ИММУНОГЕННАЯ БИБЛИОТЕКА ХИМЕРНЫХ ПЕПТИДОВ, МИМИКРИРУЮЩАЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МНОГООБРАЗИЕ ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНОГО РАЙОНА V3 БЕЛКА ОБОЛОЧКИ GP120 ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК C07K14/155 A61K39/21 

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к диагностике и вакцинопрофилактике вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), и может быть использовано для получения антигенов для производства диагностических тест-систем и производства вакцинных препаратов против ВИЧ/СПИД.

Быстрый рост числа ВИЧ инфицированных индивидуумов во всем мире и распределение большинства инфицированных в странах со скудными медицинскими ресурсами диктует необходимость создания высокоэффективной вакцины, чтобы ограничить распространение этой эпидемии. Одним из основных препятствий на пути создания такой вакцины является чрезвычайно высокая генетическая гетерогенность в пределах одного вирусного белка оболочки, которая наблюдается в различных частях мира в одном и том же клайде и, в некоторых случаях, даже в пределах одного индивидуума. Такая вариабельность является результатом высокого уровня мутаций в вирусных белках, которые происходят в ходе репликации вируса [1].

Для того чтобы быть эффективной против широкого спектра изолятов ВИЧ, кандидатные вакцины должны содержать иммуногены основных изолятов, представляющих полный спектр изолятов ВИЧ [2]. Необходимо идентифицировать эти иммуногены и улучшить их иммуногенность [3]. Поэтому результирующая вакцинная конструкция должна содержать ключевые протективные В- и Т-клеточные эпитопы, специфичные широкому спектру вариантов ВИЧ, а также современные средства доставки и адъюванты [4, 5].

В настоящее время на I-, II- или даже III-й фазе клинических испытаний находятся целый ряд кандидатных вакцин против ВИЧ-1: пептидные, ДНК-вакцины, рекомбинантные, на основе живых векторов, псевдовирионы и другие. Однако все они в силу конструктивных особенностей не в состоянии "представить" достаточно широкий спектр иммуногенов основных изолятов, представляющих полный спектр изолятов ВИЧ-1. Поэтому трудно ожидать создание таким образом "успешной" вакцины против ВИЧ.

При разработке пептидных вакцин активно используется идентификация района третьей гипервариабельной петли (V3) белка оболочки gp’120 ВИЧ-1 в качестве главной нейтрализующей детерминанты.

Известен способ рационального конструирования поливалентной субъединичной вакцины против ВИЧ, включающий определение нейтрализующих эпитопов доменов V2 и V3 gp120 изолятов ВИЧ из различных географических зон [6]. Еще один подход к получению синтетических иммуногенных пептидов ВИЧ-1 описан в работе канадских заявителей [7], в которой описан тандемный синтетический пептид, содержащий последовательности Т- и В-клеточных эпитопов, а также последовательность петли V3 из разных изолятов ВИЧ.

Однако высокая степень генетической вариабельности района V3 результируется во множестве последовательностей, которые невозможно одновременно ввести в состав вакцинной конструкции.

Аналогично вышеизложенному по "вакцинному" направлению и по тем же причинам затруднительно выявлять в диагностических целях также и антитела к гипервариабельным районам gp120 ВИЧ-1, которые являются наиболее ранними и доминантными в ходе иммунного ответа на ВИЧ-1 [2, 4, 8]. Диагностика таких антител, направленных против гипервариабельного района V3 gp120, зависит от генотипов используемых антигенов, генотипа инфекционного агента и требует использования множественных последовательностей, соответствующих широкому спектру вариантов ВИЧ-1, для уменьшения вероятности неузнавания какого-либо редкого или измененного варианта вируса.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является подход Carlos и соавторов [8, прототип], в котором для конструирования синтетической пептидной вакцины представлены основные гипервариабельные районы (V1-V5) gp120 ВИЧ-1 (клайда В). Предложенная авторами конструкция принимает во внимание тип и частоту аминокислотных замен, встречающихся в каждом районе в ходе эволюции вируса у отдельного пациента и в общей популяции. Однако ограниченный набор последовательностей, по которым проводилось планирование эксперимента (100 последовательностей), результировался в таком выборе вариантов синтезированных пептидов, который не отражает реальную частоту встречаемости аминокислот в соответствующих позициях гипервариабельных районов. Кроме того, авторами реализовано крайне ограниченное представление разнообразия вариантов гипервариабельных районов (всего 64 пептида для района V3), не соответствующее широкому спектру иммуногенов основных изолятов ВИЧ-1.

