СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛО(ARG-GLY-ASP-DPHE-NMEVAL) Российский патент 2005 года по МПК C07K7/64 A61K38/12 A61P35/00 

Изобретение относится к новому способу получения циклического пентапептида цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

Циклические пентапептиды, в том числе цикло(Аrg-Gly-Аsр-DРhe-NMeVal) и его физиологически приемлемые соли, описаны в ЕР 0770622. Данное изобретение следует рассматривать как набор изобретений, связанных с заявкой ЕР 0770622.

Обычно циклические пептиды получают путем циклизации линейной молекулы-предшественника при обычных для пептидного синтеза условиях.

Чтобы обеспечить избирательность при образовании связей между двумя аминокислотами или двумя сегментами, состоящими из нескольких аминокислот, что необходимо для циклизации линейного пептида, определенные функциональные группы аминокислот, которые не должны принимать участие в реакции, следует блокировать подходящими защитными группами. В связи с этим, были разработаны различные типы защитных групп для функциональных аминогрупп и карбоксильных, гидроксильных, тиоловых или карбоксамидных функциональных групп, а также для гуанидиновой функциональной группы или имидазола азота; комбинирование этих защитных групп открывает широкие возможности оптимизации вышеупомянутых реакций. Синтез линейных молекул-предшественников - линейных пептидов - можно производить двумя способами: путем твердофазного пептидного синтеза либо в растворе. В этом случае можно осуществлять поэтапное связывание аминокислот или сегментов конденсирования фрагментов аминокислот. Соответствующие этапы связывания можно, в свою очередь, осуществлять либо при помощи различных конденсирующих реагентов, например карбодиимидов, карбодиимидазола, реагентов уронового типа, в частности TBTU (ТБТУ), либо применяя методы смешанных ангидридов или методы активных сложных эфиров.

Предмет изобретения состоит в разработке нового, улучшенного относительно прототипа, способа получения цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

Было обнаружено, что при синтезе циклопептида цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) путем циклизации линейной молекулы-предшественника комбинация защитных групп 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонила (Pbf(Пбф)) для гуанидиновой группы в боковой цепи аргинина и бензила (Вzl(Бзл)) для карбоксильной группы в боковой цепи аспарагиновой кислоты позволяет оптимизировать процесс в отношении выхода готового продукта.

Таким образом, изобретение относится к способу получения циклического пентапептида

цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)

путем циклизации линейного пентапептида, выбираемого из группы, состоящей из:

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DFhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH,

последующего удаления защитной группы и, при необходимости, дальнейшего преобразования в его физиологически приемлемые соли.

Кроме того, изобретение относится к способу получения циклического пентапептида

цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)

как описано выше, отличающемуся тем, что циклизируют линейный пентапептид H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH.

Для этой реакции циклизации линейные пептиды выбирают из группы, состоящей из

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH.

Условия проведения этой реакции в отношении выбора дегидратирующего агента, инертного растворителя и температуры реакции, а также последующей реакции преобразования продукта в физиологически приемлемые соли уже раскрыты в ЕР 0770622.

Остаток бензильной защитной группы в боковой цепи аспарагиновой кислоты можно удалить по известным методикам (см.: T.W.Greene, P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 2-е изд., Wiley, Нью-Йорк, 1991 или P.J.Kocienski, Protecting Groups, 1-е изд., George Thieme Verlag, Штуттгарт-Нью-Йорк, 1994, H.Kunz, H.Waldmann в Comprehensive Organic Synthesis, том. 6 (ред. В.М.Trost, I.Fleming, E.Winterfeldt), Pergamon, Оксфорд. 1991, стр. 631-701), например, путем обработки водородом в присутствии катализатора (например, катализатора из благородного металла, в частности - палладия на угле). Подходящими растворителями являются спирты, например метанол или этанол, а также амиды, в частности - DMF, или их смеси с другими инертными растворителями, например с водой. Как правило, гидрогенолиз проводят при температурах в интервале приблизительно от 0 до 100°С и давлениях в интервале приблизительно от 1 до 200 бар, предпочтительно при 20-30°С и 1-10 бар.

