СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ СТАБИЛЬНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике клинической медицины. Может быть использован для диагностики и прогноза способов сохранения здоровья людей и их адаптации к экстремальным экологическим условиям.

Известен способ определения ретинола в клеточных мембранах, заключающийся в определении абсолютного количества ретинола [Спиричев В.В., Конь И.Я. Биологическая роль жирорастворимых витаминов (обзор литературы) // Итоги науки и техники. Серия физиология человека и животных - М., 1989. - Т.37. - 223 с.].

Известный способ не позволяет учитывать взаимосвязи ретинола и триптофанов. Это снижает достоверность характеристики структурного состоянии клеточной мембраны.

Задачей изобретения является повышение информативности и расширение функциональных возможностей диагностики клеточных мембран эритроцитов.

Задача решается тем, что в способе определения стабильности клеточных мембран эритроцитов, заключающемся в определении количества ретинола в суспензии мембран эритроцитов, согласно изобретению в суспензии дополнительно определяют количество триптофанов, а о стабильности клеточных мембран судят по отклонению от нормы ретинол-показателя, представляющего собой отношение количества ретинола к количеству триптофанов.

где РП - ретинол-показатель,

Р - количество ретинола (мкмоль/л),

Тр - количество триптофанов (мг/%).

Ретинол из кровяного русла к клеточным мембранам доставляется белками липопротеидной природы. В самой же клеточной мембране они связываются как с фосфолипидами, расположенными на поверхности мембран, так и с белковыми структурами, ретинолсвязывающими белками. При этом связанный с белковыми структурами ретинол приобретает иное свойство - становится более гидрофилен. В таком состоянии ретинол способен сохранять от окисления мембранные триптофаны, являющиеся частью интегральных транспортных белков. Отсутствие ретинолсвязывающих белков в клеточных мембранах способствует свободному поступлению ретинола в мембрану в большей степени, чем это необходимо. В большом количестве и в свободном состоянии ретинол агрессивен, в виду высокой степени ненасыщенности. В таком состоянии ретинол быстро становится субстратом окисления и может быть причиной лизиса клеточной мембраны и в конечном итоге гибели клетки.

Триптофан входит в структуру интегральных белков мембран эритроцитов, относится к незаменимым ароматическим аминокислотам. Количество триптофанов является показателем количества транспортных белков в эритроцитарных мембранах, поддерживающих стабильность мембраны и клетки в целом.

Ретинол-показатель, представляющий собой отношение количества ретинола к количеству триптофанов позволяет выявить оптимальное количество ретинола для стабильности мембран эритроцитов с определенным количеством триптофанов.

Способ осуществляют следующим образом по стандартной методике. Определяют количество триптофанов и ретинола при помощи спектрофлуориметра Hitachi.

Количество ретинола определяют следующим образом. Из венозной крови готовят суспензию эритроцитов в количестве 0,04 мл + 0,2 мл воды. Эту смесь встряхивают 30 минут. Затем в полученную жидкость добавляют 0,2 мл этанола и снова встряхивают 30 минут. После добавления 1,0 мл гексана встряхивают еще 40 минут. В заключении эту смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут. Измеряют интенсивность флуоресценции суспензии мембран эритроцитов и стандарта ретинола (2,5 мкмоль/л) при длине волны 460 нм и длине волны возбуждения флуоресценции - 335 нм.

Количество триптофанов определяют одним из известных физико-химических методов, например, спектрофлуориметрическим. [Добрецов Г.Е., Спирин М.М., Карякин А.В. Исследование с помощью индуктивно-резонансного переноса энергии пространственных взамоотношений между белками и липидами в мембранах микросом печени // Биохимия. - 1981. - Т.46, вып.3. - С.504-511]. Готовят суспензию мембран эритроцитов. К 50 мкл эритроцитарной массы прибавляют 1 мл физиологического раствора и 5 мл дистилированной воды. Центрифугируют 15 мин при скорости 8 тыс.об/мин. Сливают надосадочную жидкость, оставляя пятно на дне пробирки. Добавляют 1, 5 мл физиологического раствора. Гомогенизируют смесь при помощи ступки до получения суспензии. Помещают в кварцевую ультромикрокювету. Измеряют интенсивность флуфлуоресценции при помощи спектрофлуориметра Hitachi при длине волны 310 нм и длине волны возбуждения 284 нм. Затем по калибровочной таблице определяют количество триптофанов в мг/%.

где С пробы - концентрация пробы (мкмоль/л),

Фл.пробы - показатель флуоресценции пробы (фл.ед.),

Фл.ст - показатель флуоресценции стандарта (фл.ед.),

С ст - показатель концентрации стандартной пробы (мкмоль/л).

Ретинол-показатель рассчитывают по формуле:

и сравнивают его с нормальной, предварительно определенной по результатам обследования пациентов величиной, равной 1,00-1,60 отн.ед. Отклонение от нормы свидетельствует о нарушении соотношения ретинола и триптофанов, о снижении их биологической активности для нормального функционирования мембран.

Пример 1. Исследованы эритроцитарные мембраны у пациента N 1.

Вывод: отклонение от нормы составляет 0,93 отн.ед. Для повышения уровня здоровья необходимо употреблять пищу богатую жирорастворимыми витаминами и белками.

Пример 2. Исследованы эритроцитарные мембраны пациента № 2.

Вывод: эритроцитарные мембраны соответствуют норме. Можно думать о нормальном функционировании антиокислительной системы мембран эритроцитов, что способствует сохранению уровня здоровья.

Предлагаемый способ способствует повышению информативности и расширению функциональных возможностей диагностики стабильности клеточных мембран за счет определения ретинол-показателя.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике. Способ предназначен для диагностики адаптации людей к экстремальным экологическим условиям. Определяют количества ретинола и триптофана в суспензии мембран эритроцитов. О стабильности судят по отклонению от нормы ретинол-показателя, представляющего собой отношение количества ретинола к количеству триптофана. Способ позволяет упростить диагностику.

Способ определения стабильности клеточных мембран эритроцитов, заключающийся в определении количества ретинола в суспензии мембран эритроцитов, отличающийся тем, что в суспензии дополнительно определяют количество триптофанов, а о стабильности судят по отклонению от нормы ретинол-показателя, представляющего собой отношение количества ретинола к количеству триптофанов.