Технической задачей изобретения является создание эффективной пептидной библиотеки, мимикрирующей генетическое многообразие основного гипервариабельного района V3 белка оболочки gpl20 ВИЧ-1 (клайд В), способной вызвать протективный гуморальный иммунный ответ против широкого спектра вариантов ВИЧ-1, которая также обладает способностью связывать ранние антитела к ВИЧ-1 любого серотипа.

Поставленная задача решается путем использования теоретического анализа структурной информации по оригинальному алгоритму, последующего дизайна и синтеза пептидных библиотек для того, чтобы обеспечить представление (моделирование) всех известных и возможных вариантов, хотя далеко не каждый возможный вариант последовательности должен быть синтезирован.

Сущность данного изобретения составляет оригинальная эффективная библиотека химерных пептидов (БХП), мимикрирующая генетическое многообразие основного гипервариабельного района V3 белка оболочки gp120 ВИЧ-1, способная вызывать протективный гуморальный иммунный ответ против широкого спектра вариантов вируса, а также обладающая способностью связывать ранние антитела к ВИЧ-1, содержащая оптимальное число возможных, в том числе и модифицированных, структур района V3 gp120 ВИЧ-1, мощностью 46080 различных пептидов, имеющая следующую структуру:

N-N-N-T-R-K-[S(75%), G(18%), R(7%)]-I-[H(60%), P(18%), N(11%), S(11%)]-[I(88%), M(12%)]-[G(97%), A(3%)]-[P(95%), W(5%)]-G-[R(77%), Q (9%), S(3%), G(3%)]-[A(93%), T(7%)]-[F(76%), W(15%), L(9%)]-Y-[T(58%), A(42%)]-T-G-[E(39%), D(28%), Q(24%), R(9%)]-I-I-G-[D(88%), N(12%)]-I-R-Q,

где в квадратных скобках приведены относительные встречаемости аминокислот в вариабельных позициях последовательности.

Сущность изобретения состоит в том, что на основе детальной теоретической проработки, включающей анализ потенциальных взаимодействий антител с вариабельными районами белков [9-12], выбрано оптимальное число пептидов (46080 вариантов) для вызова антител, обладающих широкой перекрестной реактивностью против всего существующего и могущего возникнуть разнообразия вариантов района V3 белка gp120 ВИЧ-1. Это предполагает реактивность против районов вирусной оболочки, которые не включены прямо в состав вакцины. Выбор последовательностей из района V3 для включения в состав кандидатной вакцины, проведен на основе полного понимания структурных свойств антигенных пептидов и антител, с которыми они должны взаимодействовать [9, 10].

Библиотеку химерных пептидов, как и отдельные пептиды, получают общепринятыми методами стандартного твердофазного синтеза путем последовательного наращивания пептидной цепи на сополимере стирола с 1% дивинилбензолом. При вариабельности аминокислот в какой-то позиции производят добавление нескольких аминокислот в реакционную смесь в пропорции, чтобы с учетом их реактогенности получилось требуемое процентное соотношение аминокислот в данной позиции.

Исследование эффективности библиотеки химерных пептидов для выявления специфических антител к ВИЧ-1 в образцах сывороток крови проводили с использованием сывороток здоровых доноров и ВИЧ-инфицированных пациентов с помощью непрямого иммуноферментного анализа. Результаты испытаний показали более чем 80% выявление положительных проб, содержащих специфические антитела к антигенам ВИЧ-1 на основании результатов анализа, проведенных с коммерческими тест-системами.

