СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ СОЛЕЙ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/00 

Область техники

Изобретение относится к способам исследования и анализа материалов с помощью оптических средств, в частности систем, в которых материал вступает в химическую реакцию, путем наблюдения за действием химического индикатора, в мутных растворах. Изобретение может быть использовано для определения лимонной кислоты и ее солей - цитратов в веществах растительного, биологического, минерального, синтетического происхождения, а также в пищевых продуктах и лекарственных препаратах. Изобретение позволяет обнаруживать и определять концентрацию в растворе любых веществ, содержащих анион лимонной кислоты, то есть как саму лимонную кислоту, так и любые ее соли.

В частности, способ может быть использован для определения лимонной кислоты и цитратов в соках и молочном сырье, а также для анализа других объектов в пищевой промышленности с целью контроля качества и выявления фальсификации продуктов, при анализе промышленных стоков и коммерческих образцов лимонной кислоты и цитратов.

Уровень техники

Известен способ определения лимонной кислоты и цитратов ферментативным методом (IFJU-Analyses, 1985, №22, р.1-5), который включает отбор пробы, обработку ее химическими и ферментативными реактивами, измерение оптической плотности пробы до и после ее обработки реактивами на длине волны 340+/-20 нм. Затем рассчитывают содержание лимонной кислоты и цитратов исходя из разности оптической плотности пробы до и после обработки.

Способу присущи высокая селективность, скорость анализа, точность и низкий предел обнаружения (50 мг/л). Однако в рамках ферментативного метода необходимо использовать дорогостоящие реактивы, лиофилизированные ферменты и ко-ферменты, имеющие высокую стоимость и небольшой, ограниченный срок хранения.

Ферментативный способ определения имеет существенные ограничения, связанные с окраской анализируемой пробы, поскольку измерение проводится в ультрафиолетовой области спектра. Его применение невозможно для сильноокрашенных соков с невысоким природным содержанием лимонной кислоты и цитратов, таких как сок вишневый, сок черноплодной рябины, сок черешни.

Кроме того, ограничения применения ферментативного способа связаны также с рН (активной кислотностью) анализируемой пробы, поскольку ферменты работают устойчиво лишь в очень узких интервалах рН. Использование сильнокислых (рН менее 2) или сильнощелочных проб (рН более 10) без их предварительной обработки в рамках ферментативного способа невозможно.

Известен также способ хроматографического определения лимонной кислоты и цитратов (IFJU-Analyses, 1987, №23, р.1-3). Несмотря на то, что способ имеет высокую чуствительность, он требует применения дорогостоящего хроматографического оборудования и обязательной процедуры пробоподготовки, вносящей основную погрешность в достигаемые этим способом результаты,

Наиболее близким аналогом является способ обнаружения лимонной кислоты и цитратов (см. SU 907425 А, МПК G 01 N 33/00, опубл. 25.02.1982), используемый для выявления фальсификации сокового и молочного сырья лимонной кислотой. Способ включает отбор пробы исследуемого сырья, ее осветление с помощью введения щелочи и активированного угля, последовательную обработку серной кислотой, бромидом калия, перманганатом калия. Данная обработка по своей сути является окислительным бромированием лимонной кислоты и ее анионов(цитратов), переводящим ее в пентабромацетон, растворение его в гексане, извлечение пентабромацетона и взвешивание его с пересчетом в количество лимонной кислоты, т.е. по сути гравиметрический анализ.

Известный способ трудоемок и не обладает достаточной точностью, кроме того имеет высокий предел обнаружения.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является разработка способа определения концентрации лимонной кислоты и любых цитратов в различных природных и искусственных объектах. Известно, что цитраты являются солями лимонной кислоты. Данный способ позволяет определять суммарную концентрацию любых соединений, содержащих анион лимонной кислоты, в т.ч. и саму лимонную кислоту.

При осуществлении изобретения могут быть получены следующие технические результаты: ускорение определения концентрации цитратов (лимонной кислоты и ее солей), повышение точности и снижение предела обнаружения цитратов, исключение применения вредных или дорогостоящих химических реактивов, расширение области применения способа, снижение стоимости и повышение экспрессности анализа.

