СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ РЕЗЕЦИРОВАННОЙ ПЕЧЕНИ L-АРГИНИНОМ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 A61K31/195 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии, и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени.

Наиболее близким к заявленному решению является «Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте» авт.СП. Чикотеева и др. RU 2232550. В данном решении проводят предварительную ксенотрансплантацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 часов до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.

Недостатками данного метода являются сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того, 100% летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа.

Современные методы стимуляции регенерации резецированной печени должны быть направлены не только на усиление пролиферации гепатоцитов, но и восстановление функции органа в целом. Быстрый рост гепатоцеллюлярных элементов нарушает образование структур печени. Исходом участков с избыточным скоплением печеночных клеток, с отсутствием или недостаточностью микроциркуляторного русла является некроз. Однако большинство исследований носят кратковременный характер, что не позволяет проследить факт восстановления структуры и функции печени.

В каждом живом организме заложены сложные механизмы самосохранения и восстановления. Актуальной задачей медицины является - изучить и найти способы их активации. В этой связи феномен ишемического прекондиционирования заслуживает самого детального исследования. Известно, что в процессе прекондиционирования не только снижается объем некротической зоны, но и стимулируется фундаментальное геномное перепрограммирование клеток, активизирующее репаративные и регенеративные процессы, которые так важны в хирургии. Внедрение в практику фармакологических средств, способствующих активации и продлению этого естественного защитного механизма, позволит значительно улучшить результаты лечения.

Одним из механизмов развития прекондиционирования считается стимуляция синтеза оксида азота. В 1998 г. R. Bolli предложил «гипотезу оксида азота» в отношении поздней фазы, так называемого «второго окна» прекондиционирования. Автор «гипотезы оксида азота» считает, что именно повышенная активность индуцибельной NO-синтазы, регистрируемая через 24 часа после инициируемого ишемического эпизода, является ответственной за реализацию эффектов «второго окна» прекондиционирования. L-аргинин известен как донатор оксида азота. Можно предположить, что препарат способен активировать процесс прекондиционирования. Учитывая, что в восстановительных процессах важную роль играет генетический репрограминг клетки, происходящий во «второе окно» прекондиционирования, первое введение препарата осуществляли за сутки до проведения гепатэктомии. Так как частое - ежедневное прекондиционирование приводит к отмене эффекта, а избыток оксида азота может усугубить повреждение тканей, последующие введения препарата осуществляли каждые 46 часов, именно к этому времени эффект прекондиционирования ослабевает. Препарат вводили первые 7 суток эксперимента, так как именно на данном этапе наиболее эффективна активация репаративных процессов.

Основным преимуществом предлагаемого способа является простота исполнения. Под регенерацией резецированной печени понимали истинную регенерацию органа, включающую не только регенерацию гепатоцитов, но и восстановление объема, структуры и функции печеночной ткани, наблюдаемой на протяжении 29 суток эксперимента.

Техническим результатом изобретения является разработка способа стимуляции регенерации резецированной печени с помощью L-аргинина. Технический результат достигается тем, что при резекции 70% печени на вторые сутки эксперимента лабораторному животному вводят L-аргинин внутрижелудочно в суточной дозе 200,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты проводят на белых крысах линии Wistar массой 210-220 г.

Резекция печени производится на вторые сутки в объеме 70%.

Состояние печени оценивается по показателю летальности животных, уровню микроциркуляции, выраженности цитолиза, показателям синтетической функции печени и результатам морфологического исследования в группах интактных животных, ложнооперированных, с резекцией печени и в группе животных с резекцией печени, которым вводился L-аргинин.

Продолжительность эксперимента 29 суток.

Показатель летальности оценивается в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции.

Уровень микроциркуляции в печени определяется при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP 100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и поверхностного датчика TSD 140. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы Acq Knowledge версии 4.2, значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют последовательно по поверхности печени, затем рассчитывают среднее значение. Регистрацию уровня микроциркуляции проводят на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции.

Выраженность цитолиза оценивается по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции. Показатели определяют УФ кинетическим методом на автоматизированной системе AU5800 (Beckman Coulter, США).

Синтетичесую функцию печени оценивают по показателям коагулограммы (АЧТВ, MHO, фибриноген) на 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции на анализаторе CS-2000i (Sysmex, Япония).

Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk.

L-аргинин вводят внутрижелудочно суточной дозе 200,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считают достоверными при р<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1) интактные животные (n=20);

2) ложнооперированные животные (n=20);

3) резекция печени (n=50);

4) резекция печени+L-аргинин (n=50).

Резекцию печени производили лабораторным животным на вторые сутки эксперимента в объеме 70%. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением комбинации хлоралгидрата и золетила. После наркотизации крысу фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Срединную лапаротомию выполняли от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизовывали посредством пересечения связок. Удаляли левую и медиальную доли после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивали после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно, узловым швом.

Стимуляцию регенерации печени проводили у животных 4-й группы внутрижелудочным введением L-аргинина в суточной дозе 200,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

Показатель летальности оценивали в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. В группе животных с резекцией печени он составил 40%, в группе животных с резекцией печени и введением L-аргинина 18%.

Уровень микроциркуляции в печени определяли при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP 100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и поверхностного датчика TSD 140 на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2., значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли по всей поверхности печени в течение 30 секунд в каждой точке. Из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в печени у данного животного. Из полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования.

В группе интактных животных уровень микроциркуляции в печени составил 877±17 ПЕ. Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных опытных групп представлены в таблице 1.

Среднее значение уровня микроциркуляции в печени ложнооперированных животных на всех сроках не имеет достоверных отличий от такового у интактных крыс.

