СПОСОБ ПОСТРЕЗЕКЦИОННОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2004 года по МПК A61B17/00 A61K35/407 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано при выполнении обширных резекцией печени для стимуляции ее регенерации.

Известен способ стимуляции регенерации печени путем использования лекарственного препарата ловастатин (Cai S.R., Motoyama К, Shen K.J., Kennedy S.C., Flye M.W., Ponder K.P. Lovastatin decreases mortality and improves liver functions in fulminant hepatic failure from 90% partial hepatectomy in rats // J/ Hepatol-2000.-Vol.32, N1.-P.67-77). Ловастатин является ингибитором редуктазы, которая замедляет биосинтез холестерина. Использование ловастатина в пострезекционном периоде позволяло снизить биохимические показатели маркеров внутрипеченочного цитолиза и холестаза, вне зависимости от степени их выраженности, уменьшало гипераммониемию (до 427 мкмоль/л по сравнению с группой контроля 846 мкмоль/л), снижало протромбиновое время (до 23 с, против 29 с в группе контроля), активизировало частичное тромбопластиновое время (к 29 с, против 39 с в группе контроля).

Для коррекции острой пострезекционной печеночной недостаточности. ловастатин вводили внутримышечно крысам через 30 мин после резекции 90% объема печени. Введение ловастатина увеличивало выживаемость животных до 58%. Установлено, что в приведенных условиях препарат выполняет роль заместительной терапии. При введении препарата в более поздние сроки эффекта не наблюдалось.

К недостаткам данного способа следует отнести отсутствие регенеративной способности препарата и относительно низкую выживаемость животных в послеоперационном периоде. При введении препарата в более поздний период после резекции печени его действие по эффективности было значительно снижено.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ ксенотрансплантации изолированных криоконсервированных гепатоцитов (Kobayashi N., Miyazald M., Fukaya К. Transplantation of highly differentiated immortalized human hepatocytes to treat acute liver failure // Transplantation. - 2000.-N2.-P.202-207).

Сущность известного способа заключается в том, что за 12 часов перед резекцией 90% печени экспериментальным животным (крысам) имплантируют в селезенку высокодифференцированные гепатоциты человека в концентрации 20×10⁶. Установлено, что данный прием снижает гипераммониемию у животных и связанную с этим энцефалопатию.

К недостаткам данного способа следует отнести то, что он не влияет на регенеративные процессы, происходящие в органе, а только обеспечивает метаболическую поддержку оставшейся паренхимы печени.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа стимуляции регенерации печени после ее обширной резекции (90%) в эксперименте.

Техническим результатом настоящего предложения является снижение процента послеоперационной летальности животных за счет усиления регенерации печеночной паренхимы.

Эта задача решается способом, заключающимся в том, что проводят предварительную ксенотрансплантацию изолированных криоконсервированных гепатоцитов.

Отличительным приемом заявляемого способа является то, что предварительную ксенторансплантацию проводят за 48 часов криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи в концентрации 2×10 в 1 мл питательной среды подкожно в переднюю брюшную стенку.

Отличие способа также заключается и в том, что интраоперационно после резекции печени выполняют дополнительную трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.

Сопоставительный анализ заявляемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что проводят ксенотрансплантацию за 48 часов криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи в концентрации 2×10⁶ в 1 мл питательной среды. Предварительную ксенторансплантацию проводят путем подкожного введения трансплантата в переднюю брюшную стенку, а после резекции печени - интраоперационно таких же клеток под капсулу селезенки. Из приведенного сопоставительного анализа следует, что заявляемый способ соответствует критерию изобретения "новизна".

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в экспериментальной хирургии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.

Заявленный способ обеспечивает достижение технического результата, а именно снижение послеоперационной летальности экспериментальных животных за счет усиления регенерации печеночной паренхимы. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

В доступной литературе нами не обнаружено данных по стимуляции процессов регенерации печени после ее обширной резекции (90%) в эксперименте. Анализ известных способов показал отсутствие сведений о влиянии отличительных признаков способа для достижения технического результата, что позволяет считать заявляемое изобретение соответствующим критерию "изобретательский уровень".

Авторами заявляемого способа опытным путем установлены сроки и эктопические зоны введения изолированных криоконсервированных ксеногепатоцитов, что позволило добиться наилучшей адаптации имплантированных клеток в организме животного - реципиента. Наличие процессов регенерации печеночной паренхимы крыс после обширной резекции 90% печени подтверждено гистологическими исследованиями авторов предлагаемого способа.

