СПОСОБ УСКОРЕННОГО ПЕПТИДНОГО СИНТЕЗА В РАСТВОРЕ Российский патент 2004 года по МПК C07K1/02 C07K7/06 

Настоящее изобретение относится к новому и универсальному способу ускоренного пептидного синтеза в растворе, в котором наращиваемый пептид не нужно выделять до окончательной сборки требуемой последовательности.

Пептиды синтезируются либо на твердом носителе, либо в растворе. В обоих методах стадии конденсации и деблокирования чередуются в повторах и могут разделяться периодическими выделениями очисткой. В твердофазном способе полностью собранную последовательность не только заранее присоединяют к твердому носителю, но, в конечном счете, отщепляют от указанного носителя. Удаление избытка реагентов и побочных продуктов осуществляют путем фильтрации. Твердофазный синтез обладает несомненными преимуществами: он в той или иной степени широко применяется и легко автоматизируется. Однако ему присущи и серьезные недостатки. Например, реакции управляются диффузией и, как правило, весьма медленны в применяемых гетерогенных условиях: чтобы исключить утрату последовательностей, нужен сравнительно большой избыток реагентов. Кроме того, все реакционноспособные боковые цепи наращиваемого пептида должны быть защищены: поскольку периодическое выделение очисткой отсутствует, побочные реакции, обусловленные присутствием незащищенных боковых цепей, могут приводить к загрязнению конечного продукта. В большом объеме твердофазный метод осуществлять трудно из-за дороговизны реактивов и материалов.

С другой стороны, классический способ синтеза в растворимой фазе легче осуществлять в большом объеме и он менее дорогой в отношении реактивов и материалов. Как правило, полностью защищенные аминокислоты не нужны, поскольку побочные продукты, получаемые в побочных реакциях, можно удалить с помощью периодического выделения очисткой. Вместе с тем, способ синтеза в растворимой фазе нуждается в протоколах с заданной последовательностью операций, и получение полной последовательности является трудоемким процессом.

Из-за недостатков, присущих этим методам, возникает потребность в способе, который сочетал бы преимущества обоих этих классических методов, в частности, при крупномасштабном синтезе пептидов. Новый способ должен быть быстрым, нетрудным в масштабировании и широко применимым.

При синтезе в растворимой фазе на каждой стадии конденсации предпочтительно используется небольшой избыток активированного карбоксильного компонента, чтобы обеспечить количественную конденсацию с аминокислотным компонентом; поэтому случаи утраты последовательностей в конечном продукте можно избежать. Считается, что остаточный активированный карбоксильный компонент разрушается и удаляется во время периодической водной обработки. Наряду с этим, встраивание пептидных последовательностей, часто встречаемое при синтезе в растворимой фазе как загрязнение конечного пептида, связано с неполным удалением после стадии конденсации остаточного (активированного) карбоксильного компонента, который присоединяется позднее по прошествии стадии деблокирования. Для того чтобы избежать возникновения указанных побочных реакций, стадию акцептирования можно ввести сразу после стадии конденсации, что акцептирует (инактивирует) остаточные активируемые карбоксильные функции. В качестве акцепторов обычно используются амины. Применение полиаминов в качестве акцепторов приводит к акцептированию соединений, которые, в зависимости от их полярности, могут активно экстрагироваться в водную фазу, предпочтительно в кислую водную фазу [например, Kisfaludy, L. et al. (1974) Tetrahedron Lett. 19, 1785-1786]. Эту экстракцию обычно осуществляют перед стадией деблокирования, чтобы исключить потерю наращиваемого пептида в водной фазе. Однако обнаружено, что во многих случаях данная операция приводит к неполному периодическому выделению очисткой, что обусловлено гидрофобностью акцептируемого соединения: естественная гидрофобность, присущая аминоацильной части карбоксильного компонента, усиливается все еще присутствующей аминоблокирующей группой. Поэтому водное экстрагирование не вполне эффективно.

Недавно Carpino, L.A. et al. [(1999) J. Org. Chem. 64, 4324-4338] сообщили об усовершенствовании способа акцептирования. Помимо использования полиамина в качестве акцептора аминоблокирующей группы, в данном способе применили 1,1-диоксобензо[b]тиофен-2-илметоксикарбонил (Bsmoc). Функция Bsmoc обладает высокой лабильностью по отношению к основанию.