Указанные технические результаты достигаются тем, что в способе обнаружения цитратов, то есть лимонной кислоты и ее солей, включающем отбор пробы, ее окислительное бромирование, для осуществления которого к пробе последовательно добавляют серную кислоту, бромистый калий и перманганат калия и определение в полученном растворе содержания цитратов, в том числе лимонной кислоты, что после окислительного бромирования в пробу добавляют избыток восстановителя для связывания всего оставшегося в пробе после окислительного бромирования окислителя. Затем измеряют по крайней мере одно оптическое свойство пробы, а содержание цитратов С_цит определяют по формуле

С_цит = К·Е,

где Е - оптическое свойство пробы;

К - калибровочный коэффициент, определяемый путем калибровки прибора по стандартным образцам с известным содержанием цитратов. Причем калибровка может осуществляться графически или расчетным путем.

В качестве оптического свойства пробы преимущественно измеряют характеристики пропускания и/или поглощения, и/или рассеяния, и/или отражения электромагнитного излучения, и/или их соотношения.

В качестве восстановителя целесообразно использовать вещества со стандартным электродным потенциалом восстановления Е⁰ менее 1 В.

В качестве вещества со стандартным электродным потенциалом восстановления Е⁰ менее 1 В используют соль Мора, и/или аскорбиновую кислоту, и/или сульфит натрия, и/или гидроксиламинсульфат, и/или нитрит натрия, и/или гексацианоферрат калия, и/или их смеси.

В качестве пробы преимущественно используют вещества растительного или биологического, или минерального, или синтетического происхождения, или пищевые продукты, или лекарственные препараты.

В качестве вещества растительного происхождения преимущественно используют плоды, или ягоды, или фрагменты растительных объектов, или соки, или сокосодержащие смеси, или продукты переработки растительного сырья.

В качестве вещества биологического происхождения преимущественно используют кровь, мочу, слюну, спинно-мозговую жидкость, молоко, жировую ткань или иные выделения живых организмов, или их фрагменты, или продукты их переработки.

В качестве вещества минерального происхождения преимущественно используют почву, или горные породы, или отложения, или соли, или воду.

В качестве вещества синтетического происхождения используют синтетические моющие средства, или удобрения, или сточные воды.

В качестве пищевых продуктов преимущественно используют мясные, или хлебобулочные, или молочные, или кондитерские, или консервированные продукты, или безалкогольные напитки, или пиво, или алкогольные напитки, или вина.

В качестве характеристики пропускания целесообразно измерять коэффициент пропускания или интенсивность прошедшего через пробу электромагнитного излучения.

В качестве характеристики поглощения целесообразно измерять соотношение интенсивностей падающего и прошедшего через пробу электромагнитного излучения, или оптическую плотность, или коэффициент поглощения, или их соотношения.

В качестве характеристики рассеяния целесообразно измерять коэффициент яркости, или интенсивность рассеянного излучения, или их соотношения.

В качестве характеристики отражения целесообразно измерять интенсивность отраженного электромагнитного излучения.

При определении содержания цитратов целесообразно в качестве оптического свойства пробы использовать соотношения оптических характеристик пробы или математические функции, содержащие эти характеристики в качестве параметров и/или переменных.

Для повышения точности и снижения предела обнаружения могут быть использованы соотношения коэффициента пропускания к коэффициенту рассеяния, или коэффициента отражения к коэффициенту рассеяния, или квадратный трехчлен, содержащий в качестве переменной коэффициент пропускания, в качестве независимого параметра - коэффициент рассеяния, в качестве параметра при переменной первой степени - коэффициент отражения, в качестве параметра при переменной второй степени - коэффициент поглощения.

В качестве окислителя целесообразно применять вещества, имеющие Е⁰ более 1,1 В.

В качестве вещества, имеющего Е⁰ более 1,1 В, преимущественно используют иодаты металлов, и/или хроматы металлов, и/или бихроматы металлов, и/или соли четырехвалентного церия, и/или двуокись свинца, и/или перекись водорода, и/или персульфаты металлов, и/или хлораты металлов, и/или броматы металлов в кислой среде.

Отбор пробы производится любым стандартным методом, обеспечивающим погрешность отбора пробы не более 0,05% по массе или 0,1% по объему.

