СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ РЕЗЕЦИРОВАННОЙ ПЕЧЕНИ L-НОРВАЛИНОМ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 A61K31/195 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии, и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени.

Наиболее близким к заявленному решению является «Способ пострезекционной регенерации печени в эксперименте» С.П. Чикотеева и др. RU 2232550. В данном решении проводят предварительную ксенотрансплантацию криоконсервированными изолированными гепатоцитами свиньи подкожно в переднюю брюшную стенку. Процедуру осуществляют за 48 часов до операции. Затем интраоперационно непосредственно после резекции 90% печени выполняют трансплантацию таких же клеток под капсулу селезенки.

Недостатками данного метода являются: сложность технического выполнения и высокая вероятность развития осложнений при ксенотрансплантации. Кроме того, 100%-летальность крыс контрольной группы затрудняет проведение эксперимента из-за невозможности сравнения показателей в опытной и контрольной группах животных. По данным большинства исследователей наиболее оптимальной для изучения регенерации печени у крыс является резекция 70% органа.

В каждом живом организме заложены сложные механизмы самосохранения и восстановления. Задача современной медицины изучить и найти способы их активации. В этой связи феномен ишемического прекондиционирования заслуживает самого детального изучения. Эффекты прекондиционирования - цитопротекция и неоангиогенез, лежащий в основе восстановительных процессов, важны в хирургии. Внедрение в практику фармакологических средств, способствующих активации и продлению этого естественного защитного механизма, позволит значительно улучшить результаты лечения. Многочисленные исследователи склонны рассматривать в качестве гуморального агента прекондиционирования эритропоэтин. Однако - это гормональный белковый препарат и существует ряд противопоказаний для его применения, а именно артериальная гипертензия, онкологические заболевания. Кроме того, известны методы активации процесса прекондиционирования непосредственной стимуляцией основного эффекторного звена АТФ зависимых калиевых каналов. Несомненно актуальным является исследование лекарственных препаратов, способных активировать различные этапы процесса прекондиционирования.

Наиболее перспективным для изучения, с этой точки зрения, мы сочли L-норвалин. Причем препарат вводили каждые 46 часов, учитывая то, что к этому времени эффект прекондиционировния ослабевает, первые 7 суток эксперимента, так как именно на данном этапе наиболее эффективна активация репаративных процессов.

Основным преимуществом предлагаемого способа является простота исполнения, а также применение препарата в минимальной дозе, не вызывающей побочных эффектов.

Техническим результатом изобретения является разработка способа стимуляции регенерации резецированной печени с помощью L-норвалина. Технический результат достигается тем, что при резекции 70% печени на вторые сутки эксперимента лабораторному животному вводят L-норвалин внутрижелудочно в суточной дозе 10,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ

Опыты проводят на белых крысах линии Wistar массой 210-220 г.

Резекция печени производится на вторые сутки в объеме 70%.

Состояние печени оценивается по показателю летальности животных, уровню микроциркуляции, выраженности цитолиза, показателям синтетической функции печени и результатам морфологического исследования в группах интактных животных, ложнооперированных с резекцией печени, и в группе животных с резекцией печени, которым вводился L-норвалин.

Показатель летальности оценивается в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции.

Уровень микроциркуляции в печени определяется при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP 100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и поверхностного датчика TSD 140. Регистрация и обработка результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производится с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2, значения микроциркуляции выражают в перфузионных единицах (ПЕ). Запись уровня микроциркуляции осуществляют последовательно по поверхности печени, затем рассчитывают среднее значение. Регистрацию уровня микроциркуляции проводят на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции.

Выраженность цитолиза оценивают по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после операции. Показатели определяют УФ кинетическим методом на автоматизированной системе AU5800 (Beckman Coulter, США).

Синтетичесую функцию печени оценивают по показателям коагулограммы (АЧТВ, MHO, фибриноген) на 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции на анализаторе CS-2000i (Sysmex, Япония).