После резекции печени показатель снижается на 50% и остается на прежнем уровне первые 14 суток. К 21 суткам показатель начинает расти, однако на 28-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции в резецированной печени крыс достоверно ниже такового у интактных животных.

Введение L-аргинина способствовало сохранению кровотока в резецированной печени на довольно высоком уровне (показатель снижается на 15%) и восстановлению его на сроке до 21-х суток после резекции.

Выраженность цитолиза оценивали по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2-е, 7-е, 14-е 21-е 28-е сутки после операции. Показатели определяли УФ кинетическим методом на автоматизированной системе AU5800 (Beckman Coulter, США).

АлАТ в контрольной группе на 2-е сутки 108±4 МЕ/л - снижается до нормальных показателей к 21 суткам - 38±2 МЕ/л, в группе с L-аргинином на 2-е сутки - 70±2 МЕ/л - нормализуется на 7-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

АсАТ в контрольной группе на 2-е сутки 184±7 МЕ/л - снижается до нормальных показателей к 21 суткам, в группе с L-аргинином на 2-е сутки -97±2 МЕ/л - нормализуется на 14-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

ЛДГ в контрольной группе на 2-е сутки 564±3 МЕ/л - снижается до нормальных показателей к 28 суткам - 250±6 ЕД/л, в группе с L-аргинином на 2-е сутки - 320±9 МЕ/л - нормализуется на 7-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

Синтетичесую функцию печени оценивали по показателям коагулограммы (АЧТВ, MHO, фибриноген) на 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции на анализаторе CS-2000i (Sysmex, Япония).

На 7-е сутки после резекции печени отмечено снижение синтетической функции, проявляющееся удлинением АЧТВ до 60±1 сек, увеличением MHO до 4±0,2, снижением уровня фибриногена до 1,7±0,002 г/л. наибольшие изменения показателей выявлены на 21-е сутки (АЧТВ - 75±1 сек, MHO - 6±0,1, фибриноген 0,9±0,003 г/л). На 28-е сутки отмечается их некоторое восстановление (АЧТВ - 55±1 сек, MHO - 4±0,1, фибриноген 1,2±0,002 г/л). Коррекция L-аргинином способствовала менее выраженному снижению синтетической функции печени после ее резекции. Наиболее выраженные изменения показателей были зарегистрированы на 7-е сутки (АЧТВ - 42±1 сек, MHO - 2,8±0,02, фибриноген 1,0±0,01 г/л). К 14-м суткам показатели восстановились и сохранялись в пределах нормы на всех остальных сроках эксперимента.

Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk.

Масса печени у интактных животных составила 9,2±0,002 гр. В группе ложнооперированных животных показатель не имеет достоверных отличий от такового у интактных животных. Масса печени непосредственно после резекции 2,8±0,003 гр. Средняя масса печени животных опытных групп на различных сроках эксперимента представлена в таблице 2.

В группе животных с резекцией печени масса печени на 2-е сутки увеличивается в сравнении с массой непосредственно после резекции почти в 2 раза, к 7-м суткам несколько уменьшается, затем начинает увеличиваться, однако на 28-е сутки после резекции достоверно меньше массы печени у интактных крыс. В группе животных с резекцией печени и введением L-аргинина масса печени на 2-е сутки увеличивается ровно в 2 раза, продолжая расти и достигая массы у интактных животных к 21 суткам.

При микроскопии - на отдаленных сроках в контрольной группе сохранялось неравномерное кровенаполнение сосудов всех типов, наблюдались очаги зернистой дистрофии гепатоцитов, очаги склерозирования и воспалительной инфильтрации портальных трактов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет гипертрофии одноядерных гепатоцитов, полиплоидии и амитотического деления двуядерных гепатоцитов. В группе с введением эритропоэтина на отдаленных сроках нарушений микроциркуляции и признаков повреждения гепатоцитов не выявлено, определяется равномерно выраженная гипертрофия цитоплазмы и ядер гепатоцитов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных гепатоцитов и митотического деления одноядерных гепатоцитов, то есть были задействованы все виды регенерации печени. Основная нагрузка приходилась на одноядерные гепатоциты с размером ядра 9 мкм на 2-е и 7-е сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки.

Введение L-аргинина способствовало:

- снижению летальности от пострезекционной печеночной недостаточности;

- значительному уменьшению выраженности симптомов пострезекционной печеночной недостаточности в сравнении с контрольной группой;

- восстановлению объема, структуры и функций резецированного органа до 28 суток после резекции, что не наблюдалось в контрольной группе.

Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции регенерации резецированной печени у крыс L-аргинином, проводить клинические испытания препарата. Сокращение сроков восстановления резецированного органа и утраченных его функций позволит снизить летальность от пострезекционной печеночной недостаточности, значительно уменьшить выраженность симптомов пострезекционной печеночной недостаточности, улучшить состояние пациента в послеперационном периоде, сократить продолжительность послеоперационного реабилитационного периода, что является важным для здравоохранения.

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Для этого лабораторному животному на вторые сутки эксперимента осуществляют резекцию печени в объеме 70%. В качестве средства, обеспечивающего регенерацию печени, используют L-аргинин, который вводят внутрижелудочно в суточной дозе 200,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента. Способ обеспечивает полное восстановление объема, структуры и функции резецированной печени. 1 пр., 2 табл.

Способ стимуляции регенерации резецированной печени, отличающийся тем, что резекцию печени осуществляют лабораторному животному на вторые сутки эксперимента в объеме 70%, L-аргинин вводят внутрижелудочно в суточной дозе 200,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.