ПЕПТИД-ИМИТАТОР ЭПИТОПА БЕЛКА gp120 ВИЧ-1 Российский патент 2002 года по МПК C12P21/00 C12P21/02 C07K7/00 

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно - к получению с помощью фагового дисплея пептидов-имитаторов антигенной детерминанты белка gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), узнаваемой вируснейтрализующими моноклональными антителами 2G12.

Одной из основных проблем при создании эффективных вакцинных препаратов против СПИДа является высокая антигенная вариабельность ВИЧ. Интенсивное разрушение Т-лимфоцитов, несущих на своей поверхности рецептор CD4⁺, наряду с мощным антительным ответом на структурные белки р24, gp120 и gp41 способствует появлению и селекции генетических вариантов ВИЧ-1 даже в течение индивидуального инфекционного процесса [1]. При использовании инактивированных цельновирионных ВИЧ-вакцин существует также опасность аутоиммунных процессов вследствие мимикрии структуры вирусного белка gp120 под структуру иммуноглобулинов [2].

Решению проблемы может помочь использование при создании вакцин пептидов, отличающихся по аминокислотной последовательности от антигенных детерминант вирусов, но сохраняющих способность связываться с противовирусными антителами. Такие пептиды являются имитаторами антигенных детерминант. Пептиды-имитаторы могут быть достаточно вырожденными и иметь перекрестную реактивность с антителами к разным изолятам вируса. Вырожденные пептиды могут иметь свойство индуцировать при иммунизации антитела, перекрестно реагирующие с антигенными вариантами одного и того же вируса (явление молекулярной мимикрии). Пептиды, мимикрирующие вируснейтрализующие эпитопы вирусов, по-видимому, будут вызывать наработку протективных антител и могут быть вследствие этого использованы при создании вакцин против ВИЧ и других высоковариабельных патогенов. Например, было показано, что имитаторы HBsAg, селектированные с подтип-специфической сывороткой, при инъекции экспериментальным животным способны индуцировать образование антител, не обладающих специфичностью к подтипам вируса гепатита В [3].

Уникальные возможности для получения пептидов-имитаторов природных антигенов предоставляют фаговые библиотеки пептидов, включающие в себя все возможные пептиды заданной длины, экспонированные в составе одного из поверхностных белков нитчатых бактериофагов. При этом в геноме каждого фага такой библиотеки закодирована последовательность только одного из вариантов пептидов. Отбор пептидов осуществляется с помощью антител определенной специфичности (при получении вакцин это должны быть протективные антитела). При этом интересен тот факт, что на моноклональные антитела (МКА) из фаговой пептидной библиотеки обычно отбирается ряд пептидов, отличающихся по аминокислотному составу от оригинального антигена, но имитирующих его по связыванию.

Хорошим примером пептидов-имитаторов ВИЧ-1 является работа Keller с соавторами [4] , в которой показано, что пептиды, селектированные из фаговой пептидной библиотеки по связыванию с МКА 447-52D к V3-петле gp120 вируса иммунодефицита человека, могут индуцировать специфичный гуморальный иммунный ответ на gp120.

Одними из самых перспективных вируснейтрализующих МКА являются 2G12 [5]. Было показано, что моноклональные антитела 2G12 против белка gpl20 ВИЧ-1 обладают нейтрализующей активностью против широкого спектра изолятов ВИЧ-1 различных субтипов, активируют систему комплемента по классическому пути и вызывают антителозависимую клеточную цитотоксичность. Ни одно из известных антител не конкурирует с 2G12 за связывание с белком gpl20. В соответствии с этим МКА 2G12 относят к уникальной группе антител, в которой на сегодняшний день МКА 2G12 является единственным представителем [6].

МКА 2G12 в комплексе с другими антителами используются для пассивной иммунотерапии больных СПИДом в клиниках США и Европы [7]. В связи с этим является перспективным использование 2G12 эпитопа для экспонирования в составе рекомбинантной вакцины против ВИЧ-1 [8]. Структура эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, до сих пор не определена, показано только, что он сильно зависит от конформации поверхностного гликопротеина gp120 [5]. В настоящее время не известны фрагменты gp120, способные связываться с МКА 2G12.

Технической задачей изобретения является поиск пептидов-имитаторов эпитопа белка gp120 ВИЧ-1, узнаваемого МКА 2G12, с помощью фаговых пептидных библиотек.

Поставленная цель достигается путем аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек, содержащих десятки миллионов разных пептидов длиной 15 а. о, тех пептидов, которые способны связываться с моноклональными антителами 2G12 (МКА 2G12) к нейтрализующему эпитопу белка gp120 ВИЧ-1. Пептиды в библиотеке экспонированы на поверхности бактериофагов в составе минорного белка оболочки рIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида [9].

Метод аффинной селекции заключается в следующем. Биотинилированные моноклональные антитела иммобилизуются на пластиковой поверхности, обработанной стрептавидином, и к ним добавляется фаговая библиотека. После наступления кинетического равновесия несвязавшиеся фаги отмываются буфером, а связавшиеся с антителами фаги элюируются и размножаются для нового цикла селекции. Трех раундов аффинной селекции обычно достаточно для получения обогащенной популяции фагов, содержащих целевые последовательности [10, 11]. Для отбора всех вариантов специфичных клонов в первом раунде селекции используют насыщающее по отношению к фаговым частицам количество МКА. Для создания конкуренции между фагами за связывание с МКА и отбора наиболее специфичных вариантов во втором и третьем раундах селекции используют меньшие по отношению к фагам концентрации антител. Обогащение фаговой популяции определяют по увеличению выхода фагов после каждого раунда селекции. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после 1, 2, 3-го раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют специфичность их связывания с соответствующими МКА в ИФА. По результатам ИФА отбирают эффективно взаимодействующие с МКА фаги. Аминокислотный состав специфичных к МКА пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют секвенированием фаговых ДНК по модифицированному методу Сэнгера [12] в кодирующей пептид области.

Анализ сходства аминокислотных последовательностей отобранных пептидов с последовательностью gp120, проведенный с учетом экспонированности аминокислот на поверхности белка по данным рентгеноструктурного анализа [13], показал, что общие структурные мотивы селектированных пептидов находятся в районе 380 - 420 аминокислотных остатков в нумерации gp 120 ВИЧ-1. По-видимому, аминокислотные остатки Phe-383, Tyr-384, Ser-387, Ser-393, Thr-394, Trp-395, Leu-416, Arg-419, Leu-420 определяют связывание МКА 2G12 с белком gpl20. Данные аминокислоты удалены друг от друга в последовательности, но сближены в пространстве и образуют на поверхности gpl20 эпитоп, узнаваемый МКА 2G12 (фиг.4).

Практическое использование.

Для практического использования селектированные нами пептиды-миметики можно получать химическим синтезом или, что более экономично, с использованием рекомбинантной технологии в составе различных белков-носителей. Использование в качестве белка-носителя экспрессионного вектора на основе нитчатых бактериофагов (M13,fd), позволяющего экспонировать чужеродные пептиды на поверхности вириона, является наиболее эффективным и практичным:
- фаг, размножаясь в E/Coli, выходит в культуральную среду не лизируя клетку хозяина, что упрощает процедуру его очистки;
- фаг накапливается в культуральной среде в концентрации 10¹² вирионов на миллилитр, поэтому его легко наработать в больших количествах;
- конформация пептида, отобранного в составе фага, является оптимальной и при использовании других белков-носителей может сильно меняться;
- при встраивании пептида в поверхностный белок фага (2700 копий на вирион) получается очень эффективная мультимерная система презентации, позволяющая преодолеть проблему слабой иммуногенности пептидов. По своей эффективности такая система часто превосходит такие системы, как НВс-антиген.

Сущность изобретения заключается в том, что селектированные из фаговой пептидной библиотеки пептиды обладают свойством связываться с нейтрализующими ВИЧ-1 МКА 2G12.

Полученные нами результаты по локализации эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, соответствуют представлениям других исследователей, а также дополняют их, потому что впервые нами были предсказаны аминокислотные остатки, входящие в состав данного эпитопа. Поскольку данные антитела обладают значительным иммунотерапевтическим действием, а в сыворотках ВИЧ-инфицированых пациентов встречаются крайне редко вследствие недоступности эпитопа иммунной системе для индукции гуморального ответа [8] , то пептиды-имитаторы эпитопа 2G12 могут быть использованы при разработке рекомбинантных вакцин против ВИЧ-1 и диагностических тест-систем.

Таким образом, нами впервые получены пептиды, имитирующие полноразмерный гликопротеин gp120 по связыванию с вируснейтрализующими антителами 2G12. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки рIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг.1. Схема аффинной селекции.

Фиг. 2. Результаты взаимодействия фаговых клонов в ИФА. В качестве отрицательного контроля взят фаг fuse2, который не экспонирует рандомизованный пептид.

Фиг.3. Аминокислотные последовательности пептидов - имитаторов вируснейтрализующего эпитопа белка gp120 ВИЧ-1, узнаваемого МКА 2G12. Выделены совпадающие аминокислотные остатки.

Фиг. 4. Поверхность молекулы gpl20 ВИЧ-1. Темным цветом выделены аминокислотные остатки, входящие в состав эпитопа, узнаваемого МКА 2G12.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ проведения аффинной селекции пептидов, имитирующих вируснейтрализующий эпитоп белка gpl20 ВИЧ-1, узнаваемый моноклональными антителами 2G12.

Первый раунд аффинной селекции фаговой библиотеки проводят по следующей схеме [10] . На пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм наносят 900 мкл дистиллированной воды и 100 мкл 1М NaHCO₃, pH 8,6, добавляют 10 мкл водного стрептавидина (1мг/мл). Чашку Петри инкубируют ночь при 4^oС, сливают стрептавидин и заливают 1 мл блокирующего раствора (0,1М NaHCO₃, 5 мг/мл BSA, 0,1 мкг/мл стрептавидина, 0,02% азида натрия), инкубируют чашку при 4^oС в течение 1 ч. Отмывают чашку 6 раз буфером TBS/Tween (50мМ трис-HCl, рН7,5, Tween-20 0,5% v/v) и добавляют 400 мкл TBS/Tween, содержащий BSA (1 мг/мл) и 0,02% азид натрия, биотинилированные антитела (конечная концентрация в растворе 250 нМ), инкубируют чашку в течение 2 ч при 4^oС, затем добавляют 4 мкл 10мМ биотина, выдерживают при 4^oС в течение 1ч, отмывают чашку 6 раз с TBS/Tween, наносят 400 мкл TBS/Tween, 4 мкл 10мМ биотина и 5 мкл исходной фаговой библиотеки (5х10¹¹ вирионов). Чашку инкубируют при 4^oС в течение 4 ч, отмывают 10 раз TBS/Tween, наносят 400 мкл элюирующего буфера (0,1N HCl, рН доводится глицином до 2.2, 1 мг/мл BSA), инкубируют 10 мин, элюат переносят в пластиковые пробирки, содержащие 75 мкл 1М Трис-НСl рН 9.1 для нейтрализации кислоты, конечный рН раствора (7-8.5) проверяют индикаторной бумагой. Амплификацию фагового элюата проводят добавлением суспензии элюированных фагов к аликвоте клеток Escherichia coli К91Кan, выращенных на ТВ-среде (1,2% бактотриптон, 2,4% дрожжевой экстракт, 0,5% глицерин, 1,7мМ KH₂PO₄, 7,2мМ К₂НРO₄). Фаги выращивают в LB среде [10]. Фаги титруют с использованием клеток К91Кan, выращенных на ТВ-среде, с последующим высевом на чашки с агаром, содержащим канамицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (40 мкг/мл) и подсчетом выросших колоний. Титр фагов определяют по числу колоний (трансдуцирующих единиц (TU)) по G.P.Smith [10]. Количество фаговых частиц рассчитывают по формуле 1 TU = 20 вирионов.

Второй и третий раунд аффинной селекции проводят следующим образом. В пластиковую пробирку вносят 100 мкл фаговой суспензии (10¹¹ TU), биотинилированные МКА (конечная концентрация антител во втором раунде составляет 100 нМ, в третьем - 0,1 нМ), инкубируют в течение ночи при 4^oС, добавляют 400 мкл TBS/Tween и немедленно наносят на стрептавидинобработанную чашку (как описано выше), инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Чашку отмывают TBS/Tween, связавшиеся фаги элюируют, титруют и амплифицируют как описано выше. После третьего раунда селекции получают индивидуальные фаговые колонии, которые используют для наработки одноцепочечной ДНК и фагов для иммуноферментного анализа (ИФА). Определение последовательности ДНК проводят по модифицированному методу Сэнгера [12]. В качестве праймера используют олигонуклеотид 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG [10].