Защитную группу Pbf (Пбф), введенную в пептидную химию L.A.Carpino и др. Tet. Lett. 1993, 34, 7829-7832, удаляют, например, путем обработки 95% трифторуксусной кислотой (ТFА(ТФУ)). Защитная группа Рbf(Пбф) в этом случае проявляет большую неустойчивость по отношению к ТFА(ТФУ), чем обладающие аналогичной структурой защитные группы 4-метокси-2,3,6-триметилфенилсульфонил (Mtr(MTp)) и 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (Рmс(Пмх)), которые тоже можно применять в качестве защитных групп для боковой цепи при синтезе цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

ТFА(ТФУ) предпочтительно применяют в избытке, без добавления другого растворителя. ТFА(ТФУ) можно также использовать в смеси с инертным растворителем, например можно использовать комбинацию ТFА(ТФУ)/дихлорметан в соотношении 6:4. Кроме того, ТFА(ТФУ) можно применять с добавлением 1-10% воды, предпочтительно 2%. Реакцию разложения целесообразно проводить при температуре в интервале приблизительно от 0 до 50°С, предпочтительно от 15 до 30°С (комнатная температура).

Аббревиатуры, используемые в данном описании, относятся к радикалам следующих аминокислот:

Asp Аспарагиновая кислота

Arg Аргинин

Gly Глицин

Phe Фенилаланин

Val Валин

Кроме того, выше и далее следующие сокращения имеют такие значения:

Вое Бок трет-Бутоксикарбонил

Bzl Бзл Бензил

СНА ЦГА Циклогексиламин

D D Характеристика D-аминокислоты

DCCI ДЦКИ Дициклогексилкарбодиимид

DMAP ДМАП Диметиламинопиридин

DMF ДМФ Диметилформамид

EDCI ЭДКИ карбохлорид N-Этил-N'-(3

диметиламинопропил)карбодиимида

Et Эт Этил

Fmoc Фмок 9-Фторэнилметоксикарбонил

HOBt ГОБт 1-Гидроксибензотриазол

Me Me Метил

МТВЕ МТБЭ Метил трет-бутиловый эфир

Mtr Мтр 4-Метокси-2,3,6-триметилфенилсульфонил

Nme NМe N-метилированная α-аминогруппа

NMP NMП N-метилпирролидон

OtBu ОтБу Трет-бутиловый эфир

ОМе ОМе Метиловый эфир

OЕt ОЭт Этиловый эфир

Pbf Пбф 2,2,4,6,7-Пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил

Рmc Пмх 2,2,5,7,8-Пентаметилхроман-6-сульфонил

РОА ФОА Феноксиацетил

Рr Пр Пропил

Su Су Сукцинимид

TBTU ТБТУ тетрафтороборат 2-(1Н-Бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-

тетраметилурония

TFA ТФУ Трифторуксусная кислота

Z Z Бензилоксикарбонил

Кроме того, было обнаружено, что конкретный выбор именно защитной группы Pbf (Пбф) для боковой цепи Аrg и Вzl (Бзл) для Asp даже при синтезе линейных пептидов, которые как упомянуто ранее, являются промежуточными продуктами при синтезе цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal), обеспечивает повышение выхода готового продукта на соответствующих стадиях синтеза. В результате, выход цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) в целом возрастает, что приводит к соответствующему снижению стоимости синтеза.

Повышение выхода достигается в этом случае как при твердофазном пептидном синтезе, так и при синтезе в растворе линейных пептидов

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH, в частности

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH.

Защищенные аминокислоты или аминокислотные фрагменты, которые применяются в этих двух методах синтеза, обычно получают путем аминокислотного и пептидного синтеза, описанного в классических работах Principles of Peptide Synthesis, ред. М.Bodansky, Springer Verlag Берлин 1984; Houben Weyl, Methoden der organischen Chemie [Methods of Organic Chemistry], 1.с., Том 15/11, 1974, страницы 1-806, Georg Thieme Verlag Штуттгарт; Calbioehem/Novabiochem Catalogue and Synthesis Handbook 1999; Synthesis Notes or Peptide Synthesis Protocols, ред. M.W.Pennington and B.M.Dunn в Methods in Molecular Biology, Том. 35, Humana Press Totowa N.J, 1994. В этих и других, не упомянутых здесь, работах указаны условия проведения реакций, необходимых для осуществления синтеза.

