СПОСОБ КИНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА РЕАКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к проблеме активации клеток.

Активация клеток фундаментальный цитобиологический процесс, лежащий в основе реализации различных клеточных функций. Оценка реактивности клеточных популяций на основе динамического анализа активации клеток может быть использована в медицине, сельском хозяйстве, ветеринарии, общей биологии, прикладной экологии, генетике и других областях знаний. Она позволяет ввести количественные критерии адекватности (неадекватности) взаимодействия клеток-мишеней с факторами среды и меры этих взаимодействий.

Наиболее принятыми способами оценки клеточной реактивности является анализ взаимодействия клеток с адекватными активаторами с помощью цитохимических, морфологических и изотопных методов исследования.

Типичным и хорошо распространенным способом оценки клеточной реактивности является реакция бласттрансформации лейкоцитов (лимфоцитов) периферической крови человека и животных морфологический и изотопный варианты [1] Этот метод достаточно информативен, однако требует существенных временных затрат (3-4 суток), трудоемок, содержит субъективную компоненту оценки; кроме того, некоторые из используемых реактивов оказывают токсическое воздействие на персонал.

Наиболее близким техническим решением является оценка клеточной реактивности с помощью проточного цитометра [2] Клетки помещают в культуральные сосуды в стерильных условиях и культивируют в течение 48-96 часов с адекватным индуктором, используя специальные питательные среды. В том случае, когда исследуют кинетику процесса, культуру разливают в целый ряд культуральных флаконов и, с учетом статистических закономерностей, материал исследуют в сериях флаконов с заданным временным интервалом. Изредка исследуют процесс активации на "коротком" временном отрезке 1-4 часа с интервалом 15-30 мин, наиболее часто многосуточный процесс 2-4 суток с интервалом 12-24 часа. Анализ состояния клеток ведется с использованием различных флюорохромов, позволяющих оценить количество ДНК, РНК или белка в клетке, и на этом основании делают заключение о характере процесса активации. Рассматривая конкретно модель пролиферативного процесса, как правило, оценивают его интенсивность: число ДНК-синтезирующих клеток, количество ДНК в клетке, а также формы распределений по этим параметрам. На этом основании дают сравнительную характеристику популяций, указывая на большую или меньшую реактивность клеток в зависимости от их пролиферативной активности. Такую оценку проводят и на основании измерения количества РНК и белка в единичных клетках. К достоинствам проточной цитометрии следует отнести высокую скорость, точность измерения клеточных параметров. Вместе с тем, классическая постановка клеточных культур для оценки реактивности требует длительного времени (несколько суток), дорогих реактивов и оборудования, достаточно трудоемка. Клетки, подвергнутые анализу с помощью проточного цитометра, не могут быть объектом дальнейшего исследования. Более того, достаточно подробная кинетика поведения клеток в ходе реализации быстрого биологического процесса практически невозможна. Кроме того, "перезарядка" прибора для каждой новой пробы также требует больших временных затрат, и поэтому производительность такого дорогостоящего прибора в итоге невысока.

В предлагаемом способе аналитическая кювета совмещена с культуральным сосудом, а процессе анализируется в сильно разбавленной клеточной суспензии на неспецифической стадии генной индукции в динамическом режиме. Созданный таким образом замедленный режим активации инициировал формирование 3-х-мерных функциональных клеточных ансамблей как механизма создания локальной концентрации сигнальных продуктов и межклеточного обмена информацией. С другой стороны, разреженная культура удовлетворяла требованиям системы светорассеяния как аналитической системы. Автоматизированная система анализа поведения клеток в культуре исключает во многом субъективную компоненту анализа. Вывод о характере реактивности клеток базируется на результатах оценки исходного состояния клеток (гистограмма их распределения по размерам), кинетических характеристик активации клеток и показателей завершения переходного процесса. Непрерывный контроль за процессом активации клеток на неспецифической стадии генной индукции позволяет регистрировать с высоким усреднением (2000 измерений за 10 сек) параметры исходного состояния клеток, а также такие параметры, как интеграл активации, доля вовлеченных в активацию клеток, начальная и средняя скорость процесса, длительность неспецифической стадии, скорость релаксации неспецифической стадии генной индукции.

Сопоставление предлагаемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что позволяет помимо измерения изменений размеров клеток под влиянием генного индуктора регистрировать и функциональные клеточные ансамбли, количество и размеры которых надежно отражают уровень активации клеток. Проведение анализа именно на неспецифической стадии генной индукции позволяет не только сократить временные затраты оценки реактивности клеточных популяций, но и проводить адекватное сравнение качественно различающихся живых систем. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна".