В результате этого остаточные активируемые карбоксильные функции являются акцептируемыми, а функции Bsmoc устраняются в одной и той же стадии при использовании полиамина. Применение функции Bsmoc описывается в качестве существенного усовершенствования для получения (олиго)пептидов, с использованием быстрого непрерывного метода синтеза в растворимой фазе, позволяющего собирать пептид в одной последовательности стадий за относительно короткий период времени.

В настоящее время установлено, что новый способ осуществляет быстрый непрерывный синтез пептидов в растворе, в котором используется акцептор, который позволяет фактически произвольно выбрать аминоблокирущую группу (блокирующая группа на N-конце активируемого карбоксильного компонента). В противоположность способу Carpino, деблокирование N-концевой функции не является обязательным в тех же реакционных условиях, что и акцептирование избытка активируемых карбоксильных функций. Поэтому способ настоящего изобретения имеет более общее применение, чем способ Carpino.

В соответствии с настоящим изобретением новый способ представляет собой способ ускоренного пептидного синтеза в растворе в органическом растворителе или в смеси органических растворителей, включающий повторяющиеся циклы стадий (a)-(d):

(а) стадию конденсации с использованием избытка активируемого карбоксильного компонента, который ацилирует

(b) стадию погашения, в которой акцептор используется для устранения остаточных активируемых карбоксильных функций, где акцептор может также использоваться для деблокирования наращиваемого пептида (т.е., образующегося пептида),

(c) одну или более водных экстракций, и

необязательно, (d) отдельную стадию деблокирования, возможно следующую за одной или более водными экстракциями,

отличающийся тем, что способ включает, по меньшей мере, одну стадию (b), именуемую в качестве стадии (b’), в которой амин, включающий свободный анион или латентный анион, используется в качестве акцептора остаточных активируемых карбоксильных функций.

Во время осуществления способа настоящего изобретения наращиваемый пептид не нужно выделять до получения конечной пептидной последовательности (т.е., конечного продукта способа настоящего изобретения). Поэтому данный способ представляется существенно менее трудоемким, чем классический способ синтеза в растворимой фазе, и легким для масштабирования. Способ настоящего изобретения позволяет с высокой эффективностью удалять остаточный активируемый карбоксильный компонент, не встречая трудностей, связанных с гидрофобностью или с иными процессами в данной области техники, в которой в качестве акцепторов используются полиамины. Поэтому пептиды получают с высокой степенью очистки.

Предпочтительно, на стадии (а) в способе настоящего изобретения используются молярные количества реагентов в порядке уменьшения: карбоксильный компонент, конденсирующая добавка>конденсирующий реагент>аминокомпонент. Кроме того, предпочтительным является способ, в котором на стадии (а) используется предварительно активированный карбоксильный компонент.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения на стадии (b’) амин, включающий латентный анион, используется в качестве акцептора. Предпочтительно, латентный анион в акцептирующем амине несет временную защитную группу, которая может быть избирательно удалена в присутствии любой перманентной защитной группы, присоединяемой к данному наращиваемому пептиду. В особенно предпочтительном варианте защитная группа латентного аниона в акцептирующем амине проявляет лабильность, аналогичную лабильности временной защитной группы, представленной на N-конце наращиваемого пептида. Это позволяет деблокировать акцептор, дающий этот анион, и деблокировать N-конец наращиваемого пептида для осуществления одностадийного способа. Особенно предпочтительным является способ настоящего изобретения, в котором временные защитные группы, присутствующие на N-конце наращиваемого пептида и необязательно присутствующие в акцепторе, представляют собой гидрогенолитически удаляемые группы, тогда как перманентные деблокирующие группы представляют собой ацидолитически удаляемые защитные группы. Предпочтительно, указанные временные защитные группы представляют собой группы бензильного типа, например (замещенные) бензильные и бензилоксикарбонильные группы. Предпочтительный акцептор представляет собой первичный амин, включающий свободный анион или латентный анион, и, в особенности, аминокислотное производное, блокированное на С-конце. Кроме карбоксилата, акцептирующий амин может включать другие анионные функции, такие как, но не ограниченные, сульфонатная, сульфатная, фосфонатная, фосфатная или фенолятная. Высоко предпочтительной аминокислотой для использования в качестве акцептора является β-аланин или его производное (например, производное сложного эфира или силилирующего сложного эфира). Наиболее предпочтительным акцептором является бензильный β-аланинат или его соль.

В соответствии со способом настоящего изобретения тиол, включающий свободный или латентный анион, также может использоваться в качестве акцептора вместо амина, включающего свободный или латентный анион.