Основополагающие принципы твердофазного пептидного синтеза были заложены B.F.Gysin и R.B.Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 3102 и далее). Твердофазный синтез линейных пептидов, описанный ранее, их удаление и очистку можно проводить по методикам, приведенным в работах A.Jonczyk и J.Meienhofer в Peptides, Proc. 8^th Am. Pept. Symp., ред. V.Hruby и D.H.Rich, Pierce Сотр. III, стр. 73-77, 1983 и Angew. Chem. 1992, 104, 375-391.

Особенно предпочтительно проводить синтез одного из указанных выше линейных пептидов конвергентно, путем конденсации фрагментов.

Кроме того, изобретение относится к способу получения циклического пентапептида цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal), отличающегося тем, что синтез линейного пептида H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH проводят конвергентно путем конденсации фрагментов трипептида H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH, где R¹ является защитной группой аминогруппы, с дипептидом H-Arg(Pbf)-Gly-R², где R² является защитной группой карбоксильной группы, и защитные группы R¹ и R² впоследствии удаляют.

R¹, как описано выше, является защитной группой аминогруппы. Выражение “защитная группа аминогруппы” широко известно и относится к группам, подходящим для защиты (или блокирования) аминогруппы от химических реакций. Типичными группами этого типа являются, в частности, незамещенные или замещенные ацильная, арильная, аралкоксиметильная или аралкильная группы. Так как после проведения целевой реакции (или последовательности реакций) защитные группы аминогруппы удаляют, их природа и размер не имеют существенного значения, тем не менее, предпочтительными являются защитные группы, содержащие 1-20 атомов С. В контексте данного изобретения, выражение “ацильная группа” следует интерпретировать в широком смысле. Оно включает ацильные группы, которые являются производными алифатических, аралифатических, алициклических, ароматических или гетероциклических кислот, либо сульфоновых кислот, а также алкоксикарбонильную, алкенилоксикарбонильную, арилоксикарбонильную и, в особенности, аралкоксикарбонильную группы. Примерами ацильных групп этого типа являются формиловые или алканоиловые группы, например ацетил, пропионил, бутритил; аралканоил, в частности фенилацетил; ароил, например бензоил или толуил; аралоксиалканоил, в частности феноксиацетил; алкоксикарбонил, например метоксикарбонил, этоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, Вос(Бок), 2-идоэтоксикарбонил; алкенилоксикарбонил, такой как арилоксикарбонил (Аlос(Алок)); аралкилоксикарбонил, например CBZ (синоним Z), 4-метоксибензилоксикарбонил (MOZ), 4-нитробензилоксикарбонил или 9-фторэнилметоксикарбонил (Fmос(Фмок)); 2-(фенилсульфонил)этоксикарбонил; триметилсилилэтоксикарбонил (Теос(Тэок)) или арилсульфонил, такой как 4-метокси-2,3,6-триметилфенилсульфонил (Mtr(Mтр)). Тритил (Тrt(Трт)) также известен в качестве защитной группы аминогруппы. Предпочтительными защитными группами аминогруппы являются Вос(Бок), Fmoc(Фмок) и Аlос(Алок), кроме того, Z, бензил и ацетил. Вос(Бок) является особенно предпочтительным.

R², как указано выше, является защитной группой карбоксильной группы. Выражение “защитная группа карбоксильной группы” тоже широко известно и относится к группам, которые пригодны для защиты от химических реакций гидроксильной группы карбоновой кислоты. Типичными группами этого типа являются вышеупомянутые незамещенная или замещенная арильная, аралкильная, ароильная или ацильная группы, а также алкильные группы, алкильная, арильная или аралкилсилильная группы. Природа и размер защитных групп карбоксильной группы и синонимичных им защитных групп гидроксильной группы несущественны, так как их удаляют после проведения целевой химической реакции или последовательности реакций; тем не менее, предпочтительными являются группы, содержащие 1-20, в особенности 1-10 атомов С. Примерами защитных групп гидроксильной группы являются, в частности, аралкильные группы, такие как бензил, 4-метоксибензил или 2,4-диметоксибензил, ароильные группы, такие как бензоил или р-нитробензоил, ацильные группы, такие как ацетил или пивалоил, р-толуолсульфонил, алкильные группы, такие как метил или трет-бутил, а также аллильные и алкилсульфонильные группы, такие как триметилсилил (TMS(TMC)), триизопропилсилил (ТIРS(ТИПС)), трет-бутилдиметилсилил (ТВS(ТБС)) или триэтилсилил, триметилсилилэтильные или аралкилсилильные группы, такие как трет-бутилдифенилсилил (ТВDPS(ТБДФС)). Предпочтительными защитными группами гидроксильных групп являются метил, бензил, ацетил, трет-бутил или ТВS(ТБС). Особенно предпочтительны метил и трет-бутил.

В общем, предпочтительными защитными группами для карбоксильной группы боковой цепи аспарагиновой кислоты являются линейные или разветвленные алкильные группы, такие как метил, этил или трет-бутил или арилалкильные группы, такие как бензил; в способе по изобретению бензил.

В общем, предпочтительными защитными группами для гуанидиновой группы боковой цепи аргинина являются Z, Вос(Бок), Mtr(MTp) или Рmс(Пмх); в способе по изобретению Рmс(Пмх).

Способы выделения защитных групп, используемых в каждом случае, описаны в (напр., T.W.Greene, P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 2-е изд., Wiley, Нью-Йорк 1991 или P.J. Kocienski, Protecting Groups, 1-е изд., Georg Thieme Verlag, Штуттгарт-Нью-Йорк, 1994). Можно применять также и другие известные в отрасли методики.

Изобретение относится к процессу, который, как описано выше, отличается тем, что трипептид R¹-Asp(Obzl)-Dphe-NMeVal-OH, где R¹ является защитной группой аминогруппы, получают путем линейного синтеза в реакции Z-DPhe-OH с H-NMeVal-OMe для получения H-DPhe-NMeVal-OMe, затем проводят реакцию полученного промежуточного продукта с активированным производным R¹-Asp(Obzl)-OH и отщепляют метиловый эфир.

Предпочтительным производным R¹-Asp(Obzl)-OH является сукцинимид R¹-Asp(Obzl)-OSu. Другие активные эфиры, которые можно применять с этой целью, описаны в классической литературе по пептидному синтезу.

Кроме того, изобретение относится к процессу, который, как указано выше, отличается тем, что дипептид H-Arg(Pbf)-Gly-R², где R² является защитной группой карбоксильной группы, получают путем линейного синтеза с участием реагента Z-Arg(Pbf)-OH, после чего удаляют защитную группу Z.

Таким образом, изобретение относится к линейным пентапептидам, выбираемым из группы, состоящей из:

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH,

которые являются промежуточными продуктами синтеза цикло(Аrg-Gly-Аsр-DPhe-NMeVal).

Изобретение относится к способу получения циклического пентапептида

цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) путем

a) проведения реакции дипептида H-Arg(Pbf)-Gly-R², получаемого путем линейного синтеза в реакции 2-Arg(Pbf)-OH с H-Gly-R² и последующего удаления защитной группы Z, с

b) трипептидом R¹-Asp(Obzl)-DPhe-NMeVal-OH, который получают путем линейного синтеза в реакции Z-DPhe-OH с H-NMeVal-OMe и последующим удалением защитной группы Z с целью получения Н-DPhe-NMeVal-OMe и затем - связывания этого пептида с активным эфиром R¹-Asp(OBzl)-OH с последующим удалением метилового эфира, конвергентно, для получения линейного пентапептида R¹-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-R²,

c) удаления защитных групп R¹ R²,

d) циклизации выделенного пентапептида H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH с целью получения цикло(Аrg(Рbf)-Gly-Аsp(ОВrl)-DPhe-NMeVal),

e) удаления защитной группы бензильной группы,

f) удаления защитной группы Рbf(Пбф) при помощи ТFА(ТФУ) и возможного преобразования трифторацетата цикло(Аrg-Gly-Аsр-DPhe-NMeVal), полученного на стадиях a)-f), в другие физиологически приемлемые соли.