Осветление пробы, в случае необходимости, производится центрифугированием, и/или с применением стандартных осветляющих агентов, например гексацианоферрата калия, сульфата цинка, поливинилпирролидона, и/или фильтрованием через сорбенты, например активированный уголь, катионитные ионообменные смолы, окись алюминия, силикагель.

В случае необходимости при низком содержании цитратов в пробе ее целесообразно пропускать через анионообменную смолу любой известной марки, таким образом осаждая цитраты на смоле, а затем элюировать меньшим объемом сильной неорганической кислоты, таким образом концентрируя пробу по отношению к содержанию в ней цитратов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Способ обнаружения и определения концентрации цитратов, то есть лимонной кислоты и ее солей, основан на окислительном бромировании цитратов, приводящем к пентабромацетону в качестве конечного продукта реакции.

Благодаря тому, что пентабромацетон нерастворим в воде и в указанных условиях образует устойчивые коллоидные растворы белого цвета, путем измерения любой характеристики оптических свойств его коллоидных растворов можно определить суммарное количество цитратов, лимонной кислоты и ее солей в пробе. Способ позволяет обнаруживать и определять концентрацию в растворе любых веществ, содержащих анион лимонной кислоты, то есть как саму лимонную кислоту, так и любые ее соли.

Реакция образования пентабромацетона является исключительно селективной на цитраты и лимонную кислоту, при этом сахароза, глюкоза, фруктоза, лактоза, галактоза, декстроза, яблочная, винная, аскорбиновая, щавелевая, малоновая, фумаровая, малеиновая, адипиновая и прочие органические пищевые кислоты или их соли не мешают определению цитратов или лимонной кислоты при их присутствии в любых количествах, что проверено экспериментально методом внутренних стандартов.

Окислительное бромирование любых иных пищевых компонентов не приводит к пентабромацетону в качестве конечного или промежуточного продукта реакции, поэтому возможно применение избыточных количеств сильных окислителей, стандартный электродный потенциал восстановления которых (Е₀) превышает 1,1 В (потенциал восстановления брома), например перекиси водорода в кислой среде, и/или персульфатов металлов в кислой среде, и/или двуокиси свинца в кислой среде, и/или бихроматов, и/или хроматов, и/или хлоратов, и/или броматов, и/или иодатов металлов в кислой среде.

Избыток восстановителя добавляется для того, чтобы удалить окислитель, мешающий определению. После добавления восстановителя получается бесцветная или слабоокрашенная устойчивая суспензия пентабромацетона в количестве, строго пропорциональном количеству цитратов в пробе, что позволяет использовать любую характеристику оптических свойств обработанной пробы для калибровки соответствующего прибора.

Изобретение осуществляется следующим образом.

1. Подготовка пробы

Для подготовки пробы к анализу образцы сокового сырья предварительно фильтруют и/или центрифугируют, удаляя мякоть. Мутные образцы (например, апельсиновый сок) обрабатывают концентрированными реактивами Карреза (равные объемы 2-4% растворов сульфата цинка и гексацианоферрата калия в воде в соотношении 1:2 к испытуемой пробе по объему) по обычной методике осветления, известной для молочных продуктов ("Методы анализа чужеродных веществ в пищевых продуктах", РГК СЭН РФ, M., 1994, методика определения патулина, с.34). Также поступают с жидкими молочными продуктами, такими как молоко, кефир, ряженка. Твердые пробы (почва, горные породы, отложения, минералы пищевые продукты - колбасы, хлеб, сыр, мясо и т.д.) предварительно измельчают и затем кипятят с 10-кратным по весу количеством 0,1 н. гидроксида натрия, что позволяет извлечь цитраты в раствор.

Прозрачные жидкости, например моча, используют без пробоподготовки.

Непрозрачные жидкости, в частности кровь, фильтруют через слой силикагеля.

Если содержание белков в пробе не превышает 2%, возможно использование пробы без осветления. Для больших количеств белка требуется либо его удаление из пробы, либо увеличение количеств окислителя/восстановителя в 2-8 раз по отношению к обычно используемому, что позволяет обойтись без их удаления. В случае концентрации белка выше 12% проводят увеличение количеств окислителя и восстановителя по отношению к обычно используемому в 10-15 раз, одновременно проводя все операции при повышенной температуре от 50 до 90°С. Измерение концентрации цитратов в этом случае проводят после охлаждения пробы.

2. Определение цитратов - лимонной кислоты и ее солей

В кювету фотометра толщиной 1-5 см приливают 1,0-2,0 мл пробы исследуемого сока 20-40 г/100 мл с содержанием сухих растворимых веществ не более 10-20 Вх и 1,0-2,0 мл дистиллированной воды. Затем приливают 0,2-0,5 мл 30-50% серной кислоты и 0,2-0,5 мл 20-40% раствора бромида калия.

Затем приливают при перемешивании 0,5-1,0 мл 2-5% раствора перманганата калия. После выдержки в течение 1-5 минут приливают 0,5-1,0 мл 0,1-1 н. раствора восстановителя, например соли Мора и/или 0,5-2,0 мл 1-5% раствора аскорбиновой кислоты.

Раствор практически полностью должен обесцветиться (допускается слабая окраска).

Затем измеряют оптическую плотность полученного раствора на длине волны 300-10000 нм. В области коротковолнового излучения (до 500 нм) выше чувствительность и ниже предел обнаружения цитратов, однако мешающее влияние оказывает окраска ионов меди, хрома, никеля или кобальта, которая несколько снижает точность определения. Использование электромагнитного излучения с длиной волны более 800 нм позволяет избавиться от мешающего влияния окраски этих ионов.

Полученное значение оптической плотности умножают на калибровочный коэффициент, полученный при калибровке конкретного фотометра по серии стандартных растворов лимонной кислоты и/или цитратов и рассчитывают количество цитратов, в частности, лимонной кислоты в образце в г/л, и/или в г/кг, и/или в %.

Вместо оптической плотности можно использовать любые другие характеристики оптических свойств пробы, например коэффициент яркости, мутность (в единицах NTU, FTU, мг/л по каолину или любых других), коэффициент пропускания, интенсивность рассеянного под различным углом электромагнитного излучения или любые другие. Обязательно в каждом случае проводят, так называемый холостой опыт, вместо пробы взяв дистиллированную воду.

Предлагаемым способом были проанализированы семь образцов яблочных соков, при этом различия между "нормальными" образцами, содержащими (0,05-0,2 г/л) цитратов (лимонной кислоты) и "фальсификациями" с содержанием цитратов более 0,5 г/л (500 г/т) видны невооруженным глазом по степени мутности раствора, т.е. даже без использования каких-либо приборов.

В таблице представлены данные анализа на содержание лимонной кислоты семи образцов яблочных соков ферментативным и предлагаемым неферментативным способом.

Предел обнаружения - 20-50 мг/л цитратов или лимонной кислоты в анализируемом растворе, что соответствует Е₉₀₀=0,030-0,065 для кюветы толщиной 1 см. При увеличении толщины кюветы (например, до 5 см) точность и чуствительность способа пропорционально возрастают. То же происходит при уменьшении длины волны используемого электромагнитного излучения или при предварительном концентрировании пробы упариванием или пропусканием через анионообменную смолу. Воспроизводимость способа 1-3%. Точность 1-5%.

Возможно использование предложенного способа для проведения экспрессного качественного контроля фальсификации сока.

Например, после обработки пробы яблочного сока реактивами согласно предложенному способу значение оптической плотности на длине волны, например 800-900 нм, не должно превышать 0,05-0,15, что соответствует легкой замутненности пробы. Это соответствует нормальному яблочному соку. Большая мутность пробы сразу указывает на фальсификацию яблочного сока лимонной кислотой или цитратами.

Описываемый способ обладает следующими преимуществами.

В отличие от существующих методов предлагаемый метод совершенно не требует сложной процедуры пробоподготовки, измерение проводится напрямую в пробе, в случае необходимости для повышения точности результатов анализа можно использовать любые известные процедуры осветления пробы.

Все реакции происходят непосредственно в кювете (ячейке) измерительного прибора, что ускоряет процесс и делает его более дешевым и безопасным по сравнению с методиками, известными на сегодняшний день.

Точность метода не уступает ферментативным и/или хроматографическим методам измерения лимонной кислоты при существенно более низкой стоимости определения. Различия между фальсифицированным и нефальсифицированным сырьем, например яблочным соком, хорошо заметны невооруженным глазом, т.е. без использования каких-либо измерительных приборов, что делает методику удобной даже в полевых условиях.

Изобретение относится к способам исследования и анализа материалов и может быть использовано для определения содержания лимонной кислоты и ее солей в растворе веществ различной природы. Способ предусматривает отбор пробы, ее окислительное бромирование. После этого в пробу добавляют избыток восстановителя. Измеряют значение, по крайней мере, одной оптической характеристики пробы, по которому судят о наличии лимонной кислоты и ее солей. Количество лимонной кислоты и ее солей определяют путем умножения измеренного значения оптической характеристики пробы на калибровочный коэффициент прибора. Изобретение позволяет повысить универсальность способа и его точность. 16 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ обнаружения и определения количества лимонной кислоты и ее солей, включающий отбор пробы, ее окислительное бромирование и определение количества лимонной кислоты и ее солей, отличающийся тем, что после окислительного бромирования в пробу добавляют избыток восстановителя, измеряют значение, по крайней мере, одной оптической характеристики пробы, по которому судят о наличии лимонной кислоты и ее солей, а количество лимонной кислоты и ее солей определяют путем умножения измеренного значения оптической характеристики пробы на калибровочный коэффициент прибора.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при измерении оптической характеристики пробы измеряют пропускание, и/или поглощение, и/или рассеяние, и/или отражение электромагнитного излучения, и/или их соотношения.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при измерении пропускания измеряют коэффициент пропускания или интенсивность прошедшего через пробу электромагнитного излучения.4. Способ по п.2, отличающийся тем, что при измерении поглощения измеряют соотношение интенсивностей падающего и прошедшего через пробу электромагнитного излучения, или оптическую плотность, или коэффициент поглощения, или их соотношения.5. Способ по п.2, отличающийся тем, что при измерении рассеяния измеряют коэффициент яркости, или интенсивность рассеянного излучения, или их соотношения.6. Способ по п.2, отличающийся тем, что при измерении отражения измеряют интенсивность отраженного электромагнитного излучения.7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что в качестве восстановителя используют вещества со стандартным, электродным потенциалом восстановления Е⁰ менее 1 В.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве вещества со стандартным электродным потенциалом восстановления Е⁰ менее 1 В используют соль Мора, и/или аскорбиновую кислоту, и/или сульфит натрия, и/или гидроксиламинсульфат, и/или нитрит натрия, и/или гексацианоферрат калия, и/или их смеси.9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что в качестве пробы используют вещества растительного, или биологического, или минерального, или синтетического происхождения, или пищевые продукты, или лекарственные препараты.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве вещества растительного происхождения используют плоды, или ягоды, или фрагменты растительных объектов, или соки, или сокосодержащие смеси, или продукты переработки растительного сырья.11. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве вещества биологического происхождения используют кровь, мочу, слюну, спинномозговую жидкость, молоко, жировую ткань, или иные выделения живых организмов, или их фрагменты, или продукты их переработки.12. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве вещества минерального происхождения используют почву, или горные породы, или отложения, или соли, или воду.13. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве вещества синтетического происхождения используют синтетические моющие средства или удобрения.14. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве пищевых продуктов используют мясные, или хлебобулочные, или молочные, или кондитерские, или консервированные продукты, или безалкогольные напитки, или пиво, или алкогольные напитки, или вина.15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что при определении содержания лимонной кислоты и ее солей в качестве оптической характеристики пробы используют соотношения оптических характеристик пробы или математические функции, содержащие эти характеристики, в качестве параметров и/или переменных.16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют вещества, имеющие Е⁰ более 1,1 В.17. Способ по п.16, отличающийся тем, что в качестве вещества, имеющего Е⁰ более 1,1 В используют иодаты металлов, и/или хроматы металлов, и/или бихроматы металлов, и/или соли четырехвалентного церия, и/или двуокись свинца, и/или перекись водорода, и/или персульфаты металлов, и/или хлораты металлов, и/или броматы металлов в кислой среде.