Настоящее изобретение относится к химическим соединениям для применения при диагностике рака поджелудочной железы. В частности, настоящее изобретение относится к хромогенным пептидам, подходящим для обнаружения протеолитических ферментов в образце.
Уровень техники
Рак поджелудочной железы часто характеризуется очень плохим прогнозом, поскольку его часто диагностируют на поздней стадии. Вследствие динамики этого рака выживаемость в течение пяти лет встречается редко. В мире диагностируют приблизительно 250000 случаев рака поджелудочной железы в год, причем 3500 из них - на территории Польши. К сожалению, подавляющее большинство (более 80%) этих случаев заканчиваются летальным исходом. Существует настоятельная потребность в разработке надежных, быстрых и несложных способов диагностики для обнаружения рака поджелудочной железы. Более ранний диагноз увеличивает шансы хирургического лечения, которое может значительно увеличить выживаемость пациента.
Процесс инициации, роста и распространения раковых клеток включает много факторов, в том числе участие ряда протеолитических ферментов. Эта группа белков может выполнять гидролиз белков и пептидов с образованием более мелких фрагментов. Протеолитические ферменты опосредуют разрушение внеклеточного матрикса, что позволяет раковым клеткам колонизировать новые ткани и обеспечивает образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез), которое способствует эффективной доставке питательных веществ к опухоли. Кроме того, протеолитические ферменты образуются в результате гибели здоровых клеток из-за роста опухоли. Все эти процессы формируют профиль протеолитических ферментов, характерный для опухоли.
Молекулы хромогенных пептидов, разрушающиеся под действием протеолитических ферментов, приводя к изменению или усилению цвета анализируемого раствора, описаны ранее. Хромогенный эффект является следствием высвобождения хромофора (например, 4-нитранилида или 5-амино-2-нитробензойной кислоты).
Этот вид производных пептидов известен из следующих публикаций:
1. Erlanger BF, Kokowsky N, Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 1961 Nov; 95:271-8.
2. Hojo K, Maeda M, Iguchi S, Smith T, Okamoto H, Kawasaki K. Amino acids and peptides. XXXV. Facile preparation of p-nitroanilide analogs by the solid-phase method. Chem Pharm Bull (Tokyo). 2000 Nov; 48(11):1740-4.
Способы обнаружения и измерения экспрессии протеаз описаны ранее. Описанные способы основаны на выделенных антителах, специфично связывающихся с конкретными полипептидами, и ПЦР полинуклеотидов, кодирующих конкретные полипептиды. Демонстрацию протеазной активности измеряют по гидролизу соответствующих синтетических пептидных субстратов, конъюгированных с хромогенными молекулами, причем указанные протеазы расщепляют указанный синтетический субстрат, и измеряют поглощение хромогена, высвобожденного во время гидролиза субстрата. (CA 2425829).
Предпочтительные соединения согласно настоящему изобретению разрабатывают таким образом, что при контакте соединения с образцом мочи лица, страдающего раком поджелудочной железы, можно обнаружить сигнал, т.е. усиление цвета в диапазоне 380-440 нм. Этот эффект не возникает при контакте соединения с образцом мочи здорового лица или пациента, у которого диагностирован другой вид рака.
В настоящем изобретении показано, что такой сигнал, например, образованный за счет высвобожденного хромогенного соединения, или флуоресцентный сигнал после отделения флуоресцентной донорно-акцепторной пары, можно использовать для обнаружения присутствия протеолитических ферментов в моче субъекта с раком поджелудочной железы. Ферментативный гидролиз соединений приводит к получению обнаружимого различия, например, высвобождению свободных молекул хромофора (ANB-NH2 - амида 5-амино-2-нитробензойной кислоты или pNA - пара-нитроанилина, соответственно), которые характеризуются поглощением при 320-480 нм.
Соединения по настоящему изобретению обеспечивают, в числе прочего: (i) быстрый и неинвазивный диагностический способ для обнаружения рака поджелудочной железы, (ii) способ, подходящий для раннего обнаружения рака поджелудочной железы, (iii) способ, который можно успешно применять для скрининга рака поджелудочной железы, (iv) полный процесс диагностики на ранней стадии развития рака для увеличения эффективности лечения.
Сущность изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, характеризующемуся формулой 1:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (формула 1),
причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала. Соединение содержит тетрапептид Thr-Thr-Ala-Arg в соответствии с SEQ ID NO: 1.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения протеазной активности в биологической жидкости субъекта in vitro, включающему приведение биологической жидкости в контакт с соединением согласно первому аспекту настоящего изобретения и обнаружение сигнала, причем биологическая жидкость может содержать гидролитический фермент, в частности, протеазу, происходящий из клеток рака поджелудочной железы.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему соединение согласно первому аспекту настоящего изобретения и буфер для измерения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения согласно первому аспекту настоящего изобретения, способа согласно второму аспекту настоящего изобретения или набора согласно третьему аспекту настоящего изобретения для обнаружения рака поджелудочной железы, или для мониторинга субъекта с подозрением на рак поджелудочной железы, с повышенным риском развития рака поджелудочной железы или с раком поджелудочной железы.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения согласно первому аспекту настоящего изобретения в способе лечения рака поджелудочной железы, причем указанный способ включает этапы (a) выполнения способа согласно второму аспекту настоящего изобретения и (b) лечения рака поджелудочной железы у субъекта, у которого на этапе (a) обнаружена протеазная активность, в частности, повышенная протеазная активность.
Подробное описание изобретения
Перед подробным описанием настоящего изобретения следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут изменяться. Кроме того, следует понимать, что указанная терминология используется в настоящем документе лишь для целей описания конкретных вариантов воплощения и не должна рассматриваться в качестве ограничивающей рамки настоящего изобретения, которые должны ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют значения, совпадающие с общепринятыми среди специалистов в данной области техники. Предпочтительно термины, используемые в настоящем документе, соответствуют определениям, описанным в “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kölbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).
Несколько документов упоминаются в тексте данного описания. Каждый из документов, упомянутых в настоящей заявке (включая все патенты, патентные заявки, патентные публикации, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.) выше или ниже по тексту, полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Никакие упоминания в настоящем документе не следует интерпретировать в качестве признания того, что данное изобретение не может не может предшествовать такому раскрытию в силу более раннего изобретения.
Для реализации настоящего изобретения, если не указано иное, применяют общепринятые способы, используемые в области химии, биохимии и технологии рекомбинантных ДНК, которые разъясняются в литературе в данной области техники (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
Следует понимать, что в данном описании и последующей формуле изобретения слово «содержать» и его производные, например, «содержит» и «содержащий» подразумевают включение указанного элемента или этапа или группы элементов или этапов, а не исключение любого другого элемента или этапа или группы элементов или этапов, если контекст не требует иного. В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если смысл описания не указывает на иное явным образом.
Ниже описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены с конкретными вариантами реализации, однако следует понимать, что их можно объединять любым образом и в любом количестве, создавая дополнительные варианты реализации. Не следует считать, что различные описанные примеры и предпочтительные варианты реализации ограничивают настоящее изобретение только явно описанными вариантами реализации. Следует понимать, что данное описание приведено для подтверждения и охвата вариантов реализации, объединяющих явно описанные варианты реализации с любым количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, следует считать, что любые перестановки и комбинации всех элементов, описанных в настоящей заявке, включены в описание в настоящей заявке, если иное не следует из контекста.
Термины и сокращения, используемые в описании патента и формуле изобретения, следует понимать следующим образом:
В контексте настоящего изобретения «обнаружимый сигнал» относится к любому сигналу, например, генерируемому любой меткой, включая магнитную метку, флуоресцентную группу, фермент, хемилюминесцентный зонд, металлическую частицу, неметаллическую коллоидную частицу, частицу полимерного красителя, молекулу пигмента, частицу пигмента, электрохимически активное соединение, полупроводниковый нанокристалл или другую наночастицу, в том числе квантовые точки или частицы золота. Метка может представлять собой, например, хромофоры, флуорофоры, квантовые точки или радиоактивные метки.
В контексте настоящего изобретения выражение “хромофор” применяют для обозначения соединения, обладающего “хромогенными свойствами”. Выражение “хромогенные свойства” относится к способности соединения образовывать окрашенный продукт.
В контексте настоящего изобретения выражение “флуорофор” применяют для обозначения соединения, обладающего “флуорогенными свойствами”. Выражение “флуорогенные свойства” относится к способности соединения образовывать продукт, излучающий флуоресценцию.
Флуоресцентные красители согласно настоящему изобретению включают красители следующих классов: ксантены (например, флуоресцеин), акридины (например, акридиновый желтый), оксазины (например, оксазин 1), цианины (например, Cy7/Cy3), стириловые красители (например, Dye-28), кумарины (например, Alexa Fluor 350), порфины (например, хлорофилл B), металлолигандные комплексы (например, PtOEPK), флуоресцентные белки (например, APC, R-фикоэритрин), нанокристаллы (например, QuantumDot 705), перилены (например, Lumogen Red F300) и фталоцианины (например, IRDYE™700DX), а также конъюгаты и комбинации красителей этих классов.
Квантовая точка представляет собой полупроводник, состоящий из атомов элементов II-VI или III-V групп периодической системы элементов (например, CdSe, CdTe, InP). Другие альтернативы включают любую систему из двух красителей.
В контексте настоящего изобретения NMP относится к N-метилпирролидону.
В контексте настоящего изобретения ДМФ относится к диметилформамиду.
В контексте настоящего изобретения ДХМ относится к дихлорметану.
В контексте настоящего изобретения pNA относится к 4-нитроанилину, который также можно называть пара-нитроанилином.
В контексте настоящего изобретения ABZ относится к 2-аминобензойной кислоте.
В контексте настоящего изобретения ANB-NH2 относится к амиду 5-амино-2-нитробензойной кислоте.
В контексте настоящего изобретения AFC относится к 7-амидо-4-трифторметилкумарину.
В контексте настоящего изобретения Boc относится к трет-бутилоксикарбонильной группе.
В контексте настоящего изобретения Fmoc относится к 9-флуоренилметоксикарбонильной группе.
В контексте настоящего изобретения ТФУК относится к трифторуксусной кислоте.
В контексте настоящего изобретения термин «рак поджелудочной железы» используется в максимально широком смысле и относится ко всем видам рака, которые начинаются в поджелудочной железе. Он включает подвиды экзокринных злокачественных опухолей, эндокринных злокачественных опухолей, панкреобластомы, сарком поджелудочной железы и лимфомы. Экзокринные злокачественные опухоли включают аденокарциномы, в частности, аденокарциномы протоков, а также кистозные опухоли и ацинарно-клеточные злокачественные опухоли Эндокринные злокачественные опухоли включают гастриномы, инсулиномы, соматостатиномы, ВИПомы и глюкагономы. Сюда также входят следующие стадии (определения которых согласно соответствующим классификациям TNM указаны в скобках): стадия 0 (Tis, N0, M0), стадия IA (T1, N0, M0), стадия IB (T2, N0, M0), стадия IIA (T3, N0, M0), стадия IIB (T1-3, N1, M0), стадия III (T4, любой N, M0) и стадия IV (любая T, любой N, M1).
