СПОСОБ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ СИЛЫ БЕЛОК-ЛИПИДНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В МЕМБРАНЕ ЭРИТРОЦИТА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, а именно к биофизике клеточных мембран человека, и может быть применено для исследования клеточных мембран при различных патологических процессах.

Изучение состояния области белок-липидного взаимодействия в клеточных мембранах имеет важное фундаментальное и прикладное значение в медицинской мембранологии. Сложные и недостаточно изученные процессы взаимодействия периферических и интегральных белковых глобул с липидным бислоем критически определяют функционирование мембраноассоциированных рецепторов, ферментов, белков транспортных систем, протеинов цитоскелета. С другой стороны, сами белки, в частности адсорбированные на поверхности мембраны, в значительной мере оказывают влияние на структурно-функциональные свойства липидного окружения.

Известны способы определения структурно-функционального состояния мембранных белков и их связи с липидами с помощью электронной микроскопии, рентгеновского и нейтронного рассеивания, ядерного магнитного резонанса, калориметрии [1, 3].

Недостатками этих способов являются трудоемкость, необходимость использования дорогостоящего оборудования и реактивов, невозможность изучения мембранных белков в их естественном окружении (необходимость солюбилизации и очистки), невозможность интегральной оценки силы белок-липидных взаимодействий вне зависимости от типоспецифичности белков.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения состояния области белок-липидного взаимодействия в мембране с помощью оценки параметров флуоресценции зонда анилинонафталин-8-сульфоната [2].

Недостатками указанного способа являются малая информативность в отношении непосредственного определения силы белок-липидного взаимодействия, отсутствие данных для анализа влияния механических воздействий на мембрану эритроцита.

Задачей изобретения является повышение информативности флуоресцентного зондирования мембран эритроцитов в отношении интегральной оценки силы белок-липидного взаимодействия для оценки патогенетической роли нарушений связи периферических белков с мембраной эритроцита при различных заболеваниях человека.

Поставленную задачу решают за счет того, что измерение флуоресцентных параметров, отражающих количество и степень погруженности в липиды мембранных белков, проводят в двух образцах выделенных мембран эритроцитов: приготовленного из нативных эритроцитов и приготовленного из эритроцитарной массы после трехкратного отмывания в 0,9% растворе NaCl с последующим вычислением коэффициента силы связи белков с мембраной по изменению параметров флуоресценции в отмытых эритроцитах по отношению к нативным.

Способ осуществляют следующим образом. Забирают венозную кровь из локтевой вены в объеме 10 мл с 0,1 мл раствора гепарина (5000 ЕД/мл). Выделяются мембраны эритроцитов по методу Доджа [3] в двух пробах:
1) непосредственно из эритроцитарной массы после однократного центрифугирования;
2) из эритроцитарной массы после трехкратного отмывания в 0,9% растворе NaCl.

На спектрофлуориметре " Hitachi-MPF4" в круглых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 5 мм исследуют физико-химические свойства мембран (по 300 мкл суспензии мембран на пробу):
1) флуоресценцию триптофановых групп белков оценивают по свечению суспензии мембран эритроцитов при длине возбуждения флуоресценции 284 нм и длине волны флуоресценции 334 нм. Ход измерения: суспензия мембран эритроцитов помещалась в круглые кварцевых кюветы с длиной оптического пути 5 мм и при комнатной температуре измерялась флуоресценция триптофанилов. Результат выражают в единицах флуоресценции (ЕФ).

2. степень погруженности белков в липидный бислой по индуктивно-резонансному механизму в системе триптофанилы-пирен - к суспензии промытых теней эритроцитов после измерения флуоресценции триптофанилов (при длине возбуждения 284 нм и флуоресценции 334 нм) добавляют 30 мкл спиртового раствора пирена с концентрацией 100 мкмоль/л.