При морфологическом исследовании отмечено смещение популяции гепатоцитов с размером ядра 9 мкм в сторону клеток с размерами ядра 7 мкм:127 клеток в поле зрения - с размерами ядра 7 мкм против 42 клеток в поле зрения с размером ядра 9 мкм. В группе контроля соотношение этих клеток составило 59 клеток с размерами ядра 7 мкм против 86 клеток с размерами ядра 9 мкм. Об увеличении активности регенерации в опытной группе животных свидетельствовало снижение количества двуядерных клеток по сравнению с контролем (3 клетки в поле зрения в опытной группе против 14 в группе контроля). При этом содержание непаренхиматозных клеток печени - купферовских клеток - 16 клеток в поле зрения в опытной группе, против 57 в группе контроля. Это указывает на стимуляцию регенерации основных клеток печени - гепатоцитов в группе животных с ксентотрансплантацией по сравнению с контрольной группой - резекция 90% печени и без проведения ксенотрансплантации.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

За 48 часов до операции экспериментальным животным (крысам) подкожно вводят изолированные криоконсервированные гепатоциты свиньи в концентрации 2×10⁶ в 1 мл в питательной среды. Введение трансплантата проводят однократно подкожно в переднюю брюшную стенку. Затем интраоперационно непосредственно после резекции печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки каждого экспериментального животного.

Предлагаемый способ поясняется примером.

Эксперимент проводили на 30 белых крысах-самцах породы “Вистар” в возрасте не менее 6-ти месяцев и с массой тела 200-250 г. Контрольную группу составили 30 крыс. За 48 часов до гепатэктомии каждому экспериментальному животному проводили введение трансплантата подкожно в переднюю брюшную стенку в количестве 1 мл. В качестве трансплантата были использованы изолированные криоконсервированные ксеногепатоциты в концентрации 2×10⁶. Указанные гепатоциты подверглись консервации при температуре - 70°С в течение 1 месяца в специальной питательной среде (Среда для консервации клеток печени, Пат. РФ №2161198, МКИ⁷ С 12 N 5/00). Жизнеспособность размороженных криоконсервированных ксеногепатоцитов составила 80-85%.

Через 2-е суток после предварительной ксенотрансплантации опытным животным была выполнена частичная гепатэктомия в модификации А. Фишера (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. - Будапешт, 1961.- 230 с.) в объеме 90%. Контрольным животным также была выполнена 90%-ная гепатэктомия. Во время оперативного вмешательства после гепатэктомии животным опытной группы выполняли трансплантацию таких же клеток - размороженных криоконсервированных изолированных ксеногепатоцитов под капсулу селезенки в количестве 0,3 мл. В первые сутки послеоперационного периода летальность животных контрольной группы составила 100%. Летальность животных опытной группы пришлась на первые сутки после операции и составила 30%. Выжившим животным проводили определение биохимических показателей сыворотки крови, гемостаза; иммунологические исследования, оценку морфологической картины. Выведение животных из эксперимента - забор материала проводили на 2, 5 и 11 сутки пострезекционного периода. У большинства животных - 60% происходило улучшение белково-синтетической, жиролипидной и пигментной функции, снижение активности маркеров цитолиза, холестаза. При этом отмечалось снижение активности ACT с 710 МЕ/л до 149 МЕ/л, АЛТ с 406 МЕ/л до 98 МЕ/л, повышение активности холинэстеразы с 217 МЕ/л до 283 МЕ/л, увеличение уровня общего белка с 48 г/л до 60 г/л, альбумина с 11 г/л до 18 г/л, снижение общего билирубина с 37 мкмоль/л до 20 мкмоль/л. Кроме того, отмечалось увеличение массы печени с 2,614 г до 9,972 г, масса селезенки с 0,897 г до 2,402 г (в группе контроля масса печени увеличивалась до 6,692 г, селезенки - до 1,573 г). Приведенные показатели свидетельствуют о прогрессивном улучшении печеночной функции и купировании пострезекционной печеночной недостаточности, а также ускорении процессов регенерации.

Таким образом, предлагаемый способ позволил снизить процент послеоперационной летальности эксперементальных животных до 30% при 100%-ной летальности в группе контроля.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано при выполнении обширных резекций печени. Проводят предварительную ксенотрансплантацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи в концентрации 2×10⁶ в 1 мл питательной среды подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 часов до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки. Способ позволяет повысить эффективность пострезекционной регенерации печени.

Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте, включающий предварительную ксенотрансплантацию изолированных криоконсервированных гепатоцитов, отличающийся тем, что предварительную ксенотрансплантацию проводят за 48 часов до операции криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи в концентрации 2·10⁶ в 1 мл питательной среды подкожно в переднюю брюшную стенку, после чего интраоперационно непосредственно после резекции печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.