Пептиды согласно настоящему изобретению, предпочтительно хромогенные или флуорогенные пептиды, можно получать путем выполнения синтеза пептидов на твердой подложке, известного в данной области техники. Твердая подложка может быть представлена в форме смолы, содержащей Fmoc-группу, которая удаляется в ходе реакции. Смолу, используемую для выполнения этого процесса, следует надлежащим образом подготовить. Подготовка смолы включает увеличение ее объема посредством повторной промывки гидрофобными растворителями.
Защитную группу Fmoc следует удалить со смолы промывкой 20% раствором растворителя.
Известные процессы получения хромогенных пептидов включают присоединение отдельных компонентов в соответствующее время и в стехиометрических условиях. Этот процесс присоединения состоит из последовательных стадий, во время которых присоединяют отдельные элементы (производные аминокислот), остатки удаляют промывкой, удаляют защитные группы и повторно выполняют промывку. Этот цикл повторно выполняют для каждого аминокислотного остатка. Полученный пептид отделяют от смолы посредством реакции в кислых условиях. После этого раствор отделяют от смолы фильтрацией, а затем осаждают пептид из полученного раствора с помощью неполярного растворителя. Затем осадок пептида центрифугируют.
Известные способы получения хромогенных пептидов основаны на процессе, выполняемом на твердой подложке и частично в буфере. В качестве твердой подложки используют амидную смолу, а в качестве раствора - смесь гидрофобных растворителей.
Соединения согласно настоящему изобретению получали с помощью способа, описанного в источнике Hojo et al., Chem Pharm Bull (Tokyo), 2000. Подробное описание этого синтеза находится ниже в разделе «Примеры».
Кроме того, пептид согласно настоящему изобретению можно связать с квантовой точкой. Квантовые точки характеризуются сильной люминесценцией, за исключением гашения в присутствии наночастицы металла. В качестве гасителей также можно использовать виологены (например, метилвиологен или пропилвиологенсульфонат (PVS)).
После расщепления консенсусной последовательности протеазой происходит высвобождение квантовых точек и излучение ими света.
В первом аспекте настоящего изобретения предложено соединение, характеризующееся формулой 1: X1-Thr-Thr-Ala-Arg -X2 (формула 1), причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала.
В предпочтительных вариантах реализации последовательность Thr-Thr-Ala-Arg доступна для гидролитического фермента, в частности, гидролитического фермента, расщепляющего указанное соединение на X1-Thr-Thr-Ala-Arg-OH (фрагмент 1) и NH2-X2 (фрагмент 2).
Гидролитический фермент может представлять собой протеазу или комбинацию нескольких протеаз.
Обнаружимый сигнал, возникающий при расщеплении указанного соединения, можно выбрать из различных подходящих сигналов, известных специалисту. В предпочтительных вариантах реализации обнаруживаемый сигнал представляет собой оптический сигнал.
В предпочтительных вариантах реализации X1 содержит или состоит из компонента C1, а X2 содержит или состоит из компонента C2, и обнаружимый сигнал возникает при пространственном разделении C1 и C2, т.е. при гидролитическом расщеплении пептида Thr-Thr-Ala-Arg.
Кроме C1, X1 может содержать, например, одну или более аминокислот с любой стороны от C1. Кроме C2, X2 может содержать, например, одну или более аминокислот с любой стороны от C2. Таким образом, до расщепления C1 и C2 могут быть разделены аминокислотной последовательностью из 4-20 аминокислот или 5-10 аминокислот, содержащих или состоящих из Thr-Thr-Ala-Arg. В предпочтительных вариантах реализации C1 и C2 разделены не более чем 10 аминокислотами.
В предпочтительных вариантах реализации обнаружимый сигнал представляет собой изменение поглощения или флуоресценции. Указанное изменение может представлять собой увеличение или уменьшение. В предпочтительных вариантах реализации обнаружимый сигнал представляет собой увеличение интенсивности поглощения при 300-500 нм, в частности, 380 - 430 нм.
В предпочтительных вариантах реализации один из C1 и C2 представляет собой хромофор, характеризующийся максимумом поглощения 1 (AM1) при длине волны 1, а соединение характеризуется максимумом поглощения 2 (AM2) при длине волны 2, отличающейся от длины волны 1. Таким образом, при измерении поглощения при длине волны 2 до и после расщепления соединения будет обнаружено увеличение поглощения.
Особенно предпочтительным является высвобождение хромофора в свободной форме при расщеплении. При расщеплении фрагмент 1 состоит из X1-Thr-Thr-Ala-Arg, в то время как фрагмент 2 состоит только из NH2-X2. Таким образом, в предпочтительных вариантах реализации хромофор представляет собой C2, а не C1. Если C2 представляет собой хромофор, X2 предпочтительно состоит или по существу состоит из C2. С другой стороны, X1 может содержать дополнительные аминокислоты с любой стороны от C1, так что до расщепления C1 и C2 могут быть разделены более длинной аминокислотной последовательностью, чем Thr-Thr-Ala-Arg.
В предпочтительных вариантах реализации хромофор выбран из пара-нитроанилина (pNA), амида 5-амино-2-нитробензойной кислоты (ANB-NH2), 7-амидо-4-трифторметилкумарина (AFC) и 3-нитро-L-тирозина (Tyr3-NO2). В предпочтительных вариантах реализации хромофор представляет собой пара-нитроанилин (pNA). В предпочтительных вариантах реализации хромофор представляет собой амид 5-амино-2-нитробензойной кислоты (ANB-NH2).
В предпочтительных вариантах реализации C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции. Если C1 и C2 представляют собой пару из донора и акцептора флуоресценции, а соединение используют в способе, измеряющем изменение флуоресценции при расщеплении соединения, C1 и C2 предпочтительно разделены не более чем 10 аминокислотами в целях гарантии эффективного гашения донора флуоресценции акцептором флуоресценции. Специалисту известно, что расстояние между донором флуоресценции и акцептором флуоресценции является важнейшим параметром. Так, если аминокислотная последовательность, разделяющая С1 и С2, уложена в уплотненную или скрученную вторичную структуру, что приводит к большему сближению С1 и С2, чем в слкчае использования линейного линкера, допускается использовать еще более длинный спейсер между С1 и С2.
В предпочтительных вариантах реализации пара из C1 и C2 выбрана из группы, состоящей из 2-аминобензойной кислоты (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), в частности, пара из C1 и C2 выбрана из ABZ/pNA и ABZ/ANB-NH2. C1 и C2 предпочтительно характеризуются молекулярной массой менее 500 г/моль, в частности, менее 400 г/моль, конкретнее, менее 300 г/моль, еще конкретнее - от 100 до 200 г/моль.
Пара из C1 и C2 также может представлять собой пару из белкового донора и акцептора флуоресценции, выбранную из группы, состоящей из BFP/GFP, BFP/CFP, BFP/YFP, BFP/DsRed, CFP/GFP, CFP/YFP, CFP/mVenus, CeFP/ YFP, CeFP/mVenus, CeFP/mCitrine, CFP/dsRed, CFP/mCherry, mTurquoise/mVenus, GFP/YFP, GFP/DsRed, GFP/RFP, Clover/mRuby, Cy3/C5, Alexa 488/Alexa 555 и FITC/TRITC. Специалисту известны способы выбора подходящих пар из белкового донора и акцептора флуоресценции на основе их спектров излучения и поглощения.
Если C1 и C2 представляют собой пару из белкового донора и акцептора флуоресценции, необходимо гарантировать, что относительно большой размер белков не препятствует расщеплению соединения и что последовательность Thr-Thr-Ala-Arg доступна для расщепления гидролитическим ферментом. Этого можно достичь, например, путем увеличения длины аминокислотной последовательности, содержащей пептид в соответствии с SEQ ID NO: 1.
В предпочтительных вариантах реализации соединение характеризуется формулой 2:
ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 (формула 2).
В предпочтительных вариантах реализации соединение характеризуется формулой 3:
ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA (формула 3).
После расщепления соединений, характеризующихся формулой 2 или 3, высвобождаются свободные молекулы хромофора (ANB-NH2 или pNA, соответственно). Таким образом, при длине волны 380-430 нм можно обнаружить увеличение интенсивности поглощения. Кроме того, расщепление приводит к пространственному разделению донора флуоресценции (ABZ) и акцептора флуоресценции (ANB-NH2 или pNA, соответственно). Таким образом, флуоресценция, излучаемая ABZ, больше не гасится, и при длине волны можно обнаружить увеличение интенсивности флуоресценции.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен способ обнаружения протеазной активности в биологической жидкости субъекта in vitro, включающий приведение биологической жидкости в контакт с соединением согласно первому аспекту настоящего изобретения и обнаружение сигнала, причем биологическая жидкость может содержать гидролитический фермент, в частности, протеазу, происходящий из клеток рака поджелудочной железы.
В предпочтительных вариантах реализации присутствие протеазной активности в биологической жидкости указывает на наличие рака поджелудочной железы, а отсутствие протеазной активности в биологической жидкости указывает на отсутствие рака поджелудочной железы.
В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики рака поджелудочной железы.
В предпочтительных вариантах реализации биологическая жидкость выбрана из крови или мочи. В предпочтительных вариантах реализации биологическая жидкость представляет собой мочу. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что соединение согласно первому аспекту настоящего изобретения способно обнаруживать активность гидролитического фермента в образце мочи. Активность гидролитического фермента значимо увеличивалась у субъектов с диагнозом рака поджелудочной железы по сравнению со здоровыми субъектами (фиг. 1, 2).
В предпочтительных вариантах реализации субъект характеризуется повышенным риском развития рака поджелудочной железы, подозрением на рак поджелудочной железы, наличием рака поджелудочной железы в прошлом или настоящем времени.
В предпочтительных вариантах реализации предложено соединение в концентрации 0,1-10 мг/мл, в частности, 0,25-7,5 мг/мл, конкретнее, 0,5-5 мг/мл, конкретнее, 0,75-2 мг/мл, еще конкретнее - приблизительно 1 мг/мл в буфере для измерений с нейтральным или щелочным pH, предпочтительно pH от 6,8 до 8,5, более предпочтительно - физиологическим pH, а образец биологической жидкости добавляют к соединению в соотношении от 1:2 до 1:10, в частности, от 1:3 до 1:8, конкретнее, от 1:4 до 1:6, еще конкретнее - приблизительно 1:5.
В контексте настоящего описания выражение “нейтральный рН” относится к pH приблизительно 7,0. В контексте настоящего описания выражение “физиологический рН” относится к pH приблизительно 7,4.
В предпочтительных вариантах реализации обнаружение сигнала включает измерение поглощения или флуоресценции.
В предпочтительных вариантах реализации обнаружение сигнала включает измерение интенсивности поглощения при 300-500 нм, в частности, 380-430 нм, предпочтительно в течение 40-60 мин при 25-40°C, в частности, при 36-38°C.
В предпочтительных вариантах реализации увеличение поглощения указывает на присутствие активности гидролитического фермента.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложен набор, содержащий соединение согласно первому аспекту настоящего изобретения и буфер для измерения.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложено применению соединения согласно первому аспекту настоящего изобретения, способа согласно второму аспекту настоящего изобретения или набора согласно третьему аспекту настоящего изобретения для обнаружения рака поджелудочной железы, или для мониторинга субъекта с повышенным риском развития рака поджелудочной железы, подозрением на рак поджелудочной железы или раком поджелудочной железы в прошлом.
В зависимости от целей применения способа согласно второму аспекту термин «субъект» может характеризоваться различными ограничениями. Например, если способ собираются применять для обнаружения рака поджелудочной железы или скрининга субъектов на предмет рака поджелудочной железы, наличие рака поджелудочной железы у субъекта неизвестно, т.е. у него может быть или не быть рак поджелудочной железы. В данном примере субъект предпочтительно характеризуется повышенным риском развития рака поджелудочной железы, подозрением на рак поджелудочной железы или наличием рака поджелудочной железы в прошлом (т.е. излечился от поддающегося обнаружению рака поджелудочной железы). «Повышенный риск» означает, что у субъекта может иметь место один или более из факторов риска развития рака в целом или рака поджелудочной железы, предпочтительно в соответствии с определением Американского онкологического общества для рака в целом или рака поджелудочной железы. Примеры факторов риска развития рака поджелудочной железы представляют собой употребление табака (в частности, курение), интенсивное употребление алкоголя, ожирение, диабет 2 типа, профессиональные факторы (воздействие на рабочем месте некоторых химических веществ, используемых при химической чистке и в металлообрабатывающей промышленности), хронический панкреатит, возраст 50 лет или более (в частности, 65 лет или более), мужской пол, этническую принадлежность (в частности, мужчины-афроамериканцы и уроженцы Карибского бассейна африканского происхождения), рак поджелудочной железы в семейном анамнезе (в частности, у родственников первой степени родства), а также наличие врожденного синдрома предрасположенности (например, синдрома наследственного рака молочной железы и яичников, вызванного мутациями в генах BRCA1 или BRCA2; наследственного рака молочной железы, вызванного мутациями в гене PALB2; синдрома семейной атипичной меланомы с множественными невусами (FAMMM), вызванного мутациями в гене p16/CDKN2A и ассоциированного с меланомой кожи и глаз; семейного панкреатита, обычно вызванного мутациями в гене PRSS1; синдрома Линча, также известного как наследственного неполипозного рака ободочной и прямой кишки (HNPCC), чаще всего вызванного дефектом в генах MLH1 или MSH2; или синдрома Пейтца-Егерса, вызванного дефектами в гене STK11).
Рак поджелудочной железы может относиться к любому подтипу и стадии, в соответствии с определением выше, т.е. можно обнаружить наличие или отсутствие рака любого подтипа и/или стадии.
В предпочтительных вариантах реализации присутствие значительного количества протеазной активности или количества протеазной активности, превышающего таковое в контрольном образце, указывает на наличие рака поджелудочной железы, а отсутствие значительного количества протеазной активности или количество протеазной активности, равное или меньшее такового в контрольном образце указывает на отсутствие рака поджелудочной железы.
В конкретном варианте реализации способ согласно второму аспекту дополнительно включает подтверждение обнаружения рака поджелудочной железы посредством применения одного или более из дополнительных средств для обнаружения рака поджелудочной железы. Дополнительные средства могут представлять собой маркер рака (или «биомаркер») или традиционные (не связанные с маркерами) средства обнаружения. Маркер рака может, например, представлять собой маркер метилирования ДНК, маркер мутации (например, ОНП), антигенный маркер, белковый маркер, маркер-микроРНК, метаболит, специфичный для рака, или маркер экспрессии. Традиционные средства могут, например, представлять собой биопсию (например, визуальное обследование биоптата с использованием способов окрашивания, например, белковых маркеров или маркеров экспрессии, или без них), методику визуализации или врачебное, например, тактильное обследование. В предпочтительных вариантах реализации дополнительное средство обнаружения рака поджелудочной железы выбрано из группы, состоящей из физикального обследования (увеличения печени или желчного пузыря, желтухи, т.е. пожелтения кожи или склер), КТ-сканирования, МРТ, холангиопанкреатографии (в частности, эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографии, магнитно-резонансной холангиопанкреатография или чрескожной чреспеченочной холангиографии), ангиографии (в частности, рентгеновской ангиографии, КТ-ангиографии или МР-ангиографии), УЗИ органов брюшной полости, эндоскопического УЗИ, ПЭТ-сканирования, анализов крови (в частности, на предмет билирубина, CA 19-9 или CEA) и биопсии.
Термин «является индикатором» или «указывает» в настоящем документе относится к акту выявления или определения чего-либо, подлежащего индикации. Как должны понимать специалисты в данной области техники, такая оценка в обычном случае может не быть верной для 100% субъектов, хотя предпочтительно является верной. В то же время данный термин требует выполнения верной индикации у статистически значимой части субъектов. Статистическую значимость части может легко определить специалист в данной области техники, используя различные хорошо известные инструменты статистической оценки, например, определение доверительных интервалов, определение значения р, t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни и т.д. Подробная информация представлена в Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, меньшей мере 95 %. Значения p предпочтительно составляют 0.05, 0.01 или 0.005.
Фраза «способ обнаружения присутствия или отсутствия» в настоящем документе по отношению к раку поджелудочной железы означает определение присутствия или отсутствия рака у субъекта. Как должны понимать специалисты в данной области техники, такая оценка в обычном случае может не быть верной для 100% субъектов, хотя предпочтительно является верной. В то же время данный термин требует выполнения верной индикации у статистически значимой части субъектов. Описание статистической значимости и подходящих доверительных интервалов и значений p см. выше.
В настоящем документе термин «диагностика» относится к определению присутствия или отсутствия рака у субъекта. Диагностику посредством анализа протеазной активности, описанную в настоящем документе, можно дополнить средствами, описанными в настоящем документе, с целью подтверждения рака, обнаруженного с помощью анализа протеазной активности. Как должны понимать специалисты в данной области техники, диагностика в обычном случае может не быть верной для 100% субъектов, хотя предпочтительно является верной. В то же время данный термин требует выполнения верной диагностики у статистически значимой части субъектов. Описание статистической значимости и подходящих доверительных интервалов и значений p см. выше.
В настоящем документе фраза «скрининг популяции субъектов» по отношению к раку, указанному в описании, означает применение способа согласно первому аспекту с использованием образцов, полученных от популяции субъектов. Указанные субъекты предпочтительно характеризуются повышенным риском, подозрением на наличие или наличием рака в прошлом. В частности, у субъектов популяции может быть один или более из факторов риска, упомянутых в настоящем документе. В конкретном варианте реализации один и тот же один или более из факторов риска может иметь место у всех субъектов популяции. Например, популяция может состоять из субъектов, характеризующихся интенсивным употреблением алкоголя и/или табака. Следует понимать, что термин «скрининг» относится к диагностике, описанной выше, у субъектов популяции, и предпочтительно подтверждается с использованием дополнительных средств, описанных в настоящем документе. Как должны понимать специалисты в данной области техники, результат скрининга в обычном случае может не быть верным для 100% субъектов, хотя предпочтительно является верным. В то же время данный термин требует получения верного результата скрининга у статистически значимой части субъектов. Описание статистической значимости и подходящих доверительных интервалов и значений p см. выше.
В настоящем документе термин "мониторинг" относится к сопровождению диагностированного рака во время процедуры лечения или в течение определенного периода времени, обычно в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, 6 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 5 лет, 10 лет или любого другого периода времени. Термин “сопровождение” означает, что состояния и, в частности, изменения этих состояний рака можно обнаруживать на основе количества протеазной активности, в частности, на основе изменений указанного количества через периодические отрезки времени любого типа, например, ежедневно или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 раз в месяц (не чаще чем одно определение в день) в течение курса лечения, который может составлять до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 24 месяцев. Количество или изменения количества также можно определять при появлении явлений, специфичных для лечения, например, перед и/или после каждого цикла лечения или введения медикамента. Цикл представляет собой время между одним раундом лечения и до начала следующего раунда. Лечение рака обычно представляет собой не разовое лечение, а курс лечения. Курс обычно продолжается от 4 до 6 месяцев, однако его продолжительность может быть больше или меньше указанной. Во время курса лечения обычно имеют место от 4 до 8 циклов лечения. Обычно цикл лечения включает перерыв в лечении, позволяющий организму восстановиться. Как должны понимать специалисты в данной области техники, результат мониторинга в обычном случае может не быть верным для 100% субъектов, хотя предпочтительно является верным. В то же время данный термин требует получения верного результата мониторинга у статистически значимой части субъектов. Описание статистической значимости и подходящих доверительных интервалов и значений p см. выше.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения согласно первому аспекту настоящего изобретения в способе лечения рака поджелудочной железы, причем указанный способ включает этапы выполнения способа согласно второму аспекту настоящего изобретения и лечения рака поджелудочной железы у субъекта, у которого обнаружена протеазная активность, в частности, повышенная протеазная активность.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения рака поджелудочной железы, включающий выполнение способа согласно второму аспекту настоящего изобретения и лечение рака поджелудочной железы у субъекта, у которого обнаружена протеазная активность, в частности, повышенная протеазная активность.
В настоящем документе термин «лечение» и его производные по отношению к раку означает терапевтическое лечение, целью которого является ослабление прогрессирования рака. Благоприятные или желательные клинические результаты включают смягчение симптомов, уменьшение продолжительности заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) патологическое состояние, замедление прогрессирования заболевания, улучшение патологического состояния и ремиссию (частичную или полную), предпочтительно обнаружимые, но не ограничиваются ими. Успешное лечение не обязательно означает излечение, и может также означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в отсутствие лечения. В предпочтительном варианте реализации лечение представляет собой лечение первой линии, т.е. рак не лечили ранее. Лечение рака предусматривает применение схемы лечения.
В настоящем документе термин «схема лечения» относится к способу лечения субъекта с учетом заболевания, доступных процедур и медикаментозного лечения. Неограничивающие примеры схем лечения рака представляют собой химиотерапию, хирургическую операцию и/или облучение или их комбинации. Раннее лечение рака, обеспечиваемое настоящим изобретением, позволяет выполнять, в частности, хирургическое лечение, особенно радикальную резекцию. В частности, термин «схема лечения» относится к введению одного или более противораковых агентов или терапевтических средств, определяемых ниже. В настоящем документе термин «противораковый агент или терапевтическое средство» относится к химическим, физическим или биологическим агентам или терапевтическим средствам или хирургической операции, включая их комбинации, обладающим антипролиферативными, антионкогенными и/или канцеростатическими свойствами.
Химический противораковый агент или терапевтическое средство можно выбрать из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, растительных алкалоидов и терпеноидов, а также ингибиторов топоизомеразы. Алкилирующие агенты предпочтительно представляют собой соединения платины. В одном варианте реализации соединения платины выбраны из группы, состоящей из цисплатина, оксалиплатина, эптаплатина, лобаплатина, недаплатина, карбоплатина, ипроплатина, тетраплатина, лобаплатина, DCP, PLD-147, JM118, JM216, JM335 и сатраплатина.
Физический противораковый агент или терапевтическое средство можно выбрать из группы, состоящей из лучевой терапии (например, радикальной лучевой терапии, адъювантной лучевой терапии, паллиативной лучевой терапии, дистанционной кюри-терапии, брахитерапии или метаболической лучевой терапии), фототерапии (с использованием, например, гематопорфирина или фотофрина II) и гипертермии.
Хирургическая операция может представлять собой радикальную резекцию, паллиативную операцию, профилактическую операцию или циторедуктивную операцию. Обычно она предусматривает иссечение, например, интракапсулярное иссечение, краевое иссечение, обширное иссечение или радикальное иссечение, описанные в источнике Baron and Valin (Rec. Med. Vet, Special Canc. 1990; 11(166):999-1007).
Биологический противораковый агент или терапевтическое средство можно выбрать из группы, состоящей из антител (например, антител, стимулирующих иммунный ответ, разрушающий раковые клетки, например, ретуксимаба или алемтузумаба, антител, стимулирующих иммунный ответ посредством связывания с рецепторами иммунных клеток, генерирующих ингибиторные сигналы, не дающие иммунной клетке атаковать «собственные» клетки, например, ипилимумаба, антител, мешающих действию белков, необходимых для роста опухоли, например, бевацизумаба, цетуксимаба или панитумумаба, или антител, конъюгированных с лекарственным веществом, предпочтительно с веществом, уничтожающим клетки, например, токсином, химиотерапевтическим или радиоактивным веществом, например, Y-ибритумомаб-тиуксетана, I-тозитумомаба или адо-трастузумаб-эмтанзина), цитокинов (например, интерферонов или интерлейкинов, например, ИФН-альфа и ИЛ-2), вакцин (например, вакцин, содержащих антигены, ассоциированные с раком, например, сипулейцела-T), онколитических вирусов (например, природного онколитического вируса, например, реовируса, вируса болезни Ньюкасла или вируса свинки, или вирусов, полученных с помощью генной инженерии, например, вируса кори, аденовируса, вируса коровьей оспы или вируса герпеса, преимущественными мишенями которых являются клетки, несущие антигены, ассоциированные с раком), агентов для генной терапии (например, ДНК или РНК, замещающих модифицированный суппрессор опухоли, блокирующих экспрессию онкогена, улучшающих состояние иммунной системы субъекта, усиливающих чувствительность раковых клеток к химиотерапии, лучевой терапии или другим терапевтическим средствам, индуцирующих самоуничтожение клеток или придающих антиангиогенный эффект) и адоптивных Т-клеток (например, собранных у субъекта опухоль-инфильтрирующих T-клеток, отобранных по противоопухолевой активности, или собранных у субъекта T-клеток, генетически модифицированных с целью распознавания антигена, ассоциированного с раком).
В одном варианте реализации одно или более из противораковых лекарственных средств выбрано(ы) из группы, состоящей из ацетата абиратерона, ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, AC-T, ADE, адо-трастузумаб-эмтанзина, дималеата афатиниба, алдеслейкин, алемтузумаба, аминолевулновой кислоты, анастрозола, апрепитанта, триоксида мышьяка, аспарагиназы Erwinia chrysanthemi, акситиниба, азацитидина, BEACOPP, белиностата, гидрохлорида бендамустина, BEP, бевацизумаба, бексаротена, бикалутамида, блеомицина, бортезомиба, босутиниба, брентуксимаб-ведотина, бусульфана, кабазитаксела, кабозантиниб-S-малата, CAF, капецитабина, CAPOX, карбоплатина, карбоплатин-таксола, карфилзомиба, кармустина, имплантата с кармустином, церитиниба, цетуксимаба, хлорамбуцила, хлорамбуцил-преднизона, CHOP, цисплатина, клофарабина, CMF, COPP, COPP-ABV, кризотиниба, CVP, циклофосфамида, цитарабина, липосомного цитарабина, дабрафениба, дакарбазина, дактиномицина, дазатиниба, гидрохлорида даунорубицина, децитабина, дегареликса, денилейкин-дифтитокса, деносумаба, гидрохлорида дексразоксана, доцетаксела, гидрохлорида доксорубицина, липосомного гидрохлорида доксорубицина, элтромбопаг-оламина, энзалутамида, гидрохлорида эпирубицина, EPOCH, мезилата эрибулина, гидрохлорида эрлотиниба, фосфата этопозида, эверолимуса, эксеместана, FEC, филграстима, фосфата флударабина, фторурацила, FU-LV, фулвестранта, гефитиниба, гидрохлорида гемцитабина, гемцитабин-цисплатина, гемцитабин-оксалиплатина, гемтузумаб-озогамицина, глюкарпидазы, ацетата гозерелина, бивалентной вакцины против ВПЧ, рекомбинантной четырехвалентной вакцины против ВПЧ, гипер-CVAD, ибритумомаб-тиуксетана, ибрутиниба, ICE, иделалисиба, ифосфамида, мезилата иматиниба, имиквимода, иод-131-тозитумомаба и тозитумомаба, ипилимумаба, гидрохлорида иринотекана, иксабепилона, дитозилата лапатиниба, леналидомида, летрозола, лейковорина кальция, ацетата лейпролида, липосомного цитарабина, ломустина, гидрохлорида мехлорэтамина, ацетата мегестрола, меркаптопурина, месны, метотрексата, митомицина С, гидрохлорида митоксантрона, MOPP, неларабина, нилотиниба, обинутузумаба, офатумумаба, мепесукцината омацетаксина, OEPA, OFF, OPPA, оксалиплатина, паклитаксела, состава наночастиц паклитаксела, стабилизированных альбумином, PAD, палифермина, гидрохлорида палоносетрона, памидроната динатрия, панитумумаба, гидрохлорида пазопаниба, пэгаспаргазы, пэгинтерферона альфа-2b, пембролизумаба, пеметрекседа динатрия, пертузумаба, плериксафора, помалидомида, гидрохлорида понатиниба, пралатрексата, преднизона, гидрохлорида прокарбазина, дихлорида радия-223, гидрохлорида ралоксифена, рамуцирумаба, расбуриказы, R-CHOP, R-CVP, рекомбинантной бивалентной вакцины против ВПЧ, рекомбинантной четырехвалентной вакцины против ВПЧ, рекомбинантного интерферона альфа-2b, регорафениба, ритуксимаба, ромидепсина, ромиплостима, фосфата руксолитиниба, силтуксимаба, сипулейцела-T, тозилата сорафениба, STANFORD V, малата сунитиниба, TAC, талька, цитрата тамоксифена, темозоломида, темсиролимуса, талидомида, гиброхлорида топотекана, торемифена, тозитумомаба и иод-131-тозитумомаба, TPF, траметиниба, трастузумаба, вандетаниба, VAMP, VeIP, вемурафениба, сульфата винбластина, сульфата винкристина, липосомного сульфата винкристина, тартрата винорелбина, висмодегиба, вориностата, XELOX, зив-афлиберцепта и золедроновой кислоты или их солей.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения соединения в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения.
В предпочтительных вариантах реализации соединение, характеризующееся формулой ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH26, где ABZ представляет собой 2-аминобензойную кислоту, а ANB-NH2 представляет собой амид 5-амино-2-нитробензойной кислоты, получают в соответствии с процессом, выполняемым на твердой подложке, предпочтительно содержащей Fmoc-группу. Перед инициацией процесса выполняют подготовку твердой подложки, ее объем увеличивают путем повторной промывки гидрофобными растворителями, предпочтительно диметилформамидом, метиленхлоридом или N-метилпирролидоном, и удаления защитной Fmoc-группы, предпочтительно путем промывки 10-30% раствором пиперидина в таких растворителях, как диметилформамид, метиленхлорид или N-метилпирролидон. Затем выполняют процесс, включающий следующие стадии:
a) Осаждение 5-амино-2-нитробензойной кислоты ANB на смоле с предварительной промывкой твердой подложки 3-6% раствором N-метилморфолина (NMM) в ДМФ, а затем ДМФ. Затем получают раствор ANB в ДМФ, к которому добавляют TBTU, ДМАП и, наконец, диизопропилэтиламин (ДИПЭА) в следующем избытке по отношению к осаждаемому полимеру: ANB/TBTU/ДМАП/ДИПЭА, 3:3:2:6. Полученную смесь добавляют к смоле и перемешивают до гомогенности, затем смолу отфильтровывают при пониженном давлении и промывают такими растворителями, как ДМФ, ДХМ и изопропанол. Затем продолжают связывание ANB со смолой, используя гексафторфосфат-O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HATU), а затем гексафторфосфат-O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HBTU) в избытке, и после завершения твердую подложку последовательно промывают ДМФ, ДХМ и изопропанолом и аккуратно высушивают.
b) Присоединение аминокислотного остатка к ANB выполняют с использованием реакции с Fmoc-Arg (Pbf)-OH-производным аминокислоты при по меньшей мере пятикратном молярном избытке производного аминокислоты по отношению к смоле, растворенным в безводном пиридине и контактирующем со смолой с осажденной ANB. Затем всю смесь охлаждают до температуры не ниже 20°C, добавляют POCl3 в соотношении 1:1 по отношению к используемому количеству производного аминокислоты и перемешивают. Процесс перемешивания выполняют при комнатной температуре, а затем при повышенной температуре, после завершения реакции смолу отфильтровывают при пониженном давлении, промывают ДМФ и MeOH и аккуратно высушивают, полученное промежуточное соединение подвергают процессу ацилирования.
c) Ацилирование полученного промежуточного соединения выполняют с использованием производного аминокислоты, предпочтительно Fmoc-Ala-OH, затем Fmoc-Thr (tBu)-OH, затем Fmoc-Thr(tBu)-OH и, наконец, Boz-Abz-OH. Ацилирование выполняют поэтапно от 6 до 1 остатка, используя избыток диизопропилкарбодиимида в качестве связывающего агента. В конце каждого этапа смолу промывают ДМФ и (предпочтительно) подвергают хлораниловому тесту, при котором отслеживают присоединение производного аминокислоты.
d) Удаление защитной Fmoc-группы выполняют путем промывки 10-30% раствором пиперидина в ДМФ и последующей промывки каждым из растворителей: ДМФ, изопропанолом и метиленхлоридом.
e) Отделение пептида от смолы выполняют с использованием смеси: ТФУК, фенола, воды и TIPS, поддерживая отношение 88:5:5:2 (об/об/об/об), соответственно; смесь перемешивают в течение по меньшей мере одного часа, предпочтительно трех часов, и полученный осадок отфильтровывают при пониженном давлении, промывают диэтиловым эфиром, а полученный пептид центрифугируют.
f) Получение конечного продукта выполняют путем растворения пептида в воде посредством обработки ультразвуком и лиофилизации.
В предпочтительных вариантах реализации соединение, характеризующееся формулой ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6, где ABZ представляет собой 2-аминобензойную кислоту, а pNA представляет собой пара-нитроанилин, получают в соответствии с процессом, выполняемым на твердой подложке, предпочтительно содержащей Fmoc-группу. Перед инициацией процесса выполняют подготовку твердой подложки, ее объем увеличивают путем повторной промывки гидрофобными растворителями, предпочтительно диметилформамидом, метиленхлоридом или N-метилпирролидоном, и удаления защитной Fmoc-группы, предпочтительно путем промывки 10-30% раствором пиперидина в таких растворителях, как диметилформамид, метиленхлорид или N-метилпирролидон; затем выполняют процесс, включающий следующие стадии:
a) Присоединение третьего аминокислотного остатка (Fmoc-Ala) к смоле выполняют с использованием производного соответствующей аминокислоты в 9-кратном молярном избытке по отношению к осажденной смоле, растворенного в безводном метиленхлориде. Затем смесь перемешивают в течение по меньшей мере двух часов при комнатной температуре; после завершения реакции смолу отфильтровывали при пониженном давлении, промывали ДМФ и MeOH, а затем высушивали.
b) При последующих этапах выполняют присоединение аминокислотного остатка, называемое в дальнейшем ацилированием, и используют производное Fmoc-Thr(tBu)-OH, а затем Fmoc-Thr(tBu)-OH и Boc-ABZ-OH; перед каждым этапом выполняют промывку смолы ДМФ, предпочтительно в течение 5 минут; при последующих присоединениях используют связывающий агент, предпочтительно диизопропилкарбодиимид, который используют в избытке. Эту процедуру повторяют дважды, и после каждого этапа смолу промывают ДМФ и предпочтительно подвергают хлораниловому тесту, при котором отслеживают присоединение производного аминокислоты.
c) Удаление защитной Fmoc-группы выполняют путем промывки 10-30% раствором пиперидина в ДМФ и последующей промывки каждым из растворителей: ДМФ, изопропанолом и метиленхлоридом.
d) Повторно выполняют этапы с b) по c) до получения соединения (ABZ1-Thr(tBu)2-Thr (tBu)3-Ala4-OH); синтез осуществляют с 6 по 3 остаток, а затем полученное соединение отсоединяют от твердой подложки с использованием смеси: ТФУК: фенол: вода: TIPS в пропорциях 88:5:5:2 (об/об/об/об), соответственно, при перемешивании. Через по меньшей мере два часа содержимое колбы отфильтровывают при пониженном давлении, а осадок промывают диэтиловым эфиром. Затем осадок центрифугируют в течение предпочтительно 20 минут, растворяют в воде путем обработки ультразвуком, а затем лиофилизируют.
e) Синтез Fmoc-Arg (Pbf)-pNA выполняют поэтапно; на первой стадии 2 ммоль Fmoc-Arg (Pbf) растворяют в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) в присутствии 2 ммоль N-метилморфолина (NMM), и карбоксильную группу производного аминокислоты активируют 2 ммоль изобутилхлорида. После 10 минут активации добавляют 3 ммоль п-нитроанилина и выполняют реакцию в течение (предпочтительно) 2 часов при температуре (предпочтительно) -15°C, а затем в течение дня при комнатной температуре. После завершения реакции растворитель выпаривают, а сухой остаток растворяют в этилацетате, затем полученный раствор последовательно промывают водным раствором NaCl, 10% лимонной кислоты, 5% бикарбоната натрия и высушивают над безводным сульфатом натрия; этилацетат дистиллируют при пониженном давлении, а сухой остаток высушивают.
f) Объединение защищенного пептида ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH с пара-нитроанилидом Arg (Pbf) основано на следующем процессе: защищенный пептид ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH растворяют в небольшом количестве ДХМ, а затем активируют TFFH (тетраметилфторформамидом) предпочтительно в течение 30 минут и предпочтительно при температуре 0°C, после чего добавляют каталитическое количество ДМАП и Fmoc-Arg(Pbf)5-pNA6. Реакцию предпочтительно выполняют в течение 24 часов при комнатной температуре, после чего растворитель выпаривают, а полученный раствор вливают в смесь для удаления защиты боковой группы: ТФУК: фенол: вода: TIPS (88:5:5:2, (об/об/об/об)), и перемешивают предпочтительно в течение 3 часов.
g) Готовый продукт получают путем растворения пептида в воде за счет обработки ультразвуком, а затем подвергают лиофилизации.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана скорость гидролиза субстрата (1) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 в образцах мочи пациентов, у которых диагностирован рак (образцы 1-10) и в моче здоровых лиц (11-25). Номер выбранного образца мочи указан арабскими цифрами. На фигуре 1 показано, что все образцы 1-10 расщепились, однако в образцах 3 и 10 разрушение субстрата ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 происходило с большей эффективностью, чем для материалов 2 или 9. Этот результат может быть обусловлен различиями в активности и количестве ферментов, ответственных за протеолиз. Кроме того, на фигуре 1 показано, что инкубирование раствора соединения формулы 2 с образцами мочи здоровых лиц (без диагностированного рака) не ведет к увеличению поглощения и, следовательно, гидролиз тестируемого соединения не происходит. Этот результат указывает на отсутствие протеолитических ферментов, характерных для рака поджелудочной железы.
На фиг. 2 показана скорость гидролиза субстрата (2) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA в образцах мочи пациентов, у которых диагностирован рак (образцы 1-10) и в моче здоровых лиц (11-25). Номер выбранного образца мочи указан арабскими цифрами. Получен результат, аналогичный описанному выше для фиг. 1.
На фиг. 3 показана зависимость между степенью гидролиза субстрата (1) ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2 и pH среды. Протестированные значения pH указаны на оси х. Выполнена оценка зависимости между протеолитической активностью и рН реакционной среды. В результате этого эксперимента обнаружено, что протестированный материал содержал по меньшей мере один фермент, демонстрирующий максимальную активность при щелочных значениях pH.
На фиг. 4 показан ОФ-ВЭЖХ анализ случайно выбранной системы, содержащей мочу лица с диагнозом рака поджелудочной железы. Оба соединения (1) (ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2, показано) и (2) (ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA, не показано) разрушались на пептидный фрагмент ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg и хромофор (ANB-NH2 или pNA, соответственно). A: субстрат ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2 в 200 мМ трис-HCl буфере, pH 8.0. B: Гидролиз субстрата ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB NH2 в моче пациентов с диагнозом рака поджелудочной железы.
Примеры
Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами реализации.
Пример 1: Синтез соединения ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH26
1. Получение хромогенного пептида
a) Первой стадией синтеза являлось получение хромогенного пептида посредством твердофазного синтеза - на твердой подложке, с использованием химии Fmoc/tBu, т.е. с использованием защиты.
Соединение с последовательностью ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH26, где ABZ представляет собой 2-аминобензойную кислоту, а ANB-NH2 представляет собой амид 5-амино-2 бензойной кислоты, получали в соответствии с процессом химического синтеза на твердой фазе с использованием производных аминокислот.
Boc-ABZ, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-Arg(Pbf), ANB
Синтез соединения, т.е. диагностического маркера для обнаружения рака поджелудочной железы, диагноз которого ассоциирован с гидролизом этого соединения под действием протеолитических ферментов, выполняли на твердой подложке, позволявшей преобразовывать 5-амино-2-бензойную кислоту в амид ANB-NH2:
- например, амидная смола, например, TentaGel S RAM производства RAPP Polymere (Германия), например, с использованием осадка 0,23 ммоль/г.
Можно использовать другие доступные для приобретения амидные смолы, в том числе Rink Amide (Германия).
Соединение синтезировали вручную с использованием лабораторного шейкера. Для большинства этапов в качестве реактора использовали 25-мл керамический шприц для твердофазного синтеза.
Все полученные конечные соединения содержали ABZ 2-аминобензойную кислоты в положении 1 своей последовательности (т.е. на N-конце), и молекулу ANB 5-амино-2-нитробензойной кислоты в положении 6 (на C-конце). ABZ действовала в качестве донора флуоресценции, в то время как ANB (5-амино-2-бензойная кислота) - в качестве гасителя флуоресценции и хромофора. Последовательность пептидов содержала по меньшей мере (и предпочтительно) один реакционноспособный сайт, расположенный между аминокислотными остатками Arg-ANB-NH2: в положении 5 соединения. Синтез, включая присоединение производных аминокислот, выполняли от остатка 6 к остатку 1, т.е. с C-конца к N-концу.
b) Осаждение ANB на смоле TentaGel S RAM:
Синтез пептидов выполняли на смоле TentaGel S RAM (Rapp Polymere) с использованием осадка 0,23 ммоль/г. На первой стадии выполняли подготовку смолы, включая ее разрыхление за счет цикла промывки. В дальнейшем с твердой подложки удаляли Fmoc-защиту аминогруппы 20% раствором пиперидина в NMP, и выполняли цикл промывки растворителем. Для подтверждения присутствия свободных аминогрупп выполняли хлораниловый тест.
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 1 x 10 минут
IsOH 1 x 10 минут
ДХМ 1 x 10 минут
Удаление Fmoc-защиты:
ДМФ 1 x 5 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 3 минуты
20% пиперидин в NMP 1 x 8 минут
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
c) Хлораниловый тест:
Хлораниловый тест состоял из переноса (с помощью шпателя) нескольких гранул смолы из реактора-шприца в стеклянную ампулу, в которую добавляли 100 мкл насыщенного раствора п-хлоранила в толуоле и 50 мкл свежего ацетальдегида. Через 10 минут выполняли контроль цвета гранул.
На этой стадии, после выполнения теста, получали зеленое окрашивание гранул, что указывало на присутствие свободных аминогрупп. После подтверждения удаления 9-флуоренилметоксикарбонильной защиты со смолы становилось возможно перейти к следующей стадии, присоединению производного ANB (5-амино-2-нитробензойной кислоты)
d) Осаждение 5-амино-2-нитробензойной кислоты на твердой подложке
Первый этап синтеза пептидной библиотеки - смеси пептидов представлял собой осаждение ANB на 1 г смолы. Перед присоединением хромофора смолу, используемую для реакции, промывали следующими растворителями: ДМФ, ДХМ и снова ДМФ, после чего удаляли Fmoc-защиту с функциональной группы твердой подложки. Один цикл удаления Fmoc-защиты включал следующие этапы:
Удаление Fmoc-защиты:
20% пиперидин в NMP 1 x 3 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 8 минут
e) Промывка
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
f) Хлораниловый тест на предмет присутствия свободных аминогрупп.
Смолу со свободными аминогруппами промывали 5% раствором N-метилморфолина (NMM) в ДМФ, а затем ДМФ. Процедуру удаления Fmoc-защиты и цикл промывки выполняли в сосуде Меррифилда. ANB растворяли в ДМФ в отдельной колбе и последовательно добавляли TBTU, ДМАП и, наконец, диизопропилэтиламин (ДИПЭА) в следующем избытке по отношению к осаждаемому полимеру: ANB/TBTU/DMA/ДИПЭА, 3:3:2:6. Смесь, полученную таким образом, добавляли к смоле и перемешивали в течение 3 часов. Смолу отфильтровывали при пониженном давлении, промывали ДМФ, ДХМ и изопропанолом, всю процедуру ацилирования повторяли два раза. Для выполнения последовательных реакций присоединения ANB к смоле использовали гексафторфосфат-O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HATU), а затем гексафторфосфат-O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N'N'-тетраметилуроний (HBTU). На последнем этапе смолу последовательно промывали ДМФ, ДХМ и изопропанолом и высушивали на воздухе.
g) Присоединение C-концевого аминокислотного остатка к ANB
Производное соответствующей аминокислоты (в 9-кратном молярном избытке по отношению к осаждаемой смоле) растворяли в пиридине и переносили в колбу, содержащую смолу с осажденной ANB. Смесь охлаждали до -15°C (ледяная баня: 1 массовая часть NH4Cl, 1 массовая часть NaNO3, 1 массовая часть льда). После достижения комнатной температуры добавляли POCl3 (в отношении 1:1 к количеству используемого производного аминокислоты), и перемешивали смесь на магнитной мешалке: 20 минут при -15°C, 30 минут при комнатной температуре, и 6 часов при 40°C (масляная баня). После завершения реакции смолу отфильтровывали при пониженном давлении, промывали ДМФ и MeOH, и оставляли сушиться.
На следующем этапе остаток (аланина) присоединяли в положении P2.
Перед каждым присоединением аминокислотных остатков смолу промывали ДМФ в течение 5 минут. При последующих реакциях присоединения в качестве связывающего агента использовали диизопропилкарбодиимид. Эту процедуру повторяли дважды.
После каждого ацилирования начинали цикл промывки смолы, а затем выполняли хлораниловый тест для отслеживания присоединения производного аминокислоты к свободным аминогруппам смолы.
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
Хлораниловый тест:
В результате тестов после первых двух присоединений гранулы были вначале зелеными, а затем серыми, поэтому было необходимо выполнить еще одно ацилирование, в результате которого гранулы смолы, протестированные с помощью хлоранилового теста, были бесцветными. Это указывало на присоединение ANB к смоле TentaGel S RAM, что позволяло перейти к следующей стадии синтеза пептидов.
h) Присоединение дальнейших защищенных аминокислотных остатков:
Смолу вместе с присоединенным остатком ANB в реакторе промывали ДМФ, а затем выполняли снятие Fmoc-защиты с аминогрупп для присоединения защищенного производного аминокислоты аланина.
Удаление Fmoc-защиты:
ДМФ 1 x 5 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 3 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 8 минут
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
Хлораниловый тест:
Результат хлоранилового теста был положительным, на что указывало зеленое окрашивание гранул смолы. Это позволяло перейти к следующей стадии - присоединению аминокислотного остатка Fmoc-Thr (tBu)-OH.
Присоединение производного аминокислоты:
Перед процессом присоединения выполняли промывку смолы ДМФ. Состав смеси для присоединения оставался неизменным при присоединении защищенного остатка глутаминовой кислоты.
В конце каждого ацилирования выполняли цикл промывки растворителем в соответствии с заданной процедурой, после которой выполняли хлораниловый тест на предмет присутствия свободных аминогрупп в растворе.
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
Хлораниловый тест:
Гранулы смолы во время теста, выполняемого после второго ацилирования, были бесцветными, что позволяло перейти к следующей стадии синтеза, т.е. введению еще одного защищенного производного аминокислоты - треонина и молекулы 2-аминобензойной кислоты. Процесс присоединения выполняли в соответствии с ранее обсуждавшейся процедурой.
Тесты, выполненные после присоединения вышеупомянутых остатков, дали положительные результаты: гранулы смолы были бесцветными.
2. Уделение пептида с твердой подложки
После синтеза амид пептида ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 удаляли с твердой подложки с одновременным удалением защиты боковой цепи смесью: ТФУК : фенол : вода : TIPS (88:5:5:2, (об/об/об/об)) в круглодонной колбе на магнитной мешалке.
Через 3 часа содержимое колбы отфильтровывали при пониженном давлении на керамической воронке (Шотта) и промывали диэтиловым эфиром. Полученный осадок центрифугировали на центрифуге SIGMA 2K30 (Laboratory Centrifuges) в течение 20 минут. Осадок, полученный после центрифугирования, растворяли в воде путем обработки ультразвуком и лиофилизировали.
Подлинность/характеристики нового соединения - ВЭЖХ-анализ, МС
Условия ВЭЖХ: Колонка RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 мм 4 мм, система фаз A 0,1% ТФУК в воде, B: 80% ацетонитрил в фазе A), скорость потока 1 мл/мин, УФ-обнаружение при длине волны 226 нм.
Получение соединения подтвердилось.
Пример 2: Получение соединения формулы: ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6
Процесс выполняли аналогично описанию в примере 1, за исключением использования производных соответствующих аминокислот и дополнительных заместителей, и процесс выполняли частично в растворе, а частично - на твердой подложке.
Получение п-нитроанилида Ala
a) Первой стадией синтеза являлось защищенного пептида посредством твердофазного синтеза с использованием химии Fmoc/tBu.
Соединение ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH, где ABZ представляло собой 2-аминобензойную кислоту, получали посредством твердофазного химического синтеза с использованием следующих производных аминокислот:
Boc-ABZ, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala.
Соединение синтезировали на твердой подложке:
- 2-хлор-хлортритиловая смола, например, производства Iris BIOTECH GMBH (Германия), с осаждением 1,6 ммоль Cl/г групп.
Соединение синтезировали вручную с использованием лабораторного шейкера. На всех стадиях в качестве реактора использовали 25-мл керамический шприц для твердофазного синтеза.
Синтез пептидов выполняли на твердой подложке: 2-хлор-хлортритиловая смола, например, производства Iris BIOTECH GMBH (Германия), с осаждением 1,6 ммоль Cl/г групп. На первой стадии смолу разрыхляли за счет цикла промывки. Затем с твердой подложки удаляли Fmoc-защиту аминогруппы 20% раствором пиперидина в NMP. Затем выполняли цикл промывки растворителем. Для подтверждения присутствия свободных аминогрупп выполняли хлораниловый тест.
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 1 x 10 минут
IsOH 1 x 10 минут
ДХМ 1 x 10 минут
Удаление Fmoc-защиты:
ДМФ 1 x 5 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 3 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 8 минут
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
b) Хлораниловый тест:
Хлораниловый тест состоял из переноса (с помощью шпателя) нескольких гранул смолы из реактора-шприца в стеклянную ампулу и добавления 100 мкл насыщенного раствора п-хлоранила в толуоле и 50 мкл свежего ацетальдегида. Через 10 минут выполняли контроль цвета гранул.
На этой стадии, после теста, получали зеленое окрашивание гранул, что указывало на присутствие свободных аминогрупп. После подтверждения удаления 9-флуоренилметоксикарбонильной защиты со смолы инициировали присоединение производного Fmoc-Ala.
c) Встраивание Fmoc-Ala на твердую подложку
Первый этап синтеза пептидной библиотеки представлял собой осаждение Fmoc-Ala на 1 г смолы. Перед присоединением производного аминокислоты смолу, используемую для реакции, промывали следующими растворителями: ДМФ (диметилформамидом), ДХМ (метиленхлоридом) и снова ДМФ, после чего удаляли Fmoc-защиту с функциональной группы твердой подложки. Один цикл удаления Fmoc-защиты включал следующие этапы:
Удаление Fmoc-защиты:
20% пиперидин в NMP 1 x 3 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 8 минут
Промывка
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
Хлораниловый тест на предмет присутствия свободных аминогрупп.
Смолу со свободными аминогруппами промывали ДМФ. В отдельной колбе растворяли Fmoc-Ala в ДМФ. Затем добавляли TBTU, ДМАП и, наконец, диизопропилэтиламин (ДИПЭА) в избытке к осаждаемому полимеру: Fmoc-Pro/TBTU/ДМАП/ДИПЭА, 3:3:2:6. Полученную смесь добавляли к смоле и перемешивали в течение 3 часов. Смолу отфильтровывали при пониженном давлении, промывали ДМФ, ДХМ и изопропанолом, всю процедуру ацилирования повторяли два раза. Для выполнения последовательных реакций присоединения Fmoc-Pro к смоле использовали гексафторфосфат-O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HATU), а затем гексафторфосфат-O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N'N'-тетраметилуроний (HBTU). На последнем этапе смолу последовательно промывали ДМФ, ДХМ и изопропанолом и высушивали на воздухе.
c. Присоединение дальнейших защищенных аминокислотных остатков:
Смолу вместе с присоединенным остатком Fmoc-Ala в реакторе промывали ДМФ, а затем выполняли снятие Fmoc-защиты с аминогруппы для присоединения защищенного производного треонина.
Удаление Fmoc-защиты:
ДМФ 1 x 5 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 3 минут
20% пиперидин в NMP 1 x 8 минут
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
Хлораниловый тест:
Результат хлоранилового теста был положительным, на что указывало зеленое окрашивание гранул смолы. Это позволяло перейти к следующей стадии - присоединению аминокислотного остатка Fmoc-Thr (tBu)-OH.
Присоединение производного аминокислоты:
Перед процессом присоединения выполняли промывку смолы ДМФ. Состав смеси для присоединения оставался неизменным при присоединении защищенного остатка глутаминовой кислоты.
В конце каждого ацилирования выполняли цикл промывки растворителем в соответствии с заданной процедурой, после которой выполняли хлораниловый тест на предмет присутствия свободных аминогрупп в растворе.
Цикл промывки растворителем:
ДМФ 3 x 2 минут
IsOH 3 x 2 минут
ДХМ 3 x 2 минут
Хлораниловый тест:
Гранулы смолы во время теста, выполняемого после второго ацилирования, были бесцветными, что позволяло перейти к следующей стадии синтеза, т.е. введению еще одного защищенного производного аминокислоты - треонина и молекулы 2-аминобензойной кислоты. Процесс присоединения выполняли в соответствии с ранее обсуждавшейся процедурой.
Тесты, выполненные после присоединения вышеупомянутых остатков, дали положительные результаты: гранулы смолы были бесцветными.
a) Удаление пептида с твердой подложки с сохранением защиты боковой группы
После завершения синтеза защищенный пептид ABZ-Thr(tBu)-Th (tBu)-Ala-OH удаляли с твердой подложки с сохранением защиты боковой группы, используя следующую смесь: уксусная кислота: TFE (трифторэтанол): ДХМ (2:2:6 (об/об/об)) в круглодонной колбе на магнитной мешалке.
Через 2 часа содержимое колбы отфильтровывали при пониженном давлении на керамической воронке (Шотта), промывали вязкой смесью. Раствор промывали гексаном (1:10 (об/об)), выпаривали при пониженном давлении, а затем лиофилизировали.
b) Химический синтез производных пара-нитроанилида и Arg
Для синтеза Fmoc-Arg(Pbf)-pNA использовали смешанный ангидридный способ. На первом этапе 2 ммоль Fmoc-Arg (Pbf) растворяли в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) в присутствии 2 ммоль N-метилморфолина (NMM). Карбоксильную группу производного аминокислоты активировали 2 ммоль изобутилхлорида. Через 10 минут активации добавляли 3 ммоль п-нитроанилина. Реакции выполняли в течение 2 часов при -15°C, а затем в течение 24 часов при комнатной температуре. После завершения реакции растворитель выпаривали, а сухой остаток растворяли в этилацетате. Полученный раствор последовательно промывали насыщенным водным раствором NaCl, 10% лимонной кислотой и 5% бикарбонатом натрия. Полученный раствор высушивали над безводным сульфатом натрия, этилацетат дистиллировали при пониженном давлении, а сухой остаток высушивали в вакуумном эксикаторе над P2O5 и KOH.
c) Присоединение защищенного пептида к пара-нитроанилиду Arg (Pbf)
Защищенный пептид ABZ1-Thr(tBu)2-Thr (tBu)3-Ala4-OH растворяли в небольшом количестве ДХМ и последовательно активировали TFFH (тетраметилфторформамидом) в течение 30 минут при 0°C. Затем добавляли каталитическое количество ДМАП и Arg (Pbf)-pNA. Реакцию выполняли в течение 24 часов при комнатной температуре, после чего растворитель выпаривали. Полученный раствор вливали в смесь, удаляя защиту с боковой группы: ТФУК : фенол : вода : TIPS (88:5:5:2, (об/об/об/об) и перемешивали в круглодонной колбе на магнитной мешалке в течение 3 часов.
После этого в колбу добавляли холодный диэтиловый эфир, полученный осадок центрифугировали на высокоскоростной центрифуге при 5000 об/мин в течение 20 минут. Осадок, полученный после центрифугирования, растворяли в воде путем обработки ультразвуком, а затем лиофилизировали.
Подлинность/характеристики нового соединения - ВЭЖХ-анализ, МС
Условия ВЭЖХ: Колонка RP Bio Wide Pore Supelco C8 250 мм 4 мм, система фаз A 0,1% ТФУК в воде, B: 80% ацетонитрил в фазе A), скорость потока 1 мл/мин, УФ-обнаружение при длине волны 226 нм. Получение соединения подтвердилось.
Пример 3
Исследование применения нового соединения выполняли в группе из 10 пациентов с диагнозом рака поджелудочной железы. Для этой цели соединение формулы 2? ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-ANB-NH2 или формулы 3: ABZ-Thr-Thr-Ala-Arg-pNA растворяли в диметилсульфоксиде(в концентрации 0,5 мг/мл); 50 мкл этого раствора смешивали с 120 мкл буфера (200 мМ трис-HCl, pH 8,0) и 80 мкл мочи лица с раком поджелудочной железы. Измерение выполняли в 96-луночном планшете, предназначенном для измерения поглощения, и каждый образец анализировали в трех повторностях при 37°C. Продолжительность измерения составила 60 минут. Во время измерения спектральные характеристики высвобожденного хромофора (ANB-NH2 или pNA) отслеживали при 405 нм (в диапазоне 380-430 нм).
В результате измерения окрашивание раствора увеличивалось со временем во всех образцах мочи пациентов с диагнозом рака поджелудочной железы. Наблюдаемое увеличение поглощения со временем отличалось для каждого из тестируемых образцов. Для 15 образцов здоровых людей получили другой эффект, поскольку ни в одном из 15 протестированных образцов мочи не наблюдали увеличения поглощения в диагностическом диапазоне.
Анализ подтвердил применение соединений в соответствии с примерами при диагностике рака поджелудочной железы. Механизм действия новых соединений основан на их ферментативном гидролизе в таких условиях, что приводит к высвобождению свободных молекул хромофора, ANB-NH2 - амида 5-амино-2-нитробензойной кислоты или pNA - пара-нитроанилина, соответственно, которые характеризуются поглощением при 320-480 нМ, особенно при 380-430 нм.
Настоящее изобретение дополнительно относится к
1. Химическому соединению - диагностическому маркеру общей формулы:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-X6 (формула 1)
где:
ABZ - 2-аминобензойная кислота,
X - ANB-NH2 или pNA,
где ANB-NH2 представляет собой амид 5-амино-2-бензойной кислоты,
ANB - 5-амино-2-нитробензойная кислота,
а pNA - пара-нитроанилин.
2. Способу получения химического соединения - диагностического маркера
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-ANB-NH26, (формула 2)
где:
ABZ - 2-аминобензойная кислота,
где ANB-NH2 представляет собой амид 5-амино-2-нитробензойной кислоты,
основанному на том, что указанный процесс выполняют на твердой подложке, предпочтительно содержащей Fmoc-группу. Перед инициацией процесса выполняют подготовку твердой подложки, ее объем увеличивают путем повторной промывки гидрофобными растворителями, предпочтительно диметилформамидом, метиленхлоридом или N-метилпирролидоном, и удаления защитной Fmoc-группы, предпочтительно путем промывки 10-30% раствором пиперидина в таких растворителях, как диметилформамид, метиленхлорид или N-метилпирролидон. Затем выполняют процесс, включающий следующие стадии:
a) Осаждение 5-амино-2-нитробензойной кислоты ANB на смоле с предварительной промывкой твердой подложки 3-6% раствором N-метилморфолина (NMM) в ДМФ, а затем ДМФ. Затем получают раствор ANB в ДМФ, к которому добавляют TBTU, ДМАП и, наконец, диизопропилэтиламин (ДИПЭА) в следующем избытке по отношению к осаждаемому полимеру: ANB/TBTU/ДМАП/ДИПЭА, 3:3:2:6. Полученную смесь добавляют к смоле и перемешивают до гомогенности, затем смолу отфильтровывают при пониженном давлении и промывают такими растворителями, как ДМФ, ДХМ и изопропанол. Затем продолжают связывание ANB со смолой, используя гексафторфосфат-O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HATU), а затем гексафторфосфат-O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилуроний (HBTU) в избытке, и после завершения твердую подложку последовательно промывают ДМФ, ДХМ и изопропанолом и аккуратно высушивают.
b) Присоединение аминокислотного остатка к ANB выполняют с использованием реакции с Fmoc-Arg (Pbf)-OH-производным аминокислоты при по меньшей мере пятикратном молярном избытке производного аминокислоты по отношению к смоле, растворенным в безводном пиридине и контактирующем со смолой с осажденной ANB. Затем всю смесь охлаждают до температуры не ниже 20°C, добавляют POCl3 в соотношении 1:1 по отношению к используемому количеству производного аминокислоты и перемешивают. Процесс перемешивания выполняют при комнатной температуре, а затем при повышенной температуре, после завершения реакции смолу отфильтровывают при пониженном давлении, промывают ДМФ и MeOH и аккуратно высушивают, полученное промежуточное соединение подвергают процессу ацилирования.
c) Ацилирование полученного промежуточного соединения выполняют с использованием производного аминокислоты, предпочтительно Fmoc-Ala-OH, затем Fmoc-Thr (tBu)-OH, затем Fmoc-Thr(tBu)-OH и, наконец, Boz-Abz-OH. Ацилирование выполняют поэтапно от 6 до 1 остатка, используя избыток диизопропилкарбодиимида в качестве связывающего агента. В конце каждого этапа смолу промывают ДМФ и (предпочтительно) подвергают хлораниловому тесту, при котором отслеживают присоединение производного аминокислоты.
d) Удаление защитной Fmoc-группы выполняют путем промывки 10-30% раствором пиперидина в ДМФ и последующей промывки каждым из растворителей: ДМФ, изопропанолом и метиленхлоридом.
e) Отделение пептида от смолы выполняют с использованием смеси: ТФУК, фенола, воды и TIPS, поддерживая отношение 88:5:5:2 (об/об/об/об), соответственно; смесь перемешивают в течение по меньшей мере одного часа, предпочтительно трех часов, и полученный осадок отфильтровывают при пониженном давлении, промывают диэтиловым эфиром, а полученный пептид центрифугируют.
f) Получение конечного продукта выполняют путем растворения пептида в воде посредством обработки ультразвуком и лиофилизации.
3. Способу получения химического соединения - диагностического маркера:
ABZ1-Thr2-Thr3-Ala4-Arg5-pNA6, (формула 3)
где:
ABZ - 2-аминобензойная кислота,
pNA - пара-нитроанилид,
основанному на том, что указанный процесс выполняют на твердой подложке, предпочтительно содержащей Fmoc-группу. Перед инициацией процесса выполняют подготовку твердой подложки, ее объем увеличивают путем повторной промывки гидрофобными растворителями, предпочтительно диметилформамидом, метиленхлоридом или N-метилпирролидоном, и удаления защитной Fmoc-группы, предпочтительно путем промывки 10-30% раствором пиперидина в таких растворителях, как диметилформамид, метиленхлорид или N-метилпирролидон; затем выполняют процесс, включающий следующие стадии:
a) Присоединение третьего аминокислотного остатка (Fmoc-Ala) к смоле выполняют с использованием производного соответствующей аминокислоты в 9-кратном молярном избытке по отношению к осажденной смоле, растворенного в безводном метиленхлориде. Затем смесь перемешивают в течение по меньшей мере двух часов при комнатной температуре; после завершения реакции смолу отфильтровывают при пониженном давлении, промывают ДМФ и MeOH, а затем высушивают.
b) При последующих этапах выполняют присоединение аминокислотного остатка, называемое в дальнейшем ацилированием, и используют производное Fmoc-Thr(tBu)-OH, а затем Fmoc-Thr(tBu)-OH и Boc-ABZ-OH; перед каждым этапом выполняют промывку смолы ДМФ, предпочтительно в течение 5 минут; при последующих присоединениях используют связывающий агент, предпочтительно диизопропилкарбодиимид, который используют в избытке. Эту процедуру повторяют дважды, и после каждого этапа смолу промывают ДМФ и предпочтительно подвергают хлораниловому тесту, при котором отслеживают присоединение производного аминокислоты.
c) Удаление защитной Fmoc-группы выполняют путем промывки 10-30% раствором пиперидина в ДМФ и последующей промывки каждым из растворителей: ДМФ, изопропанолом и метиленхлоридом.
d) Повторно выполняют этапы с b) по c) до получения соединения (ABZ1-Thr(tBu)2-Thr (tBu)3-Ala4-OH); синтез осуществляют с 6 по 3 остаток, а затем полученное соединение отсоединяют от твердой подложки с использованием смеси: ТФУК: фенол: вода: TIPS в пропорциях 88:5:5:2 (об/об/об/об), соответственно, при перемешивании. Через по меньшей мере два часа содержимое колбы отфильтровывают при пониженном давлении, а осадок промывают диэтиловым эфиром. Затем осадок центрифугируют в течение предпочтительно 20 минут, растворяют в воде путем обработки ультразвуком, а затем лиофилизируют.
e) Синтез Fmoc-Arg (Pbf)-pNA выполняют поэтапно; на первой стадии 2 ммоль Fmoc-Arg (Pbf) растворяют в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) в присутствии 2 ммоль N-метилморфолина (NMM), и карбоксильную группу производного аминокислоты активируют 2 ммоль изобутилхлорида. После 10 минут активации добавляют 3 ммоль п-нитроанилина и выполняют реакцию в течение (предпочтительно) 2 часов при температуре (предпочтительно) -15°C, а затем в течение дня при комнатной температуре. После завершения реакции растворитель выпаривают, а сухой остаток растворяют в этилацетате, затем полученный раствор последовательно промывают водным раствором NaCl, 10% лимонной кислоты, 5% бикарбоната натрия и высушивают над безводным сульфатом натрия; этилацетат дистиллируют при пониженном давлении, а сухой остаток высушивают.
f) Объединение защищенного пептида ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH с пара-нитроанилидом Arg (Pbf) основано на следующем процессе: защищенный пептид ABZ1-Thr(tBu)2-Thr(tBu)3-Ala4-OH растворяют в небольшом количестве ДХМ, а затем активируют TFFH (тетраметилфторформамидом) предпочтительно в течение 30 минут и предпочтительно при температуре 0°C, после чего добавляют каталитическое количество ДМАП и Fmoc-Arg(Pbf)5-pNA6. Реакцию предпочтительно выполняют в течение 24 часов при комнатной температуре, после чего растворитель выпаривают, а полученный раствор вливают в смесь для удаления защиты боковой группы: ТФУК: фенол: вода: TIPS (88:5:5:2, (об/об/об/об)), и перемешивают предпочтительно в течение 3 часов.
g) Готовый продукт получают путем растворения пептида в воде за счет обработки ультразвуком, а затем подвергают лиофилизации.
4. Способ диагностики рака поджелудочной железы основан на следующем процессе: химическое соединение общей формулы 1 в диапазоне концентраций 0.1-10 мг/мл (предпочтительно 1 мг/мл) инкубируют в буфере для измерений при нейтральных или щелочных значениях pH, предпочтительно физиологических, с небольшим количеством мочи человека в диапазоне пропорций от 1:2 до 1:10 (предпочтительно 1:5 образец мочи к буферу для измерений), и измеряют интенсивность поглощения в диапазоне 300-500 нм (предпочтительно 380-430 нм) в течение 40-60 минут при температуре в диапазоне 25-40°C (предпочтительно 36-38°C).
Кроме того, настоящее изобретение относится, в числе прочего, к следующим элементам:
1. Соединение, характеризующееся формулой 1:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (формула 1),
причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала.
2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что последовательность Thr-Thr-Ala-Arg доступна для гидролитического фермента, в частности, гидролитического фермента, расщепляющего указанное соединение на X1-Thr-Thr-Ala-Arg-OH (фрагмент 1) и NH2-X2 (фрагмент 2).
3. Соединение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что X1 содержит или состоит из компонента C1, а X2 содержит или состоит из компонента C2, и обнаружимый сигнал возникает при пространственном разделении C1 и C2.
4. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что один из C1 и С2, в частности, C2, представляет собой хромофор, характеризующийся максимумом поглощения 1 (AM1) при длине волны 1, а соединение характеризуется максимумом поглощения 2 (AM2) при длине волны 2, отличающейся от длины волны 1.
5. Соединение по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции.
6. Соединение по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что пара из C1 и C2 выбрана из группы, состоящей из 2-аминобензойной кислоты (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), в частности, пара из C1 и C2 выбрана из ABZ/pNA и ABZ/ANB-NH2.
7. Способ обнаружения протеазной активности в биологической жидкости субъекта in vitro, включающий приведение биологической жидкости в контакт с соединением по пп. 1-6 и обнаружение сигнала, причем указанная биологическая жидкость может содержать гидролитический фермент, в частности, протеазу, происходящий из клеток рака поджелудочной железы.
8. Способ по п. 7 для обнаружения наличия или отсутствия рака поджелудочной железы у субъекта in vitro, причем присутствие протеазной активности в биологической жидкости указывает на наличие рака поджелудочной железы, а отсутствие протеазной активности в биологической жидкости указывает на отсутствие рака поджелудочной железы.
9. Способ in vitro по п. 7 или 8 для диагностики рака поджелудочной железы.
10. Способ in vitro по любому из пп. 7-9, отличающийся тем, что биологическая жидкость представляет собой мочу.
11. Способ по любому из пп. 7-10, отличающийся тем, что соединение представлено в концентрации 0,1-10 мг/мл, в частности, 0,25-7,5 мг/мл, конкретнее, 0,5-5 мг/мл, более конкретно, 0,75-2 мг/мл, еще более конкретно - приблизительно 1 мг/мл в буфере для измерений с нейтральным или щелочным pH, предпочтительно физиологическим pH, а образец биологической жидкости добавляют к соединению в соотношении от 1:2 до 1:10, в частности, от 1:3 до 1:8, более конкретно, от 1:4 до 1:6, еще более конкретно - приблизительно 1:5.
12. Способ по любому из пп. 7-11, отличающийся тем, что обнаружение сигнала включает измерение поглощения или флуоресценции, в частности, измерение интенсивности поглощения при 300 - 500 нм, более конкретно, 380-430 нм, предпочтительно в течение 40-60 мин при 25-40°C, в частности, при 36-38°C.
13. Набор, содержащий соединение по любому из пп. 1-6 и буфер для измерений.
14. Применение соединения по любому из пп. 1-6, способа по любому из пп. 7-12 или набора по п. 13 для обнаружения рака поджелудочной железы или для мониторинга субъекта с подозрением на рак поджелудочной железы, с повышенным риском развития рака поджелудочной железы или ранее страдавшего от рака поджелудочной железы.
15. Соединение по любому из пп. 1-6 для применения в способе лечения рака поджелудочной железы, причем указанный способ включает этапы:
a. выполнения способа по любому из пп. 7-12, и
b. лечения рака поджелудочной железы у субъекта, у которого на этапе а обнаружена протеазная активность, в частности, повышенная протеазная активность.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> URTESTE Sp. z o.o.
<120> Новый маркер для диагностики рака поджелудочной железы
<130> 1091-2 PCT
<160> 1
<170> Версия PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Thr Thr Ala Arg
1
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПЕПТИДНЫЕ ВЕКТОРЫ | 2004 |
|
RU2361876C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ МЕТАСТИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2006 |
|
RU2430107C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ МЕТАСТИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2007 |
|
RU2454425C2 |
| КОНЪЮГАТЫ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СРЕДСТВ С ПЕПТИДАМИ | 2007 |
|
RU2457218C2 |
| ПРОИЗВОДНОЕ АНАЛОГА GLP-1 ИЛИ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2010 |
|
RU2565536C2 |
| ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЙ ПЕПТИД GLP-1 | 2009 |
|
RU2543157C2 |
| КОНЪЮГАТ, СОДЕРЖАЩИЙ ЛИГАНД РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОТЕНЗИНА, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2743781C2 |
| НОВЫЕ ОКТАПЕПТИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ СОБОЙ ПРОИЗВОДНЫЕ СОМАТОСТАТИНА | 2009 |
|
RU2547940C2 |
| КОНТРАСТНЫЙ АГЕНТ, НАЦЕЛЕННЫЙ НА РЕЦЕПТОР УРОКИНАЗНОГО АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА | 2005 |
|
RU2394837C2 |
| ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ РЕЦЕПТОРА НЕЙРОПЕПТИДА-2-(Y2R) | 2006 |
|
RU2383553C2 |
Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к хромогенному пептиду для применения при диагностике рака поджелудочной железы. Предложено соединение формулы 1: X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2, где X1 содержит или состоит из компонента C1, а X2 содержит или состоит из компонента C2, при этом C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции. Протеолитическое расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала. Также предложены набор для диагностики рака поджелудочной железы, содержащий указанное соединение, способ in vitro обнаружения протеазной активности в биологической жидкости субъекта, которая может содержать протеолитический фермент, происходящий из клеток рака поджелудочной железы, способ лечения рака поджелудочной железы. Изобретения применимы для быстрого и неинвазивного обнаружения рака поджелудочной железы или для мониторинга субъекта с подозрением на рак поджелудочной железы, с повышенным риском развития рака поджелудочной железы или ранее страдавшего от рака поджелудочной железы. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 3 пр.
1. Соединение для диагностики рака поджелудочной железы, характеризующееся формулой 1:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (формула 1),
причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала,
причем X1 содержит или состоит из компонента C1, а X2 содержит или состоит из компонента C2, и обнаружимый сигнал возникает при пространственном разделении C1 и C2 путем протеолитического расщепления соединения, и
при этом C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции.
2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что последовательность Thr-Thr-Ala-Arg доступна для протеолитического фермента, расщепляющего указанное соединение на X1-Thr-Thr-Ala-Arg-OH (фрагмент 1) и NH2-X2 (фрагмент 2).
3. Соединение по любому из пп. 1 или 2, отличающееся тем, что один из C1 и С2, в частности C2, представляет собой хромофор, характеризующийся максимумом поглощения 1 (AM1) при длине волны 1, а соединение характеризуется максимумом поглощения 2 (AM2) при длине волны 2, отличающейся от длины волны 1.
4. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что
пара из C1 и C2 выбрана из группы, состоящей из 2-аминобензойной кислоты (ABZ)/pNA, ABZ/ANB-NH2, ABZ/DNP, ABZ/EDDNP, EDANS/DABCYL, TAM/DANSYL, ABZ/Tyr(3-NO2), в частности пара из C1 и C2 выбрана из ABZ/pNA и ABZ/ANB-NH2.
5. Способ обнаружения протеазной активности в биологической жидкости субъекта in vitro, включающий приведение биологической жидкости в контакт с соединением и обнаружение сигнала, причем указанная биологическая жидкость может содержать протеолитический фермент, происходящий из клеток рака поджелудочной железы, и
причем соединение характеризуется формулой 1:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (формула 1),
причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала,
причем X1 содержит или состоит из компонента С1, а X2 содержит или состоит из компонента С2, и обнаружимый сигнал возникает при пространственном разделении С1 и С2 путем протеолитического расщепления соединения, и
при этом C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции,
где субъектом является субъект с подозрением на рак поджелудочной железы, с повышенным риском развития рака поджелудочной железы или ранее страдавшего от рака поджелудочной железы.
6. Способ in vitro по п. 5 для обнаружения наличия или отсутствия рака поджелудочной железы у субъекта, причем присутствие протеазной активности в биологической жидкости указывает на наличие рака поджелудочной железы, а отсутствие протеазной активности в биологической жидкости указывает на отсутствие рака поджелудочной железы.
7. Способ in vitro по п. 5 или 6 для диагностики рака поджелудочной железы.
8. Способ in vitro по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что биологическая жидкость представляет собой мочу.
9. Способ по любому из пп. 5-8, отличающийся тем, что указанное соединение представлено в концентрации 0,1-10 мг/мл, в частности 0,25-7,5 мг/мл, конкретнее 0,5-5 мг/мл, более конкретно 0,75-2 мг/мл, еще более конкретно - 1 мг/мл в буфере для измерений с нейтральным или щелочным pH, предпочтительно физиологическим pH, а образец биологической жидкости добавляют к соединению в соотношении от 1:2 до 1:10, в частности, от 1:3 до 1:8, более конкретно, от 1:4 до 1:6, еще более конкретно - 1:5.
10. Способ по любому из пп. 5-9, отличающийся тем, что обнаружение сигнала включает измерение поглощения или флуоресценции, в частности измерение интенсивности поглощения при 300-500 нм, более конкретно 380-430 нм, предпочтительно в течение 40-60 мин при 25-40°C, в частности при 36-38°C.
11. Набор для диагностики рака поджелудочной железы, содержащий:
- соединение по любому из пп. 1-4, характеризующееся формулой 1:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (формула 1),
причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала,
причем X1 содержит или состоит из компонента С1, а X2 содержит или состоит из компонента С2, и обнаружимый сигнал возникает при пространственном разделении С1 и С2 путем протеолитического расщепления соединения, и
при этом C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции; и
- буфер для измерений.
12. Применение соединения по любому из пп. 1-4, характеризующегося формулой 1:
X1-Thr-Thr-Ala-Arg-X2 (формула 1),
причем расщепление соединения на фрагмент 1, содержащий X1, и фрагмент 2, содержащий X2, приводит к образованию обнаружимого сигнала,
причем X1 содержит или состоит из компонента С1, а X2 содержит или состоит из компонента С2, и обнаружимый сигнал возникает при пространственном разделении С1 и С2 путем протеолитического расщепления соединения, и
при этом C1 и C2 представляют собой пару из донора флуоресценции и акцептора флуоресценции, способа по любому из пп. 5-10 или набора по п. 11, содержащего указанное соединение и буфер для измерений, для обнаружения рака поджелудочной железы или для мониторинга субъекта с подозрением на рак поджелудочной железы, с повышенным риском развития рака поджелудочной железы или ранее страдавшего от рака поджелудочной железы.
13. Способ лечения рака поджелудочной железы, включающий этапы:
a) выполнения способа по любому из пп. 5-10, и
b) лечения рака поджелудочной железы у субъекта, у которого на этапе а) обнаружена протеазная активность.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что протеазная активность представляет собой повышенную протеазную активность.
| ЗАМЕЩЕННЫЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЛАМИДОМ ТИАЗОЛЫ, ПИРРОЛЫ И ТИОФЕНЫ | 2006 |
|
RU2425829C2 |
| WO 2018005229 A1, 04.01.2018 | |||
| WO 2017152042 A2, 08.09.2017 | |||
| WO 2019075292 A1, 18.04.2019 | |||
| US 2017096699 A1, 06.04.2017 | |||
| RU 2016116773 A, 14.11.2017 | |||
| WO 2014108480 A1, 17.07.2014 | |||
| WO 2011101330 A1, 25.08.2011. | |||