Данный акцептор предпочтительно используется в двух- шестикратном молярном избытке по отношению к остатку активного компонента, который нужно акцептировать.

Такое использование акцептора в соответствии с настоящим изобретением дает гидрофильные акцептируемые соединения, которые могут активно экстрагироваться в щелочной водной фазе после стадии деблокирования: после деблокирования (в случае применения) у акцептируемых видов усиливается гидрофильность из-за присутствия свободной аминофункции и свободной карбоксильной функции. Таким образом, способ настоящего изобретения имеет своим результатом очень эффективное периодическое выделение очисткой, обусловленное возможностью активно экстрагировать гидрофильное акцептируемое соединение. Кроме того, по-видимому, присутствующий избыток карбоксильного компонента, который не активируется, и временная защитная группа которого также была удалена во время деблокирования, экстрагируется из реакционной смеси в это же время.

В соответствии со способом настоящего изобретения, по меньшей мере, один цикл, а возможно и более циклов данного способа включает(ют) стадию (b’), в которой свободный анион или латентный анион используются в качестве акцептора остаточных активируемых карбоксильных функций. Однако, в соответствии с последующим вариантом осуществления настоящего изобретения, данный способ может также включать один или более циклов, в котором на стадии (b) в качестве акцептора используется полиамин, такой как 3-диметиламино-1-пропиламин.

Другой предпочтительный способ настоящего изобретения включает один или более циклов, в котором на стадии (b) деблокирование не происходит (поскольку условия выбраны так, что акцептор используется только для погашения, например, с использованием защитной группы Z и амина, включающего латентный анион в качестве акцептора), а следующая стадия (с) включает последовательные щелочную, кислотную и щелочную экстракции, которые предпочтительно осуществляют в присутствии хлорида натрия или нитрата калия. Данный способ включает следующую затем стадию (d), которая включает деблокирование и последовательные щелочную и нейтральную экстракции; данные экстракции предпочтительно осуществляют в присутствии хлорида натрия или нитрата калия.

Другой предпочтительный способ настоящего изобретения включает один или более циклов, в которых на стадии (b) происходит погашение и деблокирование (например, с использованием защитной группы Bsmoc и полиамина в качестве акцептора), а следующая стадия (с) включает последовательные щелочную и нейтральную экстракции, которые предпочтительно осуществляют в присутствии хлорида натрия или нитрата калия.

Предпочтительным также является способ, в котором в последнем цикле на стадии (а) защитные группы карбоксильного компонента проявляют лабильность, аналогичную для перманентных защитных групп аминокомпонента, а на стадии (b) акцептор представляет собой полиамин.

В соответствии с настоящим изобретением данный способ можно осуществить в нескольких органических растворителях, которые обычно используются при получении пептидов. Высоко предпочтительным органическим растворителем является этилацетат. Предпочтительной также является смесь этилацетата и других органических растворителей, таких как, например, дихлорметан, 1-метил-2-пирролидинон, N,N-диметилформамид или тетрагидрофуран.

Способ настоящего изобретения можно осуществить при температурах, хорошо известных в данной области техники для таких стадий в классическом пептидном синтезе в растворе. Однако предпочтительно осуществлять данный способ в температурном диапазоне от 0 до 50°С, но особенно при температуре окружающей среды.

Способ настоящего изобретения весьма пригоден для комбинационного синтеза пептидных библиотек с использованием способа разделения и смешивания. Присоединения осуществляются раздельно, а индивидуальные конденсирующие смеси объединяют для экстрагирования и деблокирования.

Способ настоящего изобретения весьма пригоден для автоматизации, поскольку используются общепринятые протоколы. Новый способ настоящего изобретения представляет собой высокоэффективный способ, который удобно использовать для получения олиго- и полипептидов с высокой степенью очистки.

В соответствии с настоящим изобретением подходящий способ заключается в конденсации избытка карбоксильного компонента с аминокомпонентом, в котором карбоксильная группа преактивируется или активируется In situ с использованием конденсирующего реагента и, если требуется, добавки. После стадии конденсации остаточные активируемые карбоксильные функции акцептируются путем добавления акцептора в реакционную смесь и перемешивания, как правило, после водной экстракции. После или во время акцептирования временные защитные группы удаляются с использованием соответствующих способов, известных в данной области техники, как правило, после удаления акцептируемого соединения с помощью водной экстракции. В это же время допускается присутствие избытка карбоксильного компонента, который не активирован, и удаление временной защитной группы в течение деблокирования, а также других водорастворимых реагентов, и экстрагирование побочных продуктов из данной реакционной смеси. Далее могут следовать стадии второго цикла конденсации, погашения, деблокирования и экстракции в зависимости от длины требуемого пептида.