Разработанная библиотека химерных пептидов обеспечивает 81% чувствительность и 93% специфичность на сыворотках стандартной панели положительных сывороток анти-ВИЧ-1 серии 010 (ОСО 42-28-212-93) и сыворотках стандартной панели отрицательных сывороток серии 007 (ОСО 42-28-214-94).

Разработанная библиотека химерных пептидов при введении лабораторньм животным (мыши BALB/c) вызывает образование специфических антител. Наработанные антитела узнают в ИФА саму библиотеку химерных пептидов, а также ряд синтетических пептидов, имеющих последовательности, соответствующие району V3 gpl20 ВИЧ-1 разных генотипов вируса.

Ниже следуют примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1. Синтез библиотеки химерных пептидов.

Пептиды были синтезированы на автоматических синтезаторах Applied Biosystems 430А и Vega Coupler C250 с использованием Boc/Bzl тактики наращивания пептидной цепи. В качестве полимерного носителя использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола, а якорной группировкой служила фенациламидометильная (РАМ) группа [13]. Удаление временных защитных групп проводили неразбавленной трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию - по методике in situ [14], добавляя N,N’-диизопропилэтиламин на стадии конденсации прямо в реакционную смесь. Конденсацию проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, приготавливаемых непосредственно перед использованием путем смешения трехкратных избытков по отношению к емкости полимеров Вос-производного аминокислоты, 1-гидроксибензотриазола и диизопропилкарбодиимида. По завершении стадии конденсации проводили контроль полноты ее протекания [15]. В случае позитивного нингидринового теста после нейтрализации пептидилполимера ставили повторную конденсацию. Если же тест был отрицательным, после удаления Вос-групп проводили присоединение следующего аминокислотного остатка. В качестве постоянных защитных групп были использованы 2-хлорбензилоксикарбонильная для лизина, дихлорбензильная для тирозина, соответствующие бензиловые эфиры для аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, серина и треонина, формальная для триптофана, тозильная для аргинина, а метионин вводился в виде соответствующего сульфоксида. По завершении сборки защищенной полипептидной цепи конечные продукты деблокировали с одновременным отщеплением от полимера с помощью безводного фтористого водорода в присутствии скавенджеров по Sn2/Sn1 механизму [16].

При синтезе пептидных библиотек на стадии конденсации в вариабельных позициях к пептидил-полимеру добавлялась смесь защищенных аминокислотных остатков в определенном количественном соотношении, которое обеспечивает заданное включение различных аминокислотных остатков в растущую полипептидную цепь. Поскольку разные аминокислоты имеют разные скорости ацилирования аминогрупп, то на основе анализа результатов синтеза ряда модельных соединений были рассчитаны коэффициенты, позволяющие нивелировать указанное различие за счет увеличения концентрации медленно реагирующих остатков. Поэтому Вос-производные аминокислот, которые вводились в смесь, брались в соотношениях с учетом поправок в виде указанных коэффициентов.

Линейные пептиды очищены до гомогенного состояния препаративной обращенно-фазовой хроматографией (хроматограф Gilson, Франция, колонка Waters SymmetryPrep С 18, 19×300 мм, 7 мкм, скорость потока 10 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 10-40% за 30 мин). Пептидные библиотеки и MAP пептиды очищали методом гель-проникающей хроматографии на колонке с Sepharose G-50, элюент 50% уксусная кислота. Синтезированные соединения охарактеризованы данными аналитической ОФ ВЭЖХ (хроматограф Gilson, Франция, колонка XTerra RP18, 125А°, 3,9×150 мм, 5 мкм, скорость потока 1 мл/мин, элюент 0,1% трифторуксусная кислота, градиент ацетонитрила 10-40% и 20-40% за 16 мин для пептарфина и циклопептарфина, соответственно), аминокислотного анализа (гидролиз 6N НСl, 24 ч, 110°С; аминокислотный анализатор LKB 4151 Alpha Plus, Швеция). Чистота конечных продуктов по данным аналитической ВЭЖХ составила не менее 95%. Аминокислотный состав гидролизатов пептидов (6N НСl, 120°С, 24 ч, анализатор LKB 4151 Alpha Plus) соответствовал теоретическому.