Морфологическое исследование выполняется на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработка материала производится по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняются с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk.

L-норвалин вводят внутрижелудочно в суточной дозе 10,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

При статистической обработке данных рассчитывают среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считают достоверными при p<0,05.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1) интактные животные (n=20);

2) ложнооперированные животные (n=20);

3) резекция печени (n=50);

4) резекция печени + L-норвалин (n=50).

Резекцию печени производили лабораторным животным на вторые сутки эксперимента в объеме 70%. Крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением комбинации хлоралгидрата и золетила. После наркотизации крысу фиксировали в положении на спине. Шерсть на брюшке тщательно выстригали, кожу обрабатывали 70% раствором этилового спирта. Срединную лапаротомию выполняли от мечевидного отростка длиной 4 см. Печень мобилизовывали посредством пересечения связок. Удаляли левую и медиальную доли после предварительного лигирования сосудов. Лапаротомное отверстие ушивали после санации брюшной полости и контроля гемостаза послойно узловым швом.

Стимуляцию регенерации печени проводили у животных 4-й группы внутрижелудочным введением L-норвалина в суточной дозе 10,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.

Показатель летальности оценивали в экспериментальных группах животных в первые 10 суток после операции. В группе животных с резекцией печени он составил 40%, в группе животных с резекцией печени и введением L-норвалина 12%.

Уровень микроциркуляции в печени определяли при помощи оборудования производства компании Biopac systems: полиграфа MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C и поверхностного датчика TSD 140 на 2-е, 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) производили с помощью программы AcqKnowledge версии 4.2, значения микроциркуляции выражали в перфузионных единицах (ПЕ). Запись кривой уровня микроциркуляции осуществляли по всей поверхности печени в течение 30 секунд в каждой точке. Из полученных значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в печени у данного животного. Из полученных значений рассчитывали среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе животных на данном сроке исследования.

В группе интактных животных уровень микроциркуляции в печени составил 877±17 ПЕ. Результаты оценки уровня микроциркуляции у животных опытных групп представлены в таблице 1.

Среднее значение уровеня микроциркуляции в печени ложнооперированных животных на всех сроках не имеет достоверных отличий от такового у интактных крыс.

После резекции печени показатель снижается на 50% и остается на прежнем уровне первые 14 суток. К 21 суткам показатель начинает расти, однако на 28-е сутки среднее значение уровня микроциркуляции в резецированной печени крыс достоверно ниже такового у интактных животных.

Введение L-норвалина способствовало сохранению кровотока в резецированной печени на довольно высоком уровне (показатель снижается на 15%) и восстановлению его на сроке до 21-х суток после резекции.

Выраженность цитолиза оценивали по уровню показателей АлАТ, АсАТ и ЛДГ в крови экспериментальных животных на 2-е, 7-е, 14-е 21-е 28-е сутки после операции. Показатели определяли УФ кинетическим методом на автоматизированной системе AU5800 (Beckman Coulter, США).

АлАТ в контрольной группе на 2-е сутки 108±4 МЕ/л, снижается до нормальных показателей к 21 суткам - 38±2 МЕ/л, в группе с L-норвалином на 2-е сутки - 68±2 МЕ/л, нормализуется на 7-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

АсАТ в контрольной группе на 2-е сутки 184±7 МЕ/л, снижается до нормальных показателей к 21 суткам, в группе с L-норвалином на 2-е сутки - 87±3 МЕ/л, нормализуется на 14-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

ЛДГ в контрольной группе на 2-е сутки 564±3 МЕ/л, снижается до нормальных показателей к 28 суткам - 250±6 ЕД/л, в группе с L-норвалином на 2-е сутки - 311±8 МЕ/л, нормализуется на 7-е сутки и остается в пределах нормальных значений на всех остальных сроках эксперимента.

Синтетичесую функцию печени оценивали по показателям коагулограммы (АЧТВ, MHO, фибриноген) на 7-е, 14-е, 21-е и 28 сутки после операции на анализаторе CS-2000i (Sysmex, Япония).