Термин аминокомпонент относится к молекуле, включающей свободную аминогруппу. В частности, данный аминокомпонент может представлять собой любой амин, аминокислоту или олигопептид, который несет свободную функциональную аминогруппу, и в которых другие функциональные группы защищены таким образом, что они не препятствуют искомой реакции конденсации. С-концевая функция применяемой аминокислоты или олигопептида может быть защищена в качестве замещенного или незамещенного амида или в качестве сложного эфира; примеры последнего включают, но не ограничены, метильный, этильный, трет-бутильный, бензильный, фенацильный, 3-(3-метил)пентильный (Мре), 2-(2-фенил)пропильный (Рр), 2-хлортритильный (Clt), дифенил(4-пиридил)метильный (PyBzh), дициклопропилметильный (Dcpm), 9-флуоренилметильный (Fm), аллильный (All), 2-(триметилсилил)этильный (Tmse), 4-{N-[1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил]амино}бензильный (Dmab) эфиры и ферментативно расщепляемые сложные эфиры [Roeske, R.W. (1981) в 'The Peptides', vol. 3 (Gross, E. and Meienhofer, J., eds.) Academic Press, New York, pp. 101-136; по Мре: (1996) Tetrahedron Lett. 37, 4343-4246; по Pp: Yue, C. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34. 323-326; по Cit: Athanassopoulus, P. eЈ al (1995) Tetrahedron Lett. 36, 5645-5648; no PyBzh: Mergler, M. et al. (2001) P154, 2^nd International Peptide Symposium & 17^th American Peptide Symposium; пo Dcpm; Carpino, L.A. et al. (1995) J. Org. Chem. 60, 7718-7719; no Fm: Al-Obeidi, F. et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35, 215-218; no All: Kunz, H. et al. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 26, 493-497; no Tmse: Sieber, P. (1977) Helv. Chim Acta 60, 2711-2716; no Dmab: Chan, W.C. et al. (1995) J. Chem. Soc., Chem Commun., 2209-2210]. Функции трет-бутильного типа или функции аналогичной лабильности предпочтительны для перманентной защиты других функциональных групп в аминокомпонентах; они включают, но не ограничены, трет-бутильную (^tВu) для защиты боковых цепей Asp, Glu, Ser, Thr и Tyr, трет-бутоксикарбонильную (Воc) для защиты боковых цепей Lys и Тrp, тритильную (Trt) для защиты боковых цепей Asn, Gln и His и 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонильную (Рmc) или 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильную (Pbf) для защиты боковой цепи Arg [Barany, G. and Merrifield, R.B. (1980) в: The Peptldes’, vol. 2 (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.) Academic Press, New York, pp. 1-284; no Trp (Boc): , H. et al. (1984) J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1699-1700; no Asn (Trt) и Gln (Trt): Sieber, P. and Riniker B. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 739-742; по His (Trt): Sieber, P. and Riniker B. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 6031-6034; no Pmc: Ramage, R. and Green, J. (1987) Tetrahedron Lett. 28, 2287-2290; no Pbf; Carpino, L.A. и et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34, 7829-7832].

Термин карбоксильный компонент относится к молекуле, включающей свободную карбоксильную функцию. В частности, карбоксильный компонент может представлять собой карбоновую кислоту, аминокислоту или олигопептид, который несет свободную карбоксильную функцию, а другие функциональные группы которого защищены таким образом, что они не препятствуют искомой реакции конденсации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения аминогруппа применяемой аминокислоты или олигонуклеотида временно защищена с помощью бензилоксикарбонильной (Z) функции; другие примеры включают, но не ограничены, функции Воc, Trt, флуорен-9-илметоксикарбонильную (Fmoc), 2-(метилсульфонил)этоксикарбонильную (Msc), аллилоксикарбонильную (Alloc), функции арилсульфонильного типа, такую как орто-нитробензолсульфонильная (o-NBS), и ферментативно расщепляемые функции [Geiger, R. and , W. (1981) in: The Peptldes’, vol. 3 (Gross, E and Meienhofer, J. eds.) Academic Press, New York, pp. 1-99; no Alloc: Kunz, H. and Unverzagt, C. (1984) Angew. Chem. 96 426-427; для арилсульфонила: Fukuyama, Т. et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38 5831-5834]. Функции трет-бутильного типа или функции со сходной лабильностью предпочтительны для перманентной защиты других функциональных групп в данном карбоксильном компоненте, как описано выше для аминокомпонента. Карбоксильный компонент может быть преактивирован в виде активного сложного эфира, предпочтительно сложного эфира N-гидроксисукцинимида, бензотриазол-1-ила, пентафторфенила или 4-нитрофенила, галогенида, N-карбоксиангидрида или в виде симметричного ангидрида. Альтернативно карбоксильный компонент может быть активирован in situ в виде смешанного ангидрида или с использованием конденсирующего агента, такого как карбодиимид, предпочтительно N,N’-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорид (EDC), урониевой или фосфониевой соли как вероятной конденсирующей добавки, предпочтительно N-гидроксисукцинимида (HONSu), 1-гидроксибензотриазола (HOBt), 3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазина (HOOBt), 1-гидрокси-7-азабензотриазола (HOAt) или 6-хлор-1-гидроксибензотриазола (Cl-HOBt) и, при необходимости, в присутствии третичного амина [‘The Peptldes’, vol. 1 (1979) (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.) Academic Press, New York; Li, P. and Xu, J.-C. (2000) Chin. J. Chem. 18, 456-466].

Временная защитная группа может быть удалена в соответствии со способами, известными в данной области техники (см. выше). Z-функцию можно удалить с помощью гидрогенолиза с использованием стандартных методик, например газообразным водородом или формиатом в качестве донора водорода. Во время этого процесса защитные группы бензильного типа удаляются, а сохраняются защитные группы трет-бутильного типа или функции со сходной лабильностью. Последние могут быть удалены путем ацидолиза в соответствии со способами, известными в данной области техники.

Специалистам в данной области понятно, что означает термин щелочная водная экстракция. Однако щелочные водные экстракции предпочтительно осуществляют с использованием водных растворов кислой углекислой соли или карбоната натрия, если требуется, в присутствии хлорида натрия или нитрата калия. Термин активная водная экстракция относится к экстракции, в которой либо аминокомпонент экстрагируется в кислой среде в протонированной форме (аммоний), либо карбоксильный компонент экстрагируется в щелочной среде в депротонированной форме (карбоксилат).

Далее настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не рассматриваются как ограничение настоящего изобретения.

Пример 1

Boc-Gly-Phe-Asp(O^tBu)-Ser(^tBu)-O^tBu

1-й цикл. В перемешиваемый раствор, содержащий 4,34 г H-Ser(^tBu)-OtBu в смеси этилацетата и дихлорметана при 20°С, добавляют 3,24 г 1-гидроксибензотриазола, 7,76 г Z-Asp(^tBu)-ОН, 4,20 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и 2,42 мл 4-метилморфолина. После перемешивания к полученному раствору еще до завершения данной реакции добавляют 1,21 мл 4-метилморфолина и 3,51 г бензильной β-аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Данную смесь перемешивают в течение следующих 30 минут и экстрагируют с помощью 5% Na₂CO₃/10% NaCl, 5% KHSO₄/10% NaCl и 5% Na₂CO₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий блокированный дипептид Z-Asp (O^tBu)-Ser(^tBu)-O^tBu, подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. После завершения реакции добавляют 5% Na₂CO₃/10% NaCl и полученную суспензию фильтруют. Полученный остаток промывают смесью этилацетата и дихлорметана, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Na₂CO₃/10% NaCl и 30% NaCl.

2-й цикл. К органическому слою, содержащему дипептид Н-Аsp(O^tВu)-Sеr(^tВu)-О^tBu при 20°С, добавляют 3,24 г 1-гидроксибензотриазола, 7,18 г Z-Phe-OH, 4,20 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и 2,42 мл 4-метилморфолина. После перемешивания к полученному раствору еще до завершения данной реакции добавляют 1,21 мл 4-метилморфолина и 3,51 г бензильной β-аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Данную смесь перемешивают в течение следующих 30 минут и экстрагируют с помощью 5% Na₂CO₃/10% NaCl, 5% KHSO₄/10% NaCl и 5% Na₂CO₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий блокированный трипептид Z-Phe-Asp(O^tBu)-Ser(^tBu)-O^tBu, подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. После завершения реакции добавляют 5% Na₂CO₃/10% NaCl и полученную суспензию фильтруют. Полученный остаток промывают смесью этилацетата и дихлорметана, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Nа₂СО₃/10% NaCl и 30% NaCl.

3-й цикл. К органическому слою, содержащему трипептид H-Phe-Asp(O^tBu)-Ser(^tBu)-O^tBu при 20°С, добавляют 3,24 г 1-гидроксибензотриазола, 4,21 г Boc-Gly-OH, 4,20 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и 2,42 мл 4-метилморфолина. После перемешивания к полученному раствору еще до завершения данной реакции добавляют 1,25 мл З-диметиламино-1-пропиламина. Смесь перемешивают в течение следующих 30 минут и экстрагируют с помощью 5% Nа₂СО₃/10% NaCl, 5% KHSO₄/10% NaCl, 5% Na₂CO₃/10% NaCl, 30% NaCl и воды. Органический слой упаривают досуха, а полученный остаток тритируют метиловым трет-бутиловым эфиром и сушат до получения требуемого блокированного тетрапептида с 95%-м выходом от исходного материала H-Ser(^tBu)-O^tBu. Данный процесс завершается в течение 6 часов.

Очистка: 98,1% в обращенно-фазовой ВЭЖХ (24-68% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте в течение 29 минут при 220 нм, 2,0 мл/мин, 5-микронная колонка C₁₈. Идентичность: m/z 425,4 [М-Вос-3^tBu+Н]⁺, 469,4 [М-4^tВu+Н]⁺, 525,4 [М-3^tBu+Н]⁺, 581,4 [М-2^tВu+Н]⁺, 637,4 [М-^tBu+Н]⁺, 693,4 [М+Н]⁺ электрораспылительная MS (масс-спектрометрия); ¹H ЯМР (СDСl₃) δ 1,16 (с, 9Н), 1,44 (м, 27Н), 2,59 (дд, 1Н), 2,79 (дд, 1Н), 3,09 (м, 2Н), 3,51 (дд, 1Н), 3,69-3,86 (м, 3Н), 4,47 (м, 1Н), 4,67-4,78 (м, 2Н), 5,20 (уш.с, 1Н), 6,68 (д, 1Н), 7,12-7,34 (м, 7Н).

Пример 2

H-His-Trp-Ser(^tBu)-Tyr(^tBu)-D-Leu-Leu-Orn (Bос)-Pro-O^tBu

1-й цикл. К перемешиваемому раствору, содержащему 1300 г H-Pro-O^tBu.HCl в этилацетате при 20°С, было добавлено 1014 г 1-гидроксибензотриазола, 2756 г Z-Orn(Воc)-ОН, 1378 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и 1495 мл 4-метилморфолина. После перемешивания, еще до завершения реакции, к полученному раствору добавляют 377 мл 4-метилморфолина и 1105 г бензильной β-аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Полученную смесь перемешивают еще 30 минут и экстрагируют 5% Na₂CO₃/10% NaCl, 5% KHSO₄/10% NaCl и 5% Na₂CO₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий блокированный дипептид Z-Orn(Воc)-Pro-O^tBu, подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. После завершения данной реакции добавляют 5% Na₂CO₃/15% NaCl и эту полученную суспензию фильтруют. Полученный остаток промывают этилацетатом, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Nа₂СО₃/15% NaCl и 30% NaCl. Разделенные водные слои повторно экстрагируют этилацетатом.

2-й цикл: К объединенным органическим слоям, содержащим дипептид Н-Оrn(Воc)-Pro-O^tBu при 20°С, добавляют 1014 г 1-гидроксибензотриазола, 1993 г Z-Leu-OH, 1320 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и добавляют 754 мл 4-метилморфолина. После перемешивания к полученному раствору, еще до завершения данной реакции, добавляют 377 мл 4-метилморфолина и 1105 г бензильной β-аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Эту смесь перемешивают в течение последующих 30 минут и экстрагируют 5% Na₂CO₃/10% NaCl, 5% KHSO₄/10% NaCl и 5% Na₂CO₃/10% NaCl.

Органический слой, содержащий блокированный трипептид Z-Leu-Orn(Boc)-Pro-O^tBu подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. После завершения данной реакции добавляют 5% Na₂CO₃/15% NaCl и эту полученную суспензию фильтруют. Полученный остаток промывают этилацетатом, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Na₂CO₃/10% NaCl и 30% NaCl.