Пример 2. Анализ связывания пептидов, имитирующих высококонсервативный эпитоп белка gpl20 ВИЧ-1, с моноклональными антителами 2G12 методом ИФА.

Подтверждение специфичности связывания выделенных фагов с МКА проводят методом непрямого иммуноферментного анализа [11].

На 96-луночный планшет для ИФА (ВНИИ Медбиополимер) наносят по 50 мкл в лунку фагового препарата (10¹⁰ вирионов) и инкубируют в течение ночи в холодильнике. После 3-кратной промывки PBS/Tween в каждую лунку добавляют по 150мкл блокирующего буфера (1% раствор казеина в PBS), блокируют неспецифические места сорбции на пластике 1 ч при 37^oС, промывают 3 раза PBS/Tween и добавляют по 1 мкг биотинилированных МКА в объеме 50 мкл. После инкубации в течение суток в холодильнике промывают 3 раза PBS/Tween и добавляют по 50 мкл разбавленного в 500 раз (в блокирующем буфере) конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена. Реакцию проводят 30 мин при 37^oС, промывают планшет 6 раз PBS/Tween и добавляют по 50 мкл ЦФБ с ОФД. Выдерживают планшет 20 мин в темноте при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 50 мкл 2Н раствора серной кислоты. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре Multiscan (Labsystem).

Превышение значений оптической плотности над контролем в несколько раз позволяет считать, что отобранные фаговые клоны действительно эффективно взаимодействуют с МКА и имитируют узнаваемые МКА эпитопы белка gp120 ВИЧ-1.

Таким образом, впервые получены пептиды-имитаторы вируснейтрализующего эпитопа белка gpl20 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими антителами 2G12.

Литература
1. Coffin J.M.// Science.-1995.-Vol.267.-P.483-489.

2. Atlan H., Gerstenm M. J., Salk P. L, Salk J.// Immunol. Today., 1993. , Vol. 14., p. 200-202.

3. Delmastro P., Meola A., Monaci P., Cortese R., Golfre G. //Vaccine., 1997., Aug;15(11), p. 1276-1285.

4. Keller P.M., Arnold B.A., Show A.R., Tolman R.L., Van-Middlesworth F. , Bondy S. , Rusiecki V.K, Koening S., et al.// Virology, 1993, V. 193, p. 709-716.

5. Trcola A. , Purtscher M. , Muster Т. et al // J. Virol., 1996, P. 1100-1108.

6. Moore J., Sodroski J.//J. Virology, 1996., P. 1863-1872.

7. Trcola A. , Pomales A.B., Yuang H. et al. // J. Virology, 1995. P. 6609-6617.

8. Kunert R., Ruker F., Katinger H. // AIDS Res. Hum. Retrovir. - V. 14. , 13. - P1115-1128.

9. Scott J.K., Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library.//Science., 1990., V. 249, p. 386-390.

10. G.P. Smith Cloning in fuse vectors (laboratory manual)//1992.

11. Motti с. , Nuzzo M., Meola A., Galfre G., Felici F., Cortese R., Nicosia M. And Monaci P.//Gene, 1994, V.I 46, P. 191-198.

12. Kretz К., Callen W., Hedden V, Cycle sequencing// Methods of Enzimology. V. 154. P.527-536.

13. Kwong P. D., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. //Nature.,1998., V. 393., P. 648.

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Сущность изобретения сводится к получению с помощью фагового дисплея пептидов-имитаторов антигенной детерминанты белка gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1, ВИЧ-1, узнаваемой вируснейтрализующими моноклональными антителами 2G12. Методом аффинной селекции из фаговых пептидных библиотек получены пептиды, имитирующие полноразмерный гликопротеин gp120 по связыванию с вируснейтрализующими антителами 2G12. Пептиды экспонированы на поверхности нитчатых бактериофагов в составе минорного белка оболочки pIII, при этом каждая фаговая частица содержит 5 копий одного пептида. 4 ил.

Пептид-имитатор эпитопа белка gp120 ВИЧ-1, узнаваемый вируснейтрализующими моноклональными антителами 2G12, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную на группы последовательностей, приведенных на фиг. 3.