На 7-е сутки после резекции печени отмечено снижение синтетической функции, проявляющееся удлинением АЧТВ до 60±1 сек, увеличением MHO до 4±0,2, снижением уровня фибриногена до 1,7±0,002 г/л. Наибольшие изменения показателей выявлены на 21-е сутки (АЧТВ - 75±1 сек, MHO - 6±0,1, фибриноген 0,9±0,003 г/л). На 28-е сутки отмечается их некоторое восстановление (АЧТВ - 55±1 сек, MHO - 4±0,1, фибриноген 1,2±0,002 г/л). Коррекция L-норвалином способствовала менее выраженному снижению синтетической функции печени после ее резекции. Наиболее выраженные изменения показателей были зарегистрированы на 7-е сутки (АЧТВ - 42±1 сек, MHO - 2,8±0,02, фибриноген 1,0±0,01 г/л). К 14-м суткам показатели восстановились и сохранялись в пределах нормы на всех остальных сроках эксперимента.

Морфологическое исследование выполняли на материале стандартных участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала производили по стандартной методике с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окраской гематоксилином и эозином. Общеморфологическое и морфометрическое исследования выполняли с применением системы для сканирования и архивирования изображений MiraxDesk.

Масса печени у интактных животных составила 9,2±0,002 г. В группе ложнооперированных животных показатель не имеет достоверных отличий от такового у интактных животных. Масса печени непосредственно после резекции 2,8±0,003 г. Средняя масса печени животных опытных групп на различных сроках эксперимента представлена в таблице 2.

В группе животных с резекцией печени масса печени на 2-е сутки увеличивается в сравнении с массой непосредственно после резекции почти в 2 раза, к 7-м суткам несколько уменьшается, затем начинает увеличиваться, однако на 28-е сутки после резекции достоверно меньше массы печени у интактных крыс. В группе животных с резекцией печени и введением L-норвалина масса печени на 2-е сутки увеличивается ровно в 2 раза, продолжая расти и достигая массы у интактных животных к 21 суткам.

При микроскопии - на отдаленных сроках в контрольной группе сохранялось неравномерное кровенаполнение сосудов всех типов, наблюдались очаги зернистой дистрофии гепатоцитов, очаги склерозирования и воспалительной инфильтрации портальных трактов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет гипертрофии одноядерных гепатоцитов, полиплоидии и амитотического деления двуядерных гепатоцитов. В группе с введением эритропоэтина на отдаленных сроках нарушений микроциркуляции и признаков повреждения гепатоцитов не выявлено, определяется равномерно выраженная гипертрофия цитоплазмы и ядер гепатоцитов. Восстановление печеночной ткани происходило за счет полиплоидии, амитотического деления двуядерных гепатоцитов и митотического деления одноядерных гепатоцитов, то есть были задействованы все виды регенерации печени. Основная нагрузка приходилась на одноядерные гепатоциты с размером ядра 9 мкм на 2-е и 7-е сутки, что свидетельствовало о стимуляции генетического аппарата клетки.

Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции регенерации резецированной печени у крыс L-норвалином.

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и экспериментальной хирургии и может быть использовано для стимуляции регенерации резецированной печени. Для этого лабораторному животному на вторые сутки эксперимента осуществляют резекцию печени в объеме 70%. В качестве стимулятора регенерации печени вводят L-норвалин внутрижелудочно в суточной дозе 10,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента. Способ обеспечивает эффективную стимуляцию регенерации резецированной печени, подтверждаемую снижением летальности животных, улучшением микроциркуляции в печени, уменьшением выраженности цитолиза, улучшением синтетической функции печени. 2 табл., 1 пр.

Способ стимуляции регенерации резецированной печени, отличающийся тем, что резекцию печени осуществляют лабораторному животному на вторые сутки эксперимента в объеме 70%, L-норвалин вводят внутрижелудочно в суточной дозе 10,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента.