Способ стимуляции пострезекционной пролиферации гепатоцитов путем внутрипеченочного введения цианокобаламина Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 A61K31/714 A61P1/16 

Изобретение относится к хирургии и может быть использовано для стимуляции пролиферации гепатоцитов после обширной резекции печени.

Хирургическое лечение объемных образований печени в большинстве случаев остается единственным способом, позволяющим добиться увеличения продолжительности жизни и излечения пациентов [В.А. Вишневский, М.Г. Ефанов, И.З. Икрамов, А.В. Чжао. Опухоли печени: диагностика и хирургическое лечение // Доказательная гастроэнтерология. – 2013. – Т.2 – С. 38-47.]. Часто при опухолевых и паразитарных заболеваниях печени применяются операции с удалением трех и более сегментов, что может приводить к осложнениям в послеоперационном периоде и развитию пострезекционной печеночной недостаточности [В.А. Вишневский, Ю.А. Коваленко, О.И. Андрейцева, Р.З. Икрамов, М.Г. Ефанов, Н.А. Назаренко, К.А. Тупикин Пострезекционная печеночная недостаточность: современные проблемы определения, эпидемиологии, патогенеза, оценки факторов риска, профилактики и лечения // Украинский журнал хирургии. – 2013. – №3. – С. 172-183]. Ведущую роль в этиологии пострезекционной печеночной недостаточности занимает недостаточность регенераторных процессов в паренхиме печени [Michalopoulos G.K., De Frances M.C. Liver regeneration // Science. – 1997. – Vol. 276. – P.6060-6066].

Таким образом, проблема стимуляции пострезекционной регенерации печени и на сегодняшний день остается актуальной. В клинической практике, с целью улучшения метаболических процессов печени часто используют гепатопротекторы, в состав большинства из которых входит цианокобаламин. Коферментная форма цианокобаламина — метилкобаламин необходим для репликации и роста клеток, т.е. для регенерации поврежденных тканей. Основная роль метилкобаламина заключается в участии в процессах метилирования ДНК [Медведев Д.В., Звягина В.И. Молекулярные механизмы токсического действия гомоцистеина// Кардиологический вестник. – 2017. - Т.12. - №1. – С. 52-57]. Начальным этапом данного процесса является реакция реметилирования гомоцистеина в метионин, которая происходит в присутствии цианокобаламина, являющегося кофактором в метионинсинтазной реакции. Получающийся из гомоцистеина метионин преобразуется в S-аденозилметионин (SAM), представляющий собой молекулу-источник метильной группы для реакций метилирования ДНК. Несмотря на то, что в большинстве случаев метилирование ДНК приводит к повышению содержания в клетке гетерохроматина, экспериментально доказано что увеличение содержания 5-метилцитозина в ДНК приводит к уменьшению площади плотного примембранного хроматина в регенерирующей печени, следовательно, происходит декомпактизация, разрыхление хроматина, он становится более активным. Активация хроматина в ядрах клеток-мишеней в ДНК несомненно может приводить к повышению пролиферативной активности гепатоцитов [Кляшева Р.И. Модуляция метилирования ДНК и реорганизация структуры хроматина под влиянием витамина В₁₂ и адреналина у эукариот. Автореферат дис. доктора биологических наук / Рязанский гос. мед. ун-т., Рязань, 1996].

Таким образом, использование цианокобаламина является перспективным методом, позволяющим быстро достигнуть восстановления резецированной печени, снизить возможность развития пострезекционной печеночной недостаточности.

Технический результат – простота исполнения и восстановление 94,27%±2,96% от исходной массы печени к 14-м суткам после типичной резекции печени.

Технический результат достигнут тем, что при анатомической резекции 70% от массы печени лабораторному животному интраоперационно в паренхиму печени производили 8-10 инъекций на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга по 0,1 мл цианокобаламина в концентрации 200 мкг/мл.

Известен способ стимуляции регенерации печеночной ткани путем введения экспериментальным животным подкожно экстракта вытяжки коры свиных или фетальных надпочечников человека, в котором при коррекции смоделированного состояния токсического гепатита к экстракту вытяжки коры надпочечников добавляют витаминный комплекс, приготовленный на основе витаминов – пиридоксина гидрохлорида, цианокобаламина и витамина РР, и вводят его ежедневно по 0,8 мл курсом 10 инъекций [Патент №2185835]. Недостатками данного способа являются: необходимость длительного введения препаратов, отсутствие контроля концентрации действующих веществ в печеночной ткани, многокомпонентность предлагаемой терапии, сложность получения некоторых компонентов.

Известен способ стимуляции регенерации печени L-норвалином после резекции [Патент RU 2556609]. Недостатками данного способа являются: необходимость проведения дополнительных манипуляций (внутрижелудочное введение препаратов каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента), строгое соблюдение дозирования и кратности введения препарата, возможность нарушения всасывания препарата при внутрижелудочном введении и достижение только 50% исходной массы на 14-е сутки после операции.

Известен способ внутрибрюшинного введения суспензии фетальных клеток печени и/или селезенки, и/или тимуса с целью стимуляции регенераторных процессов в печени [Патент РФ № 2203675]. Основным недостатком данного способа введения препарата является то, что инородные по своим антигенам клетки в брюшной полости активируют резидентные макрофаги, провоцируя развитие воспаления (перитонита), что и было подтверждено заявителями. Также недостатком внутрибрюшинного введения является невозможность контроля концентрации препарата, попадающего в паренхиму печени.

Эксперимент проводили на белых крысах линии Wistar массой 210-220 г., половозрелых самцах без признаков заболевания в полном соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» принятой Советом Европы (Страсбург, Франция, 1986) и согласно приказу лабораторной практики Российской Федерации МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.

Лабораторным животным проводили типичную резекцию печени в объёме 70% от ее исходной массы, согласно модели предложенной G. Higgins и R. Anderson (1931). Животных вводили в эфирный наркоз. В качестве хирургического доступа использовали косой подреберный разрез от верхушки мечевидного отростка до свободного края XI ребра. Мобилизацию удаляемой левой и медиальной долей осуществляли пересечением венозной связки. Предварительно выделенную сосудистую ножку перевязывали прошивной лигатурой. Мобилизованные доли отсекали выше уровня наложенной лигатуры.

В 1-й контрольной группе животных (n=30) проводилась только типичная резекция печени.

Во 2-й группе животных (n=30) – типичная резекция печени в сочетании с интраоперационными инъекциями в паренхиму сохранённых долей печени на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга по 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия из расчета 0,1 мл препарата на 1 см³ печеночной ткани.

В 3-й группе животных (n=30) – типичная резекция печени в сочетании с интраоперационными инъекциями в паренхиму сохранённых долей печени на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга раствора цианокобаламина в концентрации 200 мкг/мл из расчета 0,1 мл препарата на 1 см³ печеночной ткани. Ушивание раны животным осуществляли послойно: мышцы простым обвивным швом, кожи – узловыми швами. В качестве шовного материала на всех этапах использовалась полигидроксиацетиловая нить 4/0.

Резецированные доли взвешивали (М_рез). Рассчитывали долженствующую исходную массу (M_max) по формуле: M_max = М_рез. *3/2.

Животных выводили из эксперимента на 1-е, 7-е и 14-е сутки после операции. Взвешивали массу регенерировавших сохранённых долей печени.

Оценка регенерации проводилась посредством расчёта отношения наблюдаемой массы печени к исходной массе M_max.

Оценка пролиферативной активности гепатоцитов осуществлялась с помощью иммуногистохимического исследования – определения индекса пролиферации гепатоцитов Ki-67.

Статистическая обработка выполнялась с помощью пакета «Описательная статистика» программы Excel, для оценки достоверности различий рассчитывали критерий сравнения Стьюдента. Достоверными считались различия при p <0,05.