Пример 2. Иммунный ответ на библиотеку химерных пептидов.

Мыши линии BALB/c в возрасте 5-6 недель иммунизировались внутрибрюшинно трехкратно библиотекой пептидов, разведенной в фосфатном буферном растворе с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ). Мышам вводилось по 0,2 мл раствора пептидов в дозе 50 мкг/гол, вторая и третья иммунизации проводились через 2 и 4 недели, соответственно, после первой иммунизации. Контрольной группе животных вводили раствор пептида, мимикрирующего антигенный участок белка Е вируса клещевого энцефалита, по той же схеме и в тех же дозировках. Через 10 дней после последней иммунизации у животных из ретроорбитальной вены брали пробу крови для определения титра специфических антител в сыворотке.

В лунках микропланшетов для иммуноферментного анализа (“Медполимер”, г. Москва) иммобилизировали следующие антигены - 1) библиотеку химерных пептидов или 2) отдельно каждый из 15-ти синтезированных пептидов, представляющих последовательности аминокислот района V3 белка gp120 известных изолятов ВИЧ-1 различных генотипов.

Антигены растворяли в 0,05М карбонат бикарбонатном буферном растворе, рН 9,6 до конечной концентрации 10 мкг/мл, вносили в каждую лунку микропланшета по 0,1 мл и инкубировали в течение ночи при температуре 37°С. Лунки промывали 3 раза фосфатно-буферным раствором с твин-20 и блокировали неспецифическое связывание 0,5%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина, фракция 5 (Sigma). Двукратные разведения проб сывороток крови мышей в трис-НСl буферном растворе наносили по 0,1 мл в лунки с иммобилизованным антигеном и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, после чего лунки промывали 5 раз фосфатньм буферным раствором. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело выявляли путем нанесения в лунки микропланшет по 0,1 мл фосфатного буферного раствора, содержащего конъюгированные пероксидазой хрена антитела козы против иммуноглобулинов класса G мыши (Sigma), инкубирования при 37°С в течение 30 мин и добавления субстратной смеси, содержащей ортофенилендиамин. Ферментную реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты, результат реакции учитывали по оптической плотности, измеренной с помощью планшетного ридера “Мультискан ЕХ” на длине волны 492 нм.

Результаты определения титра антигенспецифических антител в сыворотке крови мышей представлены в таблице.

Таким образом, трехкратная внутрибрюшинная иммунизация мышей библиотекой химерных пептидов вызывает образование сывороточных антител, специфичных как к самой библиотеке химерных пептидов (иммунизирующий антиген), так и к пептидам, формирующим антигенные детерминанты в районе V3 некоторых известных изолятов ВИЧ-1. Следовательно, набор химерных пептидов, входящих в разработанную библиотеку, является иммуногеном, способньм индуцировать наработку антител, взаимодействующих с антигенными детерминантами широкого спектра вариантов ВИЧ-1.

Пример 3. Иммуноферментный анализ сывороток с использованием библиотеки химерных пептидов.

Разработанная библиотека химерных пептидов анализировалась в твердофазном иммуноферментном анализе при исследовании образцов сывороток от 50 ВИЧ-инфицированных пациентов и 30 здоровых доноров с целью выявления специфических антител. Предварительно сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов были проанализированы с помощью ряда коммерческих тест-систем отечественного и зарубежного производства. Кроме того, библиотеку химерных пептидов оценивали на способность выявлять антитела к ВИЧ-1 с использованием сывороток стандартных панелей анти-ВИЧ-1 сер.010 и сер.007.

Методика проведения ИФА включает следующие этапы:

1. Сорбция антигена на планшеты.