Известны технические решения, которые позволяют вести кинетический анализ поведения клеток в различных биологических процессах. Однако такой анализ производится с помощью забора проб клеток и требует временных затрат. В заявляемом техническом решении кинетический анализ проводится в автоматическом режиме с минимальным интервалом между измерениями вплоть до 10 сек без вмешательства в процесс культивирования и без изъятия клеток. Такой методический прием позволяет вести непрерывный мониторинг различных биологических процессов.

Известны аналитические системы, в которых инкубационный (культуральный) сосуд также выполняет функцию аналитической кюветы. Например, в хемилюминометрах и иных кюветных флюориметрах. В этих приборах могут исследоваться и живые клетки, подвергнутые различным воздействиям и обработанные различными флюоресцентными зондами, существенно не нарушающими их жизнеспособности. При этом возможен и кинетический анализ воздействия того или иного агента на клетки. Так исследуется влияние агентов, тропных к клеточной мембране, различных радиомиметиков, пылевых частиц и т.п. Однако в этом случае регистрируется совокупная реакция, учитывающая изменение клеток и культуральной среды, которая интегрируется как реакция мембран, митохондрий, генома и т.п. и не используется для оценки интегральной клеточной реактивности. Все это дает возможность сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию "существенные отличия".

Возможность оценки с помощью нашего способа реактивности клеточной популяции в течение нескольких минут указывает на то, что способ скор, минимально трудоемок, достаточно прост и дешев. При этом простая процедура смены образцов (заполнение кюветы клеточной суспензией) указывает на высокую производительность аналитической системы.

На фиг. 1, отражающем исходное состояние популяции, представлено распределение лимфоцитов периферической крови здорового донора по размерам, позволяющее оценить следующие параметры, отражающие реактивность популяции: доля интактных клеток и интеграл активации популяции. При формировании обучающей выборки было проанализировано 100 здоровых доноров (фиг. 2а), на фиг. 2б представлена усредненная кривая, характеризующая генеральную совокупность клеточных популяций. Кластерный анализ экспериментального материала позволил выделить 4 группы популяций среди здоровых лиц (фиг. 3а, б). Следует отметить высокую воспроизводимость методики. Один и тот же образец крови, исследованный утром и вечером того же дня, не дал достоверных отличий распределений клеток по размерам (фиг. 4). Исследования процесса активации с интервалом 10 сек позволили зарегистрировать достоверные различия: из 18 значений лишь в одном случае вектор изменений был обратным (фиг. 5). Анализ процесса активации различных пациентов на неспецифической стадии генной индукции с учетом разработанных нами критериев (см. табл. 1) позволил выделить несколько типов реакций (фиг. 6), в том числе и по начальным скоростям процесса (фиг. 7). Предложенным способом были исследованы пациенты с различными нарушениями иммунореактивности (фиг. 8). Метод представляется достаточно универсальным, пригодным не только для клинической практики, но и для экспериментальных исследований (фиг. 9, 10, 11) в различных областях науки.

В качестве примера конкретной реализации способа мы приводим анализ реактивности лимфоцитов периферической крови здорового донора.

Из венозной крови, сохранявшейся при температуре 1- 2^oC с помощью фикол-верографинового градиента (1,077) была получена фракция лимфоцитов с примесью небольшого количества эритроцитов. После 10 сек воздействия на эритроциты дистиллированной воды и 3-кратной промывки лимфоцитов раствором Хэнкса, их помещали в среду N 199 в концентрации 20 тыс. кл./мл в рабочую кювету автоматизированной системы малоуглового рассеяния (в нашем случае - система MALVERN 2600с). Для случая дифракции Фраунгофера с помощью специального алгоритма преобразования аналоговых сигналов с фотоприемника из 32 площадок, мы получали распределение клеток по размерам исходное состояние популяции, а также кинетику их активации при воздействии стандартного индуктора. В процессе разработки метода мы использовали различные клеточные популяции, а также различные лиганды: лектины, гормоны, медиаторы и т.п. в частности ФГА фирмы Difcom в концентрации 7,5 мкг/мл. Регистрацию размеров клеток и функциональных клеточных ансамблей проводили путем многократного "опроса" датчиков в течение всего периода неспецифического этапа генной индукции (практически до остановки реакции). Проводилось 2000 опросов за 10 сек с интервалом от 10 до 180 сек в зависимости от скорости процесса. Продолжительность неспецифической стадии генной индукции составляет порядка 60 минут в стандартных условиях реализации предложенного способа.