Другими физиологически приемлемыми солями являются, например, соли неорганических кислот, таких как серная кислота, сернистая кислота, дитионовая кислота, азотная кислота, гидрогалогеновые кислоты, а также как соляная кислота или бромисто-водородная кислота, фосфорные кислоты, такие как, например, ортофосфорная кислота, сульфаминовая кислота, а также органические кислоты, в частности алифатические, алициклические, аралифатические, ароматические или гетероциклические моно- или полиосновные карбоновые, сульфоновые или серные кислоты, например муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гексановая кислота, октановая кислота, декановая кислота, гексадекановая кислота, октадекановая кислота, пивалиновая кислота, диэтилуксусная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, пимелиновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, винная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, метан- или этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, триметоксибензойная кислота, адамантанкарбоновая кислота, р-толуолсульфоновая кислота, гликолевая кислота, эмбоновая кислота, хлорофеноксиуксусная кислота, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, пролин, глиоксиловая кислота, пальмитиновая кислота, парахлорофеноксиизомасляная кислота, циклогексанкарбоновая кислота, глюкоза-1-фосфат, нафталинмоно- и нафталиндисульфоновая кислота или лаурилсульфоновая кислота.

Особенно предпочтительными физиологически приемлемыми солями являются гидрохлорид или собственные соли цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

Если R¹ является Вос(Бок), a R² является трет-бутилом, эти концевые трет-бутилоподобные защитные группы можно отщепить при помощи муравьиной кислоты, при этом защитные группы боковых цепей – Рbf(Пбф) и Вzl(Бзл) - воздействию не подвергаются.

Следующие примеры описывают конкретные осуществления отдельных стадий синтеза.

В описании данного изобретения, температура везде указана в °С.

Пример 1:

Синтез Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH

1. 25,3 мл триметилхлорсилана капельно вводят в раствор 26,5 г Z-NMeVal-OH в 200 мл метанола, и смесь перемешивают на протяжении ночи. Затем удаляют растворитель, а осадок растворяют в метилтрет-бутиловом эфире (МТВЕ(МТБЭ)) и промывают 5% Nа₂СО₃ и водой. После удаления растворителя осадок растворяют в метаноле и 1 н. HCl, смешивают с увлажненным водой Pd/C (10%) и гидрогенизируют в слабом токе Н₂. После завершения реакции катализатор отфильтровывают, из фильтрата удаляют растворитель и осадок перекристаллизовывают из этилацетата. Выход гидрохлорида H-NmeVal-OMe составляет 75%.

2. Раствор 16,1 г Z-DPne-OH, 10 г гидрохлорида H-NMeVal-OMe и 10,1 мл диизопропилэтиламина в 100 мл дихлорметана охлаждают до 0-5°С и добавляют 11,35 г ЕDСI(ЭДКИ). Смесь сначала перемешивают в течение часа при 0-5°С, затем на протяжении ночи продолжают перемешивание при комнатной температуре. Растворитель удаляют, а осадок растворяют в МТВЕ(МТБЭ) и промывают Nа₂СО₃ (5%), 1 н. HCl и водой, затем сушат. После удаления растворителя выход Z-DPhe-NMeVal-OMe составляет 84,5%.

3. 12 г Z-CPhe-NMeVal-OMe растворяют в 80 мл THF и 20 мл воды, смешивают с 10 мг тимолфталеина и по каплям добавляют 10 М NaOH до получения голубого окрашивания индикатора. При обесцвечивании индикатора, к смеси повторно добавляют по каплям 10 М NaOH. Когда обесцвечивание индикатора прекращается, значение рН доводят до 2 10%-ным раствором KHSO₄, метанол удаляют, а продукт экстрагируют МТВЕ(МТБЭ). После сушки в присутствии Na₂SO₄, соль СНА(ЦГА) осаждают из фильтрата путем добавления 2,9 мл СНА(ЦГА). Выход Z-DPhe-NMeVal-ОН х СНА составляет 90%.

