыши линии BALA/c, иммунизированной ферритином, который был выделен из селезенки человека (Лунев В.Е., Кошкин С.А., Лунева Н.М., Черкесова Т.С., Василесская И.А. Конференция “Современные направления создания медицинских диагностикумов”. Тез. докл. - М., 1990, с. 30).

Прототипом данного изобретения являются полученные нами трансгенные растения Nicotiana tabacum (sv. Samsun), синтезирующие антитела к ферритину селезенки человека. Исходные растения, содержащие ген вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антител к ферритину селезенки человека, слитого с белком барстар (внутриклеточного ингибитора бактериальной рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens) scFvF11-барстар, были получены методом агробактериальной трансформации листовых дисков, соответствующей генетической конструкцией. (Семенюк Е.Г., Орлова И.В., Стремовский О.А., Баландин Т.Г., Носов А.М., Бурьянов Я.И., Деев С.М. Трансгенные растения табака - продуценты мини-антител к ферритину человека. ДАН, 2002, - прототип).

Однако в интактных растениях - продуцентах моноклональных антител к ферритину - происходит частичный протеолиз конечного продукта. Кроме того, использование культуры клеток для получения рекомбинантного белка является более технологичным и экологически безопасным процессом.

Цель изобретения получение суспензионной культуры Nicotiana tabacum, синтезирующей антитела к ферритину человека. Эта цель решается получением быстрорастущего и продуктивного штамма культур клеток из трансгенных растений Nicotiana tabacum, способных расти в биореакторе и синтезировать антитела к ферритину селезенки человека.

Такой штамм был получен в результате работы, проведенной в ИБХ РАН и ИФР РАН, и депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур под номером 65.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная - получен в 2001 году из листовых эксплантов трансгенных растений табака, выращиваемых in vitro. Исходные растения, содержащие ген вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антител к ферритину селезенки человека, слитого с белком барстар (внутриклеточного ингибитора бактериальной рибонуклеазы барназы из Bacillus amyloliquefaciens) scFvF11-барстар (фиг. 1), были получены методом агробактериальной трансформации листовых дисков, соответствующей генетической конструкцией. (Семенюк Е.Г., Орлова И.В., Стремовский О.А., Баландин Т.Г., Носов А.М., Бурьянов Я.И., Деев С.М. Трансгенные растения табака - продуценты мини-антител к ферритину человека. ДАН, 2002).

Число пассажей к моменту паспортизации - 25.

Причина депонирования - продуцент.

Стандартные условия выращивания - температура 26°С, относительная влажность воздуха 70%, темнота, жидкая питательная среда (табл. 1), на качалке (скорость вращения 100 об/мин, радиус вращения 20 мм).

Сосуды для выращивания - конические плоскодонные колбы на 250-300 мл.

Объем среды в колбе 50 мл.

Кратность рассева - 5 мл инокулята на 50 мл среды, концентрация биомассы инокулята 15 г/л.

Время субкультивирования 15-20 дней.

Описание визуальных и цитологических наблюдений при стандартных условиях выращивания: среднеагрегированная, светло-серого цвета, к концу пассажа приобретает коричневый оттенок из-за выделяющихся в среду фенольных соединений.

Способность к морфогенезу при стандартных условиях выращивания отсутствует.

Название целевого продукта и характеристика его биосинтеза -моноклональные антитела к ферритину селезенки человека, слитые с белком барстар. Присутствие барстар обусловлено использованием реакции барстар-барназного взаимодействия для иммунохимического определения и очистки рекомбинантного белка из клеток растений. Наличие рекомбинантного белка в суспензионной культуре определяли с помощью Вестерн-блоттинга. Клетки суспензионной культуры гомогенизировали в буфере, содержащем 20мМ NaH₂PО₄/Na₂HPО₄ и 150мМ NaCl, рН 8 (PBS), 1% Triton X100 и 1мМ фенилметилсульфонилфторид, центрифугировали при 30000g в течение 15 мин при 4°С и отделяли общую фракцию растворимого белка. Белки разделяли в 12% ДСН-ПААГ и переносили на мембрану Immobilon-P. Для обнаружения scFvF 11-барстар использовали кроличьи поликлональные антитела к барстару и антикроличьи иммуноглобулины, коньюгированные с пероксидазой хрена.

Пероксидазную активность обнаруживали при помощи набора реактивов ECL ("Amersham").

Физиолого-биохимические признаки: длительность лаг-фазы составляет 2 суток, экспоненциальный рост длится до 14-х суток, на 14-16 сутки приходится фаза замедленного роста, 17-25 сутки стационарная фаза роста, в этот период суспензионная культура приобретает коричневый оттенок. Максимальная концентрация сухой биомассы 15-18 г/л. (Табл. 2)

Изобретательский уровень настоящего изобретения заключается в том, что получена суспензионная культура, синтезирующая моноклональные антитела к ферритину селезенки человека, в отличие от прототипа (интактных растений) в суспензионной культуре не происходит протеолиза рекомбинантного белка.

Штамм суспензионной культуры выращивали при 26°С в колбах на качалке. Состав питательной среды приведен в табл.1, продолжительность цикла выращивания 15-20 дней. Выделение рекомбинантного белка проводили нa 14-15 день к концу экспоненциальной фазы роста культуры. Аффинная очистка антител из трансгенных растений осуществлялась на колонке с Ni-NTA-сефарозой ("QIAGENE") с иммобилизованной барназой - His₆-tag. Белковый экстракт из клеток, полученный, как описано выше, пропускали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и наносили на колонку с иммобилизованной барназой (скорость потока 1 мл/мин). Для удаления примесей колонку промывали буфером PBS, содержащим 500мМ NaCl. Образовавшийся в результате барстар-барназного взаимодействия комплекс антитело-барстар барназа элюировали буфером PBS, содержащим 300 мМ имидазол, и использовали для Вестерн-блот анализа с антителами к барстару. Иммунодетекция продемонстрировала наличие в колоночном элюате одной полосы белка с молекулярной массой примерно 38 кДа, что соответствует полноразмерному белку, в отличие от двух полос в интактных растениях молекулярной массой 38 и 20 кДа, что соответствует полноразмерному и частично гидролизованному варианту антитела - барстар. (фиг. 2)

В результате настоящего изобретения получен штамм суспензионной культуры продуцент моноклональных антител к ферритину человека, который в отличие от прототипа (интактных растений табака с геном scFvF 11-барстар) синтезирует только полноразмерный ген и не образует гидролитического продукта.

Изобретение относится к иммунобиотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител. Штамм Nicotiana tabacum (sv. Samsun) F11B016 депонирован под номером ВККК №65, представляет собой быстрорастущую и продуктивную суспензионную культуру клеток из листовых эксплантов трансгенных растений Nicotiana tabacum. Штамм F11D016 способен расти в биореакторе и синтезировать антитела к ферритину селезенки человека, синтезирует только полноразмерный ген и не образует гидролитического продукта. Использование изобретения повышает технологичность получения антител, а процесс получения экологически безопасен. 2 ил., 2 табл.

Штамм суспензионной культуры растительных клеток Nicotiana tabacum L. (sv. Samsun), ВККК № 65, продуцент рекомбинантных антител к ферритину селезенки человека.