СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике клинической медицины. Может быть использован для диагностики и прогноза способов сохранения здоровья людей и их адаптации к экстремальным экологическим условиям.

Известен способ исследования активности метаболических процессов в клетке, включающий биохимическое исследование крови, определение показателей метаболизма, расчет информативного параметра и сравнение его с нормой [патент 2050001 (РФ), МПК⁶ G 01 N 33/48. Способ исследования активности метаболических процессов в клетке// Банкова В.В. (РФ), Банков В.Н. (РФ), Кислова И.В. (РФ). - Заявка 92013706, заявлено 22.12.1992, опубл. 10.12.1995].

Известный способ представляет собой моделирование искусственного гемолиза эритроцитов. Это способствует снижению достоверности получаемых результатов. Определение стойкости эритроцитов только к тем веществам, которые использованы в известном способе, способствует снижению диагностических возможностей.

Задачей изобретения является повышение достоверности и расширение диагностических возможностей способа.

Задача решается тем, что в способе определения стабильности клеточных мембран эритроцитов, включающем биохимическое исследование крови и сравнение расчетного показателя с нормой, согласно изобретению определяют количество легкоокисляемых фосфолипидов, а о стабильности судят по отклонению от нормы токоферол-показателя, представляющего собой отношение количества токоферола к количеству легкоокисляемых фосфолипидов. Отклонение токоферол-показателя от значения 0,013-0,017 отн.ед. свидетельствует о нарушении стабильности мембраны.

Токоферол-показатель рассчитывают по формуле:

где ТП - токоферол-показатель;

ТКФ - количество токоферола в мембранах эритроцитов, мкмоль/л;

ЛОФЛ - общее количество легкоокисляемых фосфолипидов (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол) в структуре клеточных мембран эритроцитов, мкмоль/л.

Клеточные мембраны образуют границы клетки, отделяя цитоплазму от внешней среды. Мембрана выполняет многообразные транспортные и биохимические функции, а также она способна образовывать механическую оболочку клетки.

Механические свойства мембран проявляются, прежде всего, в поддержании клетками определенной формы в сопротивлении деформации под действием внешних факторов.

Клеточные мембраны представляют собой активные биохимические системы, отвечающие за селективный транспорт внутрь и наружу клетки и субклеточных копартментов, связывание гормонов и других регуляторных молекул, реакции, катализируемые ферментами, передача электрических импульсов, синтез АТФ. Клеточные мембраны состоят из липидных и белковых молекул. Липидный слой клеточных мембран представляет собой двойной слой фосфолипидов со встроенными в них интегральными белками. Бимолекулярный слой липидов в мембранах представлен преимущественно фракциями фосфолипидов и холестерином. При этом фракции фосфолипидов ориентированы таким образом, что их углеводородные цепи жирных кислот направлены внутрь и удерживаются гидрофобными связями, а полярные группы обращены к белковому слою.

Как структурные компоненты клеточных мембран фосфолипиды определяют их вязкость (текучесть), способность клеток к миграции, фагоцитозу, пиноцитозу и слипанию. В зависимости от строения полярных "головных групп" глицерофосфолипидов изменяется их структурно-функциональное назначение.

Кроме фосфолипидов и холестерина клеточных мембраны включают в себя токоферолы, которые обладают способностью стабилизировать липиды за счет улучшения структурированности липидного бислоя мембран. Токоферол, обладающий гидрофобными свойствами, полностью погружается в липидный бислой таким образом, что ее ОН-группа образует водородную связь с СО-группой ацилов, связанных с остатками глицерина в молекулах фосфолипидов. В результате этого физико-химического взаимодействия между фитольной боковой цепочкой токоферола и углеводородной цепью остатка арахидоновой кислоты, которая находится в составе жирных кислот легкоокисляемых фосфолипидов, токоферол упорядочивает жидкокристаллическую структуру липидного матрикса мембран, предотвращая окисление фосфолипидов с ненасыщенными связями. Это ведет к стабилизации их гидрофобной зоны. Именно эта связь токоферола с жирнокислотными остатками арахидоновой кислоты способствует стабилизации структуры биологических мембран.

Токоферол-показатель, представляющий собой отношение количества токоферола к количеству легкоокислямых фосфолипидов, позволяет выявить достаточно ли токоферола для стабильного состояния мембран эритроцитов с определенным количеством легкоокисляемых фосфолипидов.

Способ осуществляют следующим образом по стандартной методике. Определяют количество фосфолипидов ФС+ФИ и ФЭА методом тонкослойной хроматографии: количество токоферола определяют при помощи спектрофлуориметра MPF - Hitachi. Из венозной крови готовят суспензию эритроцитов в количестве 0,04 мл + 0,2 воды. Эту смесь 30 мин встряхивают. Затем в полученную жидкость добавляют 0,2 мл этанола и снова 30 мин встряхивают. После добавления 1,0 мл гексана необходимо встряхивать еще 40 мин. В заключение эту смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Измеряют интенсивность флуоресценции суспензии мембран эритроцитов и стандарта альфа-токоферола ацетат (20 мкмоль/л) при длине волны 320 нм и длине волны возбуждения флуоресценции 295 нм. Расчет производят по формуле

С пробы - концентрация пробы, мкмоль/л,

Фл.пробы - показатель флуоресценции пробы, фл.ед.,

Фл.ст. - показатель флуоресценции стандарта, фл.ед.,

С ст. - показатель концентрации стандартной пробы, мкмоль/л.

Токоферол-показатель рассчитывают по формуле

и сравнивают его с нормальной, предварительно определенной по результатам обследования здоровых величиной, равной 0,013-0,017 отн.ед. Отклонение от нормы свидетельствует о том, что для нормального функционирования клеточных мембран эритроцитов токоферола недостаточно. Это может привести к снижению устойчивости клетки к внешним воздействиям и способствовать снижению иммунитета.

Пример 1. Исследована эритроцитарная мембрана у пациента №1

Вывод: отклонение от нормы составляет 0,009 отн.ед. Для повышения уровня здоровья необходимо употреблять пищу, богатую жирорастворимыми витаминами.

Пример 2. Исследована эритроцитарная мембрана пациента №2

Вывод: эритроцитарная мембрана соответствует норме. Можно думать о нормальном функционировании организма и достаточном уровне токоферолов в принимаемой пище.

Предлагаемый способ способствует повышению достоверности и расширению диагностических возможностей определения стабильности клеточных мембран. Оптимальное значение токоферол-показателя свидетельствует о достаточной биологической активности токоферолов для сохранения от окисления молекулярной структуры легкоокисляемых фосфолипидов. Сохраненные легкоокисляемые фосфолипиды обеспечивают ферментативную активность транспортных белков эритроцитарных мембран, в целом повышая их стабильность и устойчивость организма к внешним воздействиям.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики и прогноза способов сохранения здоровья людей и их адаптации к экстремальным экологическим условиям. Способ включает биохимическое исследование крови и сравнение расчетного показателя с нормой, при этом определяют количество легкоокисляемых фосфолипидов, а о стабильности судят по отклонению от нормы токоферол-показателя, представляющего собой отношение количества токоферола к количеству легкоокисляемых фосфолипидов. Технический результат: повышение достоверности и расширение диагностических возможностей способа.

Способ определения стабильности мембран эритроцитов, включающий биохимическое исследование крови и сравнение расчетного показателя с нормой, отличающийся тем, что определяют количество легкоокисляемых фосфолипидов, а о стабильности судят по отклонению от нормы токоферол-показателя, представляющего собой отношение количества токоферола к количеству легкоокисляемых фосфолипидов.