4. 16,4 г Z-DPhe-NMeVal-OH х СНА (соли циклогексиламмония) добавляют при перемешивании к 250 мл МТВЕ(МТБЭ) и 100 мл Н₃РO₄ (10%); перемешивание производят до полного растворения. После удаления водной фазы, органическую фазу промывают водой и насыщенным раствором NaCl, затем сушат. Растворитель удаляют, а осадок растворяют в 15,2 мл 2 н. NaOH и 150 мл THF(TГK), и, после добавления увлажненного катализатора (1 г Pd/C (10%)), гидрогенизируют в слабом токе Н₂. Катализатор отфильтровывают и к прозрачному раствору добавляют 12,1 г Вос-Asp(OBzl)-OSu и 4,5 мл триэтиламина и перемешивают на протяжении ночи при комнатной температуре. После удаления растворителя осадок растворяют в МТВЕ(МТБЭ) и промывают Н₃РO₄ (10%), водой и насыщенным раствором NaCl. Органическую фазу обрабатывают 3,3 мл СНА(ЦХА). Полученную соль Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH х СНА отфильтровывают и сушат в вакууме. Выход составляет 93%.

Пример 2:

Синтез Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH х СНА

1. 33,0 г Z-Arg(Pbf)-OH х СНА добавляют при перемешивании к 300 мл уксусной кислоты и 300 мл Н₃РO₄, и далее перемешивают до полного растворения. После удаления водной фазы органическую фазу промывают водой и насыщенным раствором NaCl, затем сушат. После удаления растворителя осадок растворяют в 250 мл дихлорметана с 8,38 г H-Gly-OtBu x HCl и охлаждают до 0°C. Затем добавляют 17,12 мл диизопропилэтиламина и 16,05 г ТВТU(ТБТУ), и смесь перемешивают в течение 60 мин при и 0°С, затем перемешивают на протяжении ночи при комнатной температуре. Растворитель удаляют, и заменяют его на 250 мл этилацетата. После промывания 5% раствором Na₂CO₃, водой и насыщенным раствором NaCl, растворитель удаляют. Выход Z-Arg(Pbf)-Gly-OtBu составляет 86%.

2. Раствор 30 г Z-Arg(Pbf)-Gly-OtBu в 350 мл THF(TFK) смешивают с 3 г увлажненного водой Pd/C (10%), и группу Z удаляют гидрогенизированием в слабом токе Н₂. Катализатор затем отфильтровывают и растворитель удаляют. Осадок растворяют в этилацетате и дальше обрабатывают по способу, указанному в Примере 2.1. Выход H-Arg(Pbf)-Gly-OtBu составляет 86%.

Пример 3:

Синтез H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH

1. 1,23 г Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH x СНА преобразовывают в свободную кислоту обычным способом, после чего эту кислоту растворяют в 12,5 мл дихлорметана с 0,81 г Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH x СНА и 0,22 г DМАР(ДМАП). Раствор охлаждают до 0-5°C и вводят в него 0,345 г ЕDCI (ЭДКИ). Раствор перемешивают при 0-5°С в течение 2 часов, затем на протяжении ночи при комнатной температуре. Растворитель удаляют, осадок растворяют в МТВЕ(МТБЭ) и дальше обрабатывают как в Примере 2.1. Выход Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OtBu составляет 82%.

2. 2,3 г Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OtBu растворяют в 23 мл 95% муравьиной кислоты для удаления концевых защитных групп и по прошествии 30 мин концентрируют в вакууме. Полученный продукт растирают с эфиром, отфильтровывают и сушат в вакууме.

Выход H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH x HCOOH составляет 95%.

Пример 4:

Синтез цикло(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal)

Раствор 11,9 г H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH x HCOOH в 60 мл NMP(NMП) добавляют по каплям при перемешивании к раствору 7,25 г ТВТU(ТБТУ) и 7,45 мл N-метилморфолина в 180 мл N-метилпирролидона. Реакционный раствор перемешивают в течение 20 часов, а затем добавляют по каплям к раствору 47,5 г NаНСО₃ в 1800 мл воды. Осадок отфильтровывают и сушат в вакууме. Выход цикло(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NmeVal) составляет 73,4%.