Таблица 1.

Доля массы печени на момент выведения из эксперимента от долженствующей массы, %

Сутки
наблюдения Группы исследования 1-я 2-я 3-я 1 36,38±3,06 41,91±5,02 46,33±2,35** 7 70,31±2,12 77,4±3,3* 83,61±3,26** 14 80,98±4,6 83,71±4,46 94,27±2,96**

Примечание: * – p<0,05 при сравнении 1-й и 2-й групп животных;

** – p<0,05 при сравнении 1-й и 3-й групп животных.

Наличие статистически значимых различий между 1-й и 3-й группами животных подтверждает эффективность использования цианокобаламина для стимуляции регенерации резецированной печени.

Отсутствие статистически значимых различий между 1-й и 2-й группами животных подтверждает отсутствие вклада фактора использования именно внутрипаренхимальных инъекций в конечный результат.

Для оценки пролиферативной активности гепатоцитов проводили иммуногистохимическое исследование участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала проводили с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окрашиванием Ki-67. Далее подсчитывали индекс пролиферации путем определения Ki-67-положительных ядер в одноядерных и двуядерных гепатоцитах.

Таблица 2.

Индекс пролиферации одноядерных клеток в биоптате печени экспериментальных групп животных на 1, 7 и 14 сутки исследования, %

Сутки исследования 1 группа 2 группа 3 группа 1 2.19±0,52 2,22±0,43 5,97±0,34^* 7 2,78±0,21 2,64±058 6,54±0,71^* 14 2,54±0,29 2,56±0,45 6,22±0,54^*

Примечание: * – p<0,05 при сравнении 1-й и 3-й групп животных.

Таблица 3.

Индекс пролиферации двуядерных клеток в биоптате печени экспериментальных групп животных на 1, 7 и 14 сутки исследования, %

Сутки исследования 1 группа 2 группа 3 группа 1 сутки 0,038±0,019 0,011±0,006^* 0,063±0,026^** 7 сутки 0,043±0,017 0,019±0,011^* 0,089±0,031^** 14 сутки 0,039±0,014 0,024±0,017 0,069±0,024^**

Примечание: * - p<0,05 при сравнении 1-й и 2-й групп животных; ** - p<0,05 при сравнении 1-й и 3-й групп животных.

При иммуногистохимическом исследовании наибольшее значение индекса пролиферации наблюдалось при введении цианокобаламина (одноядерные гепатоциты – 6,22%±0,54%, двуядерные гепатоциты – 0,069%±0,024% на 14 сутки эксперимента), что подтверждает влияние интраоперационного введения цианокобаламина в паренхиму печени на скорость пролиферации гепатоцитов.

Незначительные различия в результатах полученных в 1-й и 2-й группах животных: индекс пролиферации одноядерных гепатоцитов в 1-й группе на 14 сутки исследования 2,54%±0,29% и во 2-й группе – 2,56%±0,45%, позволяют исключить влияние фактора использования именно внутрипаренхимальных инъекций на повышение пролиферативной активности гепатоцитов после резекции печени.

Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции пострезекционной пролиферации гепатоцитов путем интраоперационного внутрипеченочного введения цианокобаламина.

Изобретение относится к хирургии и может быть использовано для стимуляции пролиферации гепатоцитов после обширной резекции печени. При анатомической резекции 70% от массы печени лабораторному животному интраоперационно в паренхиму печени производили 8-10 инъекций цианокобаламина в концентрации 200 мкг/мл на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга по 0,1 мл. Способ позволяет снизить возможность развития пострезекционной печеночной недостаточности за счет быстрого восстановления резецированной печени. 3 табл.

Способ стимуляции пострезекционной пролиферации гепатоцитов в эксперименте, включающий анатомическую резекциию 70% от массы печени лабораторному животному, отличающийся тем, что интраоперационно в паренхиму печени производят 8-10 инъекций цианокобаламина в концентрации 200 мкг/мл по 0,1 мл на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга.