СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИПОВ КЛЕТОЧНОЙ РЕАКТИВНОСТИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/49 G01N33/50 G01N33/74 

Изобретение относится к области медицины, а именно к физиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики типа клеточной реактивности у детей.

Известными и наиболее близкими к предлагаемому способу являются исследования в области физиологии, посвященные изучению динамического постоянства внутренней среды организма (гомеостаза). С помощью ряда функциональных проб (ацетилхолиновой, адреналиновой, мезатоновой и других) изучались нервные и гуморально-гормональные взаимосвязи функционирования вегетативной нервной системы преимущественно на системном, органном уровнях организации биосистемы [2, 3, 4]. Общеизвестно, что гомеостаз организма обеспечивается четко согласованной работой всех биологических уровней биосистемы, включая клеточно-молекулярный. Однако известные способы недостаточно информативны.

Большинство же работ в области клинической мембранологии касаются в первую очередь изучения молекулярной структуры клетки и механизмов регуляции клеточных реакций в так называемых “стационарных условиях”, когда исследуется внутренняя среда клетки в спокойном состоянии, без применения возмущающих факторов, которым постоянно подвергается живая клетка, являясь частью многоклеточного организма [1, 5]. Имеющиеся немногочисленные работы исследуют изолированно воздействие различных биорегуляторов на разные модели клеток [2, 3]. Нет комплексных исследований, что делает невозможным оценить регуляторные возможности организма на клеточном уровне и определить границы гомеостаза в рамках клетки, выход за которые влечет за собой возникновение дизадаптивных процессов и развитие патологического состояния. Чрезвычайно актуальным является это в детском возрасте.

Задачей изобретения является повышение информативности способа определения типов клеточной реактивности у детей.

Сущность способа заключается в использовании ряда функциональных проб. При этом функциональные пробы в виде препаратов ацетилхолина, адреналина и дексаметазона вводят в физиологических дозах в суспензию мембран эритроцитов in vitro и определяют тип клеточной реактивности по уровню хлортетрациклиновой зондовой спектроскопии мембран эритроцитов: холинергический тип клеточной реактивности, когда клеточные структуры находятся в состоянии стабильности, - при преобладающей реакции клетки на ацетилхолин;

холин-адренергический синергизм, характеризующийся достаточно высокой прочностью физиологических механизмов регуляции, обеспечивающих устойчивость к экстремальным воздействиям, - при высокой чувствительности мембран на все препараты;

адренергический тип, когда преобладает реактивность симпатического отдела вегетативной нервной системы и относительная слабость парасимпатического отдела, сопровождающаяся лабильностью регуляторных механизмов, - при повышенной реакции на адреналин и дексаметазон;

гипосинергизм холин-адренергического типа, характеризующийся слабостью физиологических механизмов регуляции, - при сниженной реактивности на все препараты.

Способ осуществляют следующим образом.

Предварительно готовят рабочие растворы.

Хлортетрациклин: используют фармакологический препарат хлортетрациклин гидрохлорид, содержащий в одной капсуле 0,1 г вещества. Растворяют 10 мг препарата в 1 мл физиологического раствора (основной раствор). К 10 мкл основного раствора добавляют 10 мл физиологического раствора (рабочий раствор). Раствор содержит 10 мкг хлортетрациклина в 1 мл.

Дексаметазон: используют ампульный фармакологический препарат дексаметазон в, содержащий 4 мг вещества в 1 мл - основной раствор. К основному раствору добавляют 4 мл 96% спирта (рабочий раствор).

Адреналин: используют ампульный фармакологический препарат 0,1% раствор адреналина гидрохлорида 1 мл. К 0,1 мл ампульного препарата добавляют 10 мл физиологического раствора (рабочий раствор).

Ацетилхолин: используют фармакологический препарат ацетилхолин хлорид, содержащий в 1 ампуле 200 мг. К 200 мг добавляют 5 мл физиологического раствора (основной раствор). К 50 мкл основного раствора добавляют 5 мл физиологического раствора (рабочий раствор).

Готовят суспензию мембран эритроцитов.

Отбирают пробу замороженных эритроцитов объемом 65 мкл, полученную из цельной венозной крови путем 3-кратного отмывания физиологическим раствором. По методу Доджа проводят выделение мембран эритроцитов, добавляют 2 мл 0,9% физиологического раствора и получают суспензию мембран эритроцитов. Для определения кинетики зонда хлортетрациклина используют известную методику Владимирова Ю.А., Добрецова Г.Е [1].