Пример 5:

Синтез цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)

1. Раствор 2 г цикло (Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal) в 26 мл ТНF(ТГК) смешивают с 0,5 г Pd/C (10%). В течение 2 часов через него пропускают водород, после чего смесь отделяют от катализатора и удаляют растворитель в вакууме. Продукт кристаллизуют путем добавления 32 мл ацетона, полученный осадок отфильтровывают и сушат. Выход цикло(Arg(Pbf)-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) составляет 83%.

2. 1,5 г цикло(Arg(Pbf)-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) растворяют в 15 мл 95% ТFА(ТФУ). Через 1 час раствор по каплям добавляют к 150 мл изопропилового эфира, затем твердую фазу отфильтровывают и сушат. Высушенный продукт растворяют в 30 мл смеси изопропанола/воды 1:2, затем обрабатывают ионообменником III (ацетатной формой; Merck KGaA). Отфильтрованный раствор концентрируют и подвергают сублимационной сушке. Выход цикло (Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) в виде его соли составляет 96%.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Пептиды вy/РO4*
1-99%
30 минву/Fac**
1-99%
30 минЖХ-МС а
Med ChemЖХ-МС b
ZDAH-Asp(OBzl)-DPhe-N(Me)Val-Arg(Pbf)-Gly-OHСоед.3 в А1/А617,05 мин13,49 мин949
950949,3
М+Н
971,4
M+NaN(Me)Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OHСоед.5 в А1/А617,20 мин12,53 мин949
950
951949,5
М+НH-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-N(Me)Val-Arg(Pbf)-OHСоед.2 в А1/А617,95 мин13,70 мин949
950
951949,2
М+Н
971,3
М+NаH-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-N (Me) Val-OHСоед.1 в А1/А616,43 мин13,11 мин949
950
951949,4
М+НH-DPhe-N(Me)Val-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-OHСоед.1 в А1/А617,20 мин12,50 мин949
950
951949,3
М+Н
1697,7
2М+Нцикло (RGDfN(Me)V)=CilengitideЦелевое соед.9,95 мин 589
590
591 

RT - время удерживания (вy)

Условия ЖХВР:

градиент: 1-99%В, 30 мин

скорость: 1 мл/мин

УФ: 215 нм колонка: Chromolith Performance ОФ 18е,

4,6×100 мм, Charge: OB 194049

Условия ЖХВР ZDA:

градиент: 1-99%В, 25 мин

скорость: 1,00 мл/мин

УФ: 254 нм колонка: Chromolith Performance ОФ 16е

*Фосфатный буфер, рН 2 (=РO4)

А: вода, 0,014 М NaH₂PO₄+4 мл Н₃РO₄ (85%/вода, 1:1)

на 2 л буферного раствора, рН 2

В: вода/2-PrOH, 25:75, 0,014 М NaH₂PO₄+4 мл Н₃РO₄ (85%/вода, 1:1)

на 2 л буферного раствора, рН 2

**Буфер на основе муравьиной кислоты (=Fac):

А: вода +0,1% HCOOH

В: ацетонитрил + 0,1% НСООН

ЖХ-МС a: HP MS D 1100

ЖХ-МС b: Finnigan MAT LCQ Deca

ESI (ионизация электрораспылением)

положительная ионизация

Изобретение относится к способу получения циклического пентапептида цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) путем циклизации линейного пентапептида, выбираемого из группы, состоящей из

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH,

последующего удаления защитной группы и, при необходимости, дальнейшего преобразования продукта в физиологически приемлемые соли, а также к линейным пентапептидам, выбираемым из группы, состоящей из

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH,

в качестве промежуточных продуктов синтеза цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal). 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения циклического пентапептида цикло(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) путем циклизации линейного пентапептида, выбираемого из группы, состоящей из

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH,

последующего удаления защитной группы и при необходимости дальнейшего преобразования продукта в физиологически приемлемые соли.

H-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH или

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH,

в качестве промежуточных продуктов синтеза цикло(Аrg-Glу-Аsр-DPhе-NMeVal).