Библиотеку химерных пептидов растворяют в 0,05 М карбонатбикарбонатном буферном растворе, рН 9,6 до конечной концентрации 1,5 мкг/мл. Растворы вносят по 0,1 мл в лунки планшетов и инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Затем лунки промывают 3-5 раз раствором ФСБ-Т (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий твин-20). Далее методика полностью соответствует Инструкции по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к ВИЧ-1 производства ДГУЭПП “Вектор-БиАльгам” (пос. Кольцове Новосибирской обл.).

2. Связывание антител с иммобилизованным на планшетах антигеном - библиотекой химерных пептидов (получение комплекса Аг-Ат).

Сыворотки крови, разведенные в 20 раз раствором ФСБ-Т, содержащим 0,2% казеина, вносят в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Затем лунки промывают 5-7 раз раствором ФСБ-Т.

3. Связывание конъюгата (моноклональное антитело к IgG-пероксидаза) с комплексом на твердой фазе (образование комплекса Аг-Ат-Конъюгат).

В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора конъюгата моноклонального антитела к IgG с пероксидазой хрена в разведении 1:20 на ФСБ-Т, содержащем 0,2% казеина. Планшет инкубируют при 37°С в течение 30 мин, затем промывают 5-7 раз раствором ФСБ-Т.

4. Выявление комплекса Аг-Ат-Конъюгат.

В лунки планшета вносят по 0,1 мл раствора субстратной смеси, состоящей из 0,05% ТМБ, 0,005% перекиси водорода в 0,05 М фосфатно-цитратном буферном растворе, рН 5,0. Планшет выдерживают при комнатной температуре (18-22°С) в течение 15-20 мин, оставляя планшет в темном месте.

5. Остановка реакции и учет результатов.

В лунки планшета добавляют по 0,05 мл 2 М раствора серной кислоты. Учет результатов осуществляют измерением оптической плотности образцов на автоматическом спектрофотометре типа “Мультискан” при длине волны 450 нм.

В качестве контроля для исключения неспецифических результатов при постановке реакции используют контроль субстратной смеси (БХП + субстрат), контроль конъюгата (БХП + конъюгат + субстрат), контроль сыворотки, не содержащей антител к ВГС по данным тестирования в скрининговых отечественных и зарубежных тест-системах 3-го поколения.

Исследуемые сыворотки расценивают как содержащие антитела к ВИЧ-1, если соответствующие им значения оптической плотности (ОП) раствора в лунках с исследуемой сывороткой превышают критическое значение ОП_крит, рассчитываемое по формуле:

ОП_крит=ОП(К^-)_ср+0,2,

где ОП(К^-)_ср - средняя оптическая плотность для отрицательных контрольных сывороток.

Результаты исследования сывороток стандартных панелей анти-ВИЧ-1 сер.010 и 007 с использованием библиотеки химерных пептидов показали 81% чувствительность и 93% специфичность.

Кроме того, проведено исследование эффективности библиотеки химерных пептидов для выявления специфических антител к ВИЧ-1 в образцах сывороток крови с использованием 50 сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов и 30 сывороток здоровых доноров. Результаты испытаний показали более чем 80% выявление положительных проб, содержащих специфические антитела к антигенам ВИЧ-1 на основании результатов с коммерческими тест-системами 3-го поколения.

Таким образом, данное изобретение представляет собой библиотеку химерных пептидов, мимикрирующую генотипическое многообразие основного иммунодоминантного района V3 gp120 ВИЧ-1, обладающую иммунохимическими свойствами белка gp120 ВИЧ-1, взаимодействующую с антителами к gp120 ВИЧ-1, позволяющую определять раннюю фракцию специфических антител к ВИЧ-1.

Библиотека химерных пептидов может использоваться:

- для производства диагностических тест-систем для определения ранних антител к gp120 ВИЧ-1 для ранней диагностики ВИЧ-инфекции;

- для разработки вакцинных препаратов против ВИЧ/СПИД для вызова протективного гуморального и клеточного иммунного ответа против широкого спектра вариантов ВИЧ-1.