В аналитической кювете в условиях стандартного перемешивания среды при температуре 37^oC под влиянием индуктора происходит активация клеток, которая на неспецифической стадии генной индукции реализуется как универсальный стереотипный процесс. Сущность этого процесса, как известно, сводится к реорганизации структуры клетки, а также структуры клеточного ядра с активацией хроматина, увеличение объема клеточных органелл, повышением мощности аппарата биосинтеза и метаболизма и соответствующего увеличения объема ядра и клетки в целом. Известным образом изменяются клеточная мембрана и рецепторный прибор, что приводит к резкому повышению адгезионных свойств клеток. По мере углубления процесса в активацию вступает все большее число клеток, соответственно увеличивается и уровень их активации. Изменение клеточного аффинитета приводит к закономерному формированию функциональных клеточных ансамблей, величина и размеры которых отражают уровень активации популяции. Измерение размеров клеточных ансамблей как меры активации повышает точность предлагаемого способа оценки реактивности популяции.

Лимитирующими факторами процесса активации являются: исходное функциональное состояние клеток, их концентрация, соотношение разных типов клеток, участвующих в кооперации ответной реакции, число (соотношение) индиферентных по отношению к индуктору клеток, доза индуктора, особенности среды. Строгое соблюдение условий анализа позволяет корректно вести сравнительный кинетический анализ процесса активации (фиг. 7).

Управляемый по скорости процесс активации позволяет в зависимости от его специфики либо резко ускорять, либо использовать лишь параметры, характеризующие начальный этап активации (например, начальную скорость процесса), и, таким образом, существенно сократить время анализа. В нашей практике при исследовании взаимодействия лимфоцитов периферической крови человека с инсулином время анализа составило 6 мин 36 измерений с интервалом 10 сек.

Для оценки реактивности клеточных популяций нами были использованы такие параметры исходного состояния, как доля объектов с размерами до 11 мкм, что соответствует доле интактных клеток, а также интеграл активации исходной популяции. Состояние активированной популяции определялось в течение неспецифической стадии активации, при этом учитывалась начальная скорость процесса, доля клеток, вовлеченных в процессе активации, интеграл активации популяции в конце неспецифической стадии генной индукции, а также средний показатель активации единичной клетки (табл. 1). Учет предложенных нами параметров при исследовании модельных клеточных сообществ и позволяет сделать вывод о характере и степени реактивности различных клеточных популяций.

Активация как сложный кооперативный процесс в зависимости от упомянутых и иных лимитирующих факторов может эффективно отражаться различными сочетаниями предложенных нами кинетических параметров. Так например, активация лимфоцитов периферической крови пациента с острым лимфолейкозом эффективно определяется таким параметром как доля вовлеченных в активацию клеток: в норме 48% 53% 46% 60% у пациента 21% и не требует иных параметров. Однако один этот параметр при сравнении, например, интактных и облученных клеток оказался неэффективным и потребовал привлечения других параметров для проведения сравнительного анализа: интеграл активации для здоровых доноров 2404, 2255, 2476, 4049, 3735, а для облученных клеток 4329, 4882, 5461.

Использование предлагаемого способа оценки реактивности клеточных популяций (в сравнении с прототипом) позволяет считать его более эффективным, а также снижает трудоемкость и временные затраты от нескольких суток до 1-1,5 часов, и даже нескольких минут. Кроме того, отпадает необходимость работы в стерильных условиях, использования дорогостоящих реактивов и сред, что существенно удешевляет постановку предложенного метода. Отпадает необходимость в использовании вредных для персонала химикатов. Предложенный способ универсален: пригоден для работы с любыми изолированными клетками человека, животных, растений, дрожжей и т.п. Все это позволяет его широко использовать при решении разнообразных задач в медицине, биологии, ветеринарии, экологии, сельском хозяйстве, а также для решения вопросов радиационной защиты и других.

Использование: в области медицины, в частности в клинической лабораторной диагностике. Сущность изобретения: используют сильно разбавленную культуру для анализа в автоматическом цитометре, в котором культуральный сосуд совмещают с аналитической кюветой. При этом создается замедленный режим активации клеток, позволяющий регистрировать функциональные клеточные ансамбли. Эти 3-мерные композиции выступают в роли "усилителей" изменений отдельных клеток и адекватно отражают уровень активации клеточных популяций. В этих условиях удается вести практически непрерывный мониторинг клеток при воздействии адекватного генного индуктора. Анализ процесса на неспецифической стадии генной индукции позволяет получать количественную меру реактивности вне зависимости от типа клеток и природы индуктора. Способ прост, нетрудоемок, скор, дешев и эффективен. 11 ил.

Способ кинетического анализа реактивности клеточных популяций путем помещения клеток в сосуд с культуральной средой, воздействия на них генного индуктора с последующей оценкой светооптических показателей клеток, отличающийся тем, что суспензию клеток в инкубационной среде помещают в кювету автоматического цитомера в концентрации не более 500000 клеток в миллилитре и реактивность клеточной популяции при равномерном и непрерывном перемешивании клеток в кювете определяют с момента внесения активатора в динамике с интервалами от пяти секунд на неспецифической стадии генной индукции в реальном масштабе времени.