3-й цикл. К органическому слою, содержащему трипептид Н-Lеu-Оrn(Вос)-Рrо-O^tВu при 20°С, добавляют 1014 г 1-гидроксибензотриазола, 1993 г Z-D-Leu-OH, 1320 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида и добавляют 754 мл 4-метилморфолина. После перемешивания к полученному раствору, еще до завершения данной реакции, добавляют 377 мл 4-метилморфолина и 1105 г бензильной β-аланинатной пара-толуолсульфонатной соли. Эту смесь перемешивают в течение последующих 30 минут и экстрагируют 5% Na₂CO₃, 5% KHSO₄ и 5% Na₂CO₃.

Органический слой, содержащий блокированный трипептид Z-D-Leu-Leu-Orn(Boc)-Pro-O^tBu, подвергают каталитическому гидрогенолизу в присутствии палладия на угле. После завершения данной реакции добавляют 5% Na₂CO₃ и эту полученную суспензию фильтруют. Полученный остаток промывают этилацетатом, а объединенные органические фильтраты экстрагируют 5% Nа₂СО₃/10% NaCl и 10% NaCl.

4 - 7-й циклы. Данные циклы осуществляют после проведения третьего цикла, заменяя 1993 г Z-D-Leu-OH на, соответственно, Z-Tyr(^tBu)-ОН (выделенный в свободном состоянии из 4497 г соответствующей дициклогексиламмонийной соли), 2218 г Z-Ser(^tBu)-ОН, 2538 г Z-Trp-OH и 2172 г Z-His-ОН. Однако, начиная с пятого цикла, количества 4-метилморфолина и бензильной β-аланинатной пара-толуолсульфонатной соли в течение акцептирующей стадии удваивается. В пятом цикле после акцептирования экстракции осуществляют при 35°С. В седьмом цикле конденсацию осуществляют при 3°С, 1014 г 1-гидроксибензотриазола заменяют на 2561 г 6-хлор-1-гидроксибензотриазола и после 1 часа конденсации дополнительно добавляют 132 г 1-(3’-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимидгидрохлорида. Кроме того, в седьмом цикле после гидрогенолиза экстракции осуществляют при 35°С. В конце седьмого цикла органический слой упаривают досуха с получением на выходе 73% требуемого блокированного нонапептида от исходного материала Н-Рrо-O^tBu.HCl (т.е., в среднем 98% на химическую стадию).

Очистка: 90,6% в обращенно-фазовой ВЭЖХ (24-68% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте за 29 минут при 220 нм, 2,0 мл/мин, 5-микронная колонка C₁₈). Идентичность: с помощью электрораспылительной MS m/z 543,6 [M-Boc-2^tBu+H]²⁺, 571,6 [M-Boc-^tBu+2H]²⁺, 599,6 [М-ВОС+2Н]²⁺, 649,8 [M+2H]²⁺, 1298,0 [М+Н]⁺.

Выводы. Защищенные пептиды получены без периодического выделения промежуточных продуктов. Степень чистоты и идентификация полученного продукта из первого примера свидетельствуют, что избыток (активированных) карбоксильных компонентов полностью удаляется на всех стадиях данных способов, и при использовании способа настоящего изобретения вставленные последовательности не обнаруживаются. Более того, синтез, осуществленный во втором примере, свидетельствует, что синтез, выполненный в соответствии со способом настоящего изобретения, бесспорно, высокого качества. Продукты из обоих примеров получены с высоким выходом и высокой степенью чистоты за сравнительно короткий период времени.

Настоящее изобретение относится к способу ускоренного пептидного синтеза в растворе, включающему повторяющиеся циклы стадий (a)-(d):(a), стадию конденсации с использованием избытка активированного карбоксильного компонента, который ацилирует аминокомпонент; (b) стадию погашения, в которой акцептор используется для удаления остаточных активированных карбоксильных функций, в которой данный акцептор может использоваться также для деблокирования наращиваемого пептида, (c) одну или более водных экстракций; и необязательно, (d) отдельную стадию деблокирования, после одной или более экстракций, при этом способ включает, по меньшей мере, одну стадию (b), которую называют стадией (b'), в которой амин, включающий свободный анион или латентный анион, представляющий собой соответственно деблокированную аминокислоту или производное блокированной аминокислоты, используется в качестве акцептора остаточных активированных карбоксильных функций. При использовании способа настоящего изобретения наращиваемый пептид не нуждается в выделении, пока не будет получена конечная пептидная последовательность. Высокоэффективный способ может использоваться для получения олиго- и полипептидов с высокой степенью очистки. 4 н. и 22 з.п. ф-лы.