Литература

1. Coffin, J.М. (1995). HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy [see comments]. Science 267 (5197), 483-9.

2. Baltimore, D., and Heilman, C. (1998). HIV vaccines: prospects and challenges. Sci Am 279 (1), 98-103.

3. van der Groen, G., Nyambi, P.N., Beirnaert, E., Davis, D., Fransen, K., Heyndrickx, L., Ondoa, P., Van der Auwera, G., and Janssens, W. (1998). Genetic variation of HIV type 1: relevance of interclade variation to vaccine development. AIDS Res Hum Retroviruses 14 Suppi 3, S 211-21.

4. Berzofsky, J.A., and Berkower, I.J. (1995). Novel approaches to peptide and engineered protein vaccines for HIV using defined epitopes: advances in 1994-1995. Aids 9(SupplA), S 143-57.

5. Патент США №6294322, МПК7: C 12 Q 1/70, опубл. 25.09.2001.

6. Патент США №6042836, МПК7: А 61 К 39/21, опубл. 28.03.2000.

7. Патент CША №5817754, МПК7: А 61 К 39/21, опубл. 06.10.1998.

8. Carlos, M.P., Anderson, D.E., Gardner, M.В., and Torres, J.V. (2000). Immunogenicity of a vaccine preparation representing the variable regions of the HIV type 1 envelope glycoprotein. AIDS Res Hum Retroviruses 16 (2), 153-61.

9. Максютов А.З. (1989). Корреляция антигенных свойств вирусов гриппа подтипа H3N2 с изменениями в аминокислотной последовательности гемагглютининов. Вопросы вирусологии №3, с.283-88.

10. Максютов А.З., Ерошкин А.М., Куличков В.А. (1987). Метод расчета иммунохимического перекреста между гомологичными белками. Молекул. биология 21 (1), 39-47.

11. Maksyutov, A.Z., and Zagrebelnaya, E.S. (1993). ADEPT: a computer program for prediction of protein antigenic determinants. Computer Applications in the Biosciences 9 (3), 291-297.

12. Максютов А.З., Загребельный С.Н. (1993). Антигенные детерминанты белков. Гуморальный иммунный ответ. Молекул. биология 27 (5), 980-991.

13. Sparrow, J.T. (1976) J. Org. Сhem. 41, 1350-1353.

14. Schnolzer, M., Alewood, P., Jones, A., et. al. (1992). Int. J. Pept. Prot. Res. 40, 180-183.

15. Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D., Cook, P.I. (1970). Anal. Biochem. 34, 395-398.

16. Tam J.P. et al. (1983). J. Amer. Chem. Soc. 105, 6442-6444.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к диагностике и вакцинопрофилактике ВИЧ-1. Предложена библиотека химерных пептидов, мимикрирующая генотипическое многообразие основного гипервариабельного района V3 gp120 ВИЧ-1. Библиотека является иммуногенной и вызывающей наработку антител, взаимодействующих с широким спектром вариантов gp120 разных генотипов ВИЧ-1. Также, библиотека обладает способностью связывать ранние антитела к ВИЧ-1. При иммунизации лабораторных животных библиотекой химерных пептидов образуются специфические антитела, взаимодействующие с широким спектром вариантов gp120 разных генотипов ВИЧ-1. Предложенная библиотека химерных пептидов может быть использована для получения антигенов для производства диагностических тест-систем и производства вакцины против ВИЧ-1. 1 табл.

Иммуногенная библиотека химерных пептидов, мимикрирующая генетическое многообразие основного гипервариабельного района V3 белка оболочки gp120 ВИЧ-1, способная вызывать протективный гуморальный иммунный ответ против широкого спектра вариантов вируса и связывать ранние антитела к ВИЧ-1, содержащая оптимальное число возможных, в том числе и модифицированных, структур района V3 gp120 ВИЧ-1, имеющая следующую структуру:

где в квадратных скобках приведены относительные встречаемости аминокислот в вариабельных позициях последовательности.