Рассчитывают долю тушения флуоресценции триптофановых остатков, расположенных в мембране на расстоянии не более одного радиуса Ферстера по формуле: (F0-F1)/F0, где F0 - флуоресценция триптофанилов, до добавления пирена; F1 - флуоресценция триптофанилов после добавления пирена [2]. Результат выражается в относительных единицах (ОЕ).

Рассчитывают коэффициент степени связи периферических белков с мембраной по формуле:
К= (Р1-Р2)/Р1, где P1 - значение параметра для нативных (неотмытых) эритроцитов, Р2 - значение для отмытых эритроцитов (значение по модулю). Увеличение рассчитанных таким способом показателей будет свидетельствовать о более слабой связи периферических белков с мембраной.

Для примера в таблице 1 представлены результаты указанных параметров флуоресценктного зондирования мембран эритроцитов двух здоровых доноров (по 8 проб для каждого донора). В качестве критерия значимости различий в группах использован критерий Манна-Уитни.

Дополнительным свидетельством информативности предложенного подхода является определение погруженности мембранных белков в липиды по индуктивно-резонансному механизму у детей с бронхиальной астмой (БА) и атопическим дерматитом (АД). Нами установлено, что у детей с БА и АД наблюдается снижение погруженности мембранных белков в бислой в нативных эритроцитах по сравнению с группой здоровых детей. Определение того же показателя в отмытых эритроцитах приводила к стиранию найденных отличий. Подобный характер выявленных особенностей в строении мембраны может свидетельствовать, что более поверхностное расположение мембранных белков касается в основной части поверхностно расположенных слабо связанных с мембраной белков (таблица 2).

Преимущества предложенного способа: относительная простота выполнения, возможность интегральной (типонеспецифической) оценки связи белков с мембраной в их естественном окружении, высокая чувствительность и информативность в отношении механического воздействия на мембрану.

Источники информации
1. Биологические мембраны. Методы: Пер. с англ./Под ред. Дж.Финдлея, У. Г. Эванза. - М.: Мир, 1990. - 424 с.

2. Владимиров Ю. А., Добрецов Г.Е. Флюоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука; 1980; 320.

3. Смирнов Ю.В., Ослопов В.Н., Маклаков А.И., Сорокина Н.Ю. Способ диагностики патологии клеточных мембран методом ЯМР-спектроскопии ионов водорода.//Авт. свидетельство СССР 94015013, G 01 N 24/08, 1996 г.

4. Dodge J.T., Mitchell С., Hanahan D. The preparation and hemical characteristics of hemoglobin - free shosts of human erythrocyts.// Arch. Biochem. and Biophis. - Vol. 100. - N 1. - P. 119-130.

Изобретение относится к медицине, а именно к биофизике клеточных мембран человека, и может быть применено для изучения клеточных мембран при различных патологических процессах. Способ включает измерение флуоресцентных параметров, отражающих количество и степень погруженности в липиды мембранных белков, проводят в двух образцах выделенных мембран эритроцитов: приготовленного из нативных эритроцитов и приготовленного из эритроцитарной массы после 3-кратного отмывания в 0,9% растворе NaCl с последующим вычислением коэффициента силы связи белков с мембраной по изменению параметров флуоресценции в отмытых эритроцитах по отношению к нативным. Способ обеспечивает относительную простоту выполнения, возможность интегральной (типонеспецифической) оценки связи белков с мембраной в их естественном окружении, высокую чувствительность и информативность в отношении механического воздействия на мембрану. 2 табл.

Способ интегральной оценки силы белок-липидного взаимодействия в мембране эритроцита, включающий исследование структуры мембраны с помощью метода флуоресцентного зондирования, отличающийся тем, что измерение флуоресцентных параметров, отражающих количество и степень погруженности в липиды мембранных белков, проводят в двух образцах выделенных мембран эритроцитов: приготовленного из нативных эритроцитов и приготовленного из эритроцитарной массы после 3-кратного отмывания в 0,9% растворе NaCL с последующим вычислением коэффициента силы связи белков с мембраной по изменению параметров флуоресценции в отмытых эритроцитах по отношению к нативным.