Для определения кинетики взаимодействия мембран эритроцитов с препаратами берут из пробы суспензии мембран эритроцитов по 50 мкл в каждую из 3-х пробирок. Затем в каждую пробу вводят один из следующих препаратов в дозах, соответствующих их физиологическим концентрациям в крови у детей - 10 мкл рабочего раствора ацетилхолина, 10 мкл рабочего раствора дексаметазона, 5 мкл рабочего раствора адреналина. После 30-минутной инкубации (для обеспечения оптимального взаимодействия растворов) в каждой пробе измеряют исходный уровень флуоресценции при длине волны флуоресценции 400 нм и длине волны возбуждения 360 нм. Затем в каждую пробу вводят зонд хлортетрациклина (10 мкл) и замеряют флуоресценцию в течение 30 минут с интервалом через 30 секунд. Замер производят на флуориметре, например MPF - 4 марки "Hitachi", в стеклянной кювете при комнатной температуре с обеспечением стабильной диффузии. Далее для каждой пробы вычисляют скорость включения биорегуляторов по следующей формуле:

V включ.= (F пик-F нач.)/Т пик.фл.,

где V включ. - усл.ед./мин;

F пик - показатель пика флуоресценции, усл.ед.;

F нач. - показатель начальной флуоресценции, усл.ед.;

Т пик.фл - показатель времени достижения пика флуоресценции, мин.

Клинические наблюдения.

Обследовано 89 учащихся в возрасте от 7 до 15 лет. Предварительно проведено расширенное сомато-неврологическое обследование каждого учащегося с оценкой состояния вегетативного гомеостаза. Дети на момент обследования были клинически чдоровы. имели средние показатели физического и полового развития.

Анализ результатов позволил выделить группы ребят с различной чувствительностью мембран к биорегуляторам.

1 группа: условно называемый "холинергический" тип клеточной реактивности. Он характеризуется преобладающей реакцией клетки на ацетилхолин и характеризуется следующими показателями: АЦХ пик (усл.ед.) 32,196+0,413; АЦХ скорость (усл.ед./мин) 1,045+0,087; АДР пик (усл.ед.) 24,444+0,748; АДР скорость (усл.ед./мин) 0,422+0,033; ДЕКСАМЕТ пик (усл.ед.) 25,303+0,47; ДЕКСАМЕТ скорость (усл.ед./мин).По изученным тестам к этому типу относится 33 (40,54%) детей. Адекватное повышение тонуса клеточной холинергической регуляции является мощным адаптационным фактором стресс-лимитирующей защиты, что позволяет клеточным структурам находиться в состоянии стабильности.

2 группа: тип "холин-адренергический синергизм". Он проявляется адекватно высокой чувствительностью мембраны на все биорегуляторы: АЦХ пик (усл.ед.) 31,555+0,505; Ацх скорость (усл.ед./мин) 1,071+ 0,063; АДР пик (усл.ед.) 32,772+0,777; АДР скорость (усл.ед./мин) 1,048+0,073; ДЕКСАМЕТ пик (усл.ед.) 31,259+0,525; ДЕКСАМЕТ скорость (усл.ед./мин) 1,148+0.059 и характеризуется одинаково устойчивой реактивностью обоих отделов вегетативной системы; что расценивалось нами как достаточно высокая прочность физиологических механизмов регуляции, обеспечивающих устойчивость к экстремальным воздействиям. К этой группе отнесены 27 (27,02%) детей.

3 группа: тип "адренергический". Он характеризуетсяся повышенной реакцией на адреналин и дексаметазон: АЦХ пик (усл.ед.) 24,47+0,493; АДР пик (усл.ед.) 30,382+0,292; АДР скорость (усл.ед./мин) 0,854+0,033; ДЕКСАМЕТ пик (усл.ед.) 31,859+0,758; ДЕКСАМЕТ скорость (усл.ед./мин) 1,032+0.039. Это расценивалось нами как преобладание реактивности симпатического отдела вегетативной нервной системы и относительной слабостью парасимпатического отдела и сопровождается лабильностью регуляторных механизмов. Эту группу составляют 17 (21,62%) детей.

4 группа: условно названный "гипосинергизм холин-адренергического" типа. Он проявляется сниженной реактивностью на все биорегуляторы: АЦХ пик (усл.ед.) 25,416+0,599; АЦХ скорость (усл.ед./мин) 0,306+0,028; АДР пик (усл.ед.) 24,291+0,601; АДР скорость (усл.ед./мин) 0,285+0,031; ДЕКСАМЕТ пик (усл.ед.) 24,375+0,981; ДЕКСАМЕТ скорость (усл.ед./мин) 0,346+0,025. Данный тип характеризуется слабостью физиологических механизмов регуляции. К этой группе отнесены 12 (10,82%) детей.

Пример 1. Танеев С., 8 лет.

Утром натощак у пациента берут венозную кровь в количестве 3 мл, отмывают эритроциты, выделяют мембраны эритроцитов и получают суспензию мембран эритроцитов выше указанным способом. Затем готовят 3 пробы:

1 проба - берут 50 мкл суспензии мембран эритроцитов и добавляют 10 мкл рабочего раствора ацетилхолина, инкубируют в течение 30 минут. Затем пробу помещают в стеклянную кювету и ставят во флуориметр. Замеряют исходную флуоресценцию, после чего к пробе добавляют 10 мкл рабочего раствора зонда хлортетрациклина и производят замер величин флуоресценции. Определяют величину максимальной флуоресценции (ФЛ пик., усл.ед.) и время достижения максимальной флуоресценции, далее вычисляют по указанной выше формуле скорость включения биорегулятора (V включ. усл.ед./мин). Результаты исследования: ФЛ АЦХ пик 32,19 усл.ед., V включен. АЦХ 1,045 усл.ед./мин.

2 проба - берут 50 мкл суспензии мембран эритроцитов и добавляют 5 мкл рабочего раствора адреналина (АДР). Далее делают по схеме, изложенной при описании 1 пробы. Результаты исследования: ФЛ АДР пик 24,44 усл.ед., V включен. АДР 0,422 усл.ед./мин.

3 проба - берут 50 мкл суспензии мембран эритроцитов и добавляют 10 мкл рабочего раствора дексаметазона (ДМЗ). Затем делают по схеме, изложенной при описании 1 пробы. Результаты исследования: ФЛ ДМЗ пик. 25,30 усл.ед., V включен. ДМЗ 0,435 усл.ед./мин.

Анализ показывает, что у данного пациента высокие показатели пика флуоресценции на АЦХ и скорости включения АЦХ в сравнении с величинами аналогичных параметров на адреналин и дексаметазон. Преобладает реакция клетки на ацетилхолин. Данный тип клеточной реактивности условно отнесен к “холинергическому”. К этому типу относится 33 (40,54%) детей. Адекватное повышение тонуса клеточной холинергической регуляции является мощньм адаптационным фактором стресс-лимитирующей защиты, что позволяет клеточным структурам находиться в состоянии стабильности.

Пример 2. Раменская М., 12 лет.

Подготовка к работе и методика проведения флуоресцентного зондирования мембран производилась аналогичным способом, изложенным выше (пример 1).

1 проба. Результаты исследования: ФЛ АЦХ пик 31,55 усл.ед., V включен. АЦХ 1,071 усл.ед./мин.

2 проба. Результаты исследования: ФЛ АДР пик 32,77 усл.ед., V включен. АДР 1,048усл.ед./мин.

3 проба. Результаты исследования: ФЛ ДМЗ пик 31,25 усл.ед., V включен. ДМЗ 1,148 усл.ед./мин.

Анализ данных свидетельствует, что во всех исследованиях получены относительно высокие показатели по исследуемым параметрам. Это указывает на оптимальную чувствительность мембран к биорегуляторам у данного пациента, и характеризует равновесное состояние обоих отделов вегетативной системы; что осценивается как достаточно высокая прочность физиологических механизмов регуляции, обеспечивающих устойчивость к экстремальным воздействиям. Данный тип клеточной реактивности условно был назван “холин-адренергический синергизм”. Эту группу составили 27 (27,02%) детей.

Пример 3. Семенова Н., 14 лет.

Подготовка к работе и методика проведения флуоресцентного зондирования мембран производилась аналогичным способом, изложенным выше (пример 1).

1 проба. Результаты исследования: ФЛ АЦХ пик 24,47 усл.ед., V включен. АЦХ 0,405 усл.ед./мин.

2 проба. Результаты исследования: ФЛ АДР пик 30,38 усл.ед., V включен. АДР 0,854 усл.ед./мин.

3 проба. Результаты исследования: ФЛ ДМЗ пик 31,85 усл.ед., V включен. ДМЗ 1,032 усл.ед./мин.

Анализ результатов показывает, что высокие параметры исследуемых показателей были на адреналин и дексаметазон, что отражает высокую реактивность клеточных мембран на “стрессорные” гормоны. Этот тип клеточной реактивности был условно назван "адренергическим". При этом преобладание реактивности симпатического отдела вегетативной нервной системы и относительная слабость парасимпатического отдела является свидетельством лабильности регуляторных механизмов. Эту группу составляют 17 (21,62%) детей.

Пример 4. Голубев Т., 13 лет.

Подготовка к работе и методика проведения флуоресцентного зондирования мембран аналогичны изложенным выше (пример 1).

1 проба. Результаты исследования: ФЛ АЦХ пик 25,41 усл.ед., V включен. АЦХ 0,306 усл.ед./мин.

2 проба. Результаты исследования: ФЛ АДР пик 24,29 усл.ед., V включен. АДР 0,285 усл.ед./мин.

3 проба. Результаты исследования: ФЛ ДМЗ пик 24,37 усл.ед., V включен. ДМЗ 0,346 усл.ед./мин.

Анализ данных свидетельствует о том, что все величины полученных параметров невысоки, что является отражением пониженной реактивности клетки на все биорегуляторы. Этот тип условно назван "гипосинергизм холин-адренергический" и отражает слабость физиологических механизмов регуляции. Эту группу составили 12 (10,82%) детей.

Таким образом, выявлена различная ответная реакция мембран клетки на действие биорегуляторов вегетативной нервной системы, что позволило установить функциональные типы клеточной реактивности у детей. Выявленные типы клеточной реактивности характеризуют состояние регуляторных механизмов на уровне клетки, резервные и потенциальные возможности, что необходимо для большей объективизации оценки индивидуального здоровья и формирования его в онтогенезе. Способ определения типов клеточной реактивности позволяет устанавливать границы гомеостаза на клеточно-молекулярном уровне и диагностировать донозологическую стадию вегетативных нарушений. Предлагаемый способ обеспечивает возможность нормативной оценки эффективности работы клеточно-молекулярной подсистемы, качественного и количественного выражения “физиологической цены”, вносимой данной подсистемой за полезный приспособительный результат.

Результат от использования предлагаемого способа диагностики типов клеточной реактивности заключается в следующем:

1. Позволяет объективно определить тип клеточной реактивности.

2. Позволяет прогнозировать потенциальные возможности организма.

3. Позволяет прогнозировать формирование индивидуального здоровья в онтогенезе.

4. Позволяет прогнозировать и диагностировать донозологическую стадию вегетативной патологии.

Источники информации

1. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флюоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. - М.: Наука, 1980. - 320 с.

2. Голиков П.П. Рецепторные механизмы глюкокортикоидного эффекта. - М.: Медицина, 1988. - 281с.

3. Кассиль Г.Н. Внутренняя среда организма. - М.: Наука, 1983. – 227 с.

4. Лыкасов А.Г. Роль мембраносвязанных факторов в организме и взаимосвязи их с вегетативньм тонусом и реактивностью в формировании здоровья детей: Автореф...дис.кан.мед.наук. - Тюмень, 1991.

5. Чурин К.В., Янушкене Т.С., Кузнецов С.Р. Мембранно-связанный кальций тромбоцитов при эссенциальной гипертензии// Терапевт. арх. - 1991. - № 6. - С. 96-99.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам исследований. Сущность способа: в суспензию мембран эритроцитов in vitro вводят в физиологических дозах функциональные пробы в виде препаратов ацетилхолина, адреналина и дексаметазона, проводят хлортетрациклиновую зондовую флуоресцентную спектроскопию мембран и определяют: при преобладающей реакции клетки на ацетилхолин - холинергический тип клеточной реактивности, когда клеточные структуры находятся в состоянии стабильности; при высокой чувствительности мембран на все препараты - холин-адренергический синергизм, характеризующийся достаточно высокой прочностью физиологических механизмов регуляции, обеспечивающих устойчивость к экстремальным воздействиям; при повышенной реакции на адреналин и дексаметазон - адренергический тип, когда преобладает реактивность симпатического отдела вегетативной нервной системы и относительная слабость парасимпатического отдела, сопровождающаяся лабильностью регуляторных механизмов; при сниженной реактивности на все препараты - гипосинергизм холин-адренергического типа, характеризующийся слабостью физиологических механизмов регуляции. Способ позволяет оценивать состояние организма ребенка и прогнозировать его формирование в онтогенезе.

Способ определения типов клеточной реактивности у детей, заключающийся в использовании ряда функциональных проб, при этом функциональные пробы в виде препаратов ацетилхолина, адреналина и дексаметазона вводят в физиологических дозах в суспензию мембран эритроцитов in vitro и определяют тип клеточной реактивности по уровню хлортетрациклиновой зондовой флуоресцентной спектроскопии мембран эритроцитов: холинергический тип клеточной реактивности, когда клеточные структуры находятся в состоянии стабильности, - при преобладающей реакции клетки на ацетилхолин; холин-адренергический синергизм, характеризующийся достаточно высокой прочностью физиологических механизмов регуляции, обеспечивающих устойчивость к экстремальным воздействиям, - при высокой чувствительности мембран на все препараты; адренергический тип, когда преобладает реактивность симпатического отдела вегетативной нервной системы и относительная слабость парасимпатического отдела, сопровождающаяся лабильностью регуляторных механизмов, - при повышенной реакции на адреналин и дексаметазон; гипосинергизм холин-адренергического типа, характеризующийся слабостью физиологических механизмов регуляции, - при сниженной реактивности на все препараты.