1. Способ ускоренного пептидного синтеза в растворе в органическом растворителе или в смеси органических растворителей, включающий повторяющиеся циклы стадий (а)-(d): (а) стадию онденсации с использованием избытка активированного карбоксильного компонента, который ацилирует аминокомпонент; (b) стадию погашения, в которой используется акцептор для удаления остаточных активированных карбоксильных функций, при том, что акцептор может также использоваться для деблокирования наращиваемого пептида; (с) одну или более водных экстракций; и, необязательно, (d) отдельную стадию деблокирования, после одной или более водных экстракций, при этом способ включает, по меньшей мере, одну стадию (b), названную стадией (b’), в которой амин, включающий свободный анион или латентный анион, представляющий собой соответственно деблокированную аминокислоту или производное блокированной аминокислоты, используется в качестве акцептора остаточных активированных карбоксильных функций.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (а) молекула, включающая активированную карбоксильную функцию, образуется путем взаимодействия карбоксильного компонента, конденсирующей добавки и конденсирующего реагента, при этом молярные количества используемых реагентов представлены в убывающем порядке: карбоксильный компонент, конденсирующая добавка > конденсирующий реагент > аминокомпонент.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (а) используется предварительно активированный карбоксильный компонент.4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии (b’) амин, включающий латентный анион, используется в качестве акцептора.5. Способ по п.4, отличающийся тем, что латентный анион в акцептирующем амине несет временную защитную группу, которая может быть селективно удалена в присутствии любых перманентных защитных групп, присоединенных к наращиваемому пептиду.6. Способ по п.4 или 5, отличающийся тем, что латентный анион в акцептирующем амине несет временную защитную группу, которая проявляет лабильность, аналогичную лабильности временной защитной группы, представленной на N-конце наращиваемого пептида.7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что временные защитные группы представляют собой гидрогенолитически удаляемые группы, а перманентные защитные группы представляют собой ацидолитически удаляемые группы.8. Способ по п.7, отличающийся тем, что временные защитные группы представляют собой группы бензильного типа.9. Способ по любому из пп.4-8, отличающийся тем, что акцептор представляет собой первичный амин, включающий свободный анион или латентный анион.10. Способ по п.9, отличающийся тем, что первичный амин представляет собой аминокислотное производное, блокированное на С-конце.11. Способ по п.10, отличающийся тем, что аминокислота представляет собой β-аланин или его производное.12. Способ по п.11, отличающийся тем, что акцептор представляет собой бензил-β-аланинат или его соль.13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что включает один или более циклов, в котором на стадии (b) полиамин используется в качестве акцептора.14. Способ по любому из пп.1-13, включающий один или более циклов, в котором на стадии (b) деблокирование не происходит, а следующая стадия (с) включает последовательные щелочную, кислотную и щелочную экстракции.15. Способ по п.14, отличающийся тем, что экстракции осуществляют в присутствии хлорида натрия или нитрата калия.16. Способ по п.14 или 15, включающий следующую стадию (d), которая включает деблокирование и последовательные щелочную и нейтральную экстракции.17. Способ по п.16, отличающийся тем, что экстракции осуществляют в присутствии хлорида натрия или нитрата калия.18. Способ по любому из пп.1-13, включающий один или более циклов, в котором на стадии (b) происходит погашение и деблокирование, а следующая стадия (с) включает последовательные щелочную и нейтральную экстракции.19. Способ по п.18, отличающийся тем, что экстракции осуществляют в присутствии хлорида натрия и нитрата калия.20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что в последнем цикле на стадии (а) защитные группы карбоксильного компонента проявляют лабильность, аналогичную лабильности перманентных защитных групп наращиваемого пептида, а на стадии (b) акцептор представляет собой полиамин.21. Способ по любому из пп.1-20, отличающийся тем, что органический растворитель или смесь органических растворителей представляет собой этилацетат или смесь этилацетата и дихлорметана, смесь этилацетата и 1-метил-2-пирролидинона, смесь этилацетата и N,N-диметилформамида или смесь этилацетата и тетрагидрофурана.22. Способ по любому из пп.1-21, отличающийся тем, что осуществляется в температурном диапазоне 0 - 50°С.23. Способ по п.22, отличающийся тем, что осуществляется при температуре окружающей среды.24. Способ комбинационного синтеза библиотеки пептидов с использованием способа расщепления и смешивания, в котором применяют способ по любому из пп.1-23.25. Способ автоматизированного пептидного синтеза в растворе, в которо применяют способ по любому из пп.1-24.26. Пептид или смесь пептидов, получаемые в соответствии со способом, включающим способ по любому из пп.1-25.