ГОМОГЕНАТ И ЛИОФИЛИЗАТ ТРУТНЕВЫХ ЛИЧИНОК, ОБЛАДАЮЩИЕ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОЙ И ГЕПАТОЗАЩИТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/64 A61P1/16 A61P3/06 

Изобретение относится к медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к разработке способа получения гомогената и лиофилизата из трутневых личинок, обладающих гиполипидемической и гепатозащитной активностью.

В медицинской практике используется для лечения заболеваний печени, восстановления ее функционирования ЛИВ-52, представляющий собой комплексный препарат из порошков растений (каперсы колючие, цикорий обыкновенный, паслен горный, сенна западная, терминалия аржуна, тысячелистник обыкновенный, тамарикс гальский) [Машковский М.Д. Лекарственные средства, 2000]. Для лечения атеросклероза применяют Липанор (“Ципрофибрат”), который выбран нами в качестве аналога по гиполипидемическому действию.

В качестве прототипа нами принято техническое решение, раскрытое в патенте (RU №2084232 от 20.17,97 г. “Способ получения вещества, обладающего гиполипидемической, антиоксидантной и гепатозащитной активностью, из пчелиного меда”) решающее ту же задачу, что и заявленное.

Следует отметить, что данные препараты обладают побочными действиями (диспепсические явления, аллергические реакции и др.).

В патогенезе заболеваний печени значительную роль играют деструктивные процессы, обусловленные локальным закислением среды, деструкцией клеточных элементов и биополимеров, повреждением мембран клеток печени. В основе патогенеза атеросклероза лежит увеличение содержания холестерина в сыворотке крови и печени, бета-липопротеидов и пребета-липопротеидов в сыворотке.

Целью данного изобретения является использование в качестве средств, обладающих выраженной гиполипидемической и гепатозащитной активностью, гомогената и лиофилизата трутневых личинок.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Отбор личинок проводят перед запечаткой ячеек восковой воздухопроницаемой крышечкой в 7 дневном возрасте. Изъятие личинок из ячеек проводят с помощью шпателя. Полученную массу гомогенизируют с помощью миксера. Для производственных целей данную операцию целесообразно проводить путем прессования сот с личинками. Далее гомогенат фильтруют через капроновое сито (размер отверстий 0,5 мм).

Гомогенат представляет собой однородную жидкую сметанообразную массу, светло-бежевого или желтого цвета, характерного запаха.

Лиофилизацию проводят следующим способом. Нативный гомогенат замораживают в течение 2-3 часов при температуре минус 35-40°С. Затем из замороженного состояния производят сублимацию в вакууме при остаточном давлении 0,1-0,6 мм рт.ст. в течение 40-48 часов, доводя температуру к концу сушки до +25-30°С. Остаточная влажность полученного лиофилизата составляет 1-3%. По внешнему виду лиофилизат представляет собой аморфный порошок желтого цвета, характерного запаха с высокой гигроскопичностью. Ввиду высокой гигроскопичности лиофилизата его следует хранить при температуре +7°С в закупоренном виде. Установлен полный химический состав данных объектов, качественно и количественно определено содержание комплекса биологически активных компонентов: белков, аминокислот, нуклеиновых кислот, стероидных гормонов, ферментов, сахаров, жирных кислот, стеринов, витаминов (А, Д, Е, группы В), микроэлементов и ряда других соединений, обусловливающих высокую фармакологическую активность трутневых личинок.

Исследование гепатозащитного действия полученных субстанций трутневых личинок (гомогената и лиофилизата) проводили на модели острого токсического поражения печени тетрахлорметаном, что является одной из наиболее часто используемых моделей для оценки гепатозащитной активности соединении.

В эксперименте использовали белых крыс-самцов и самок линии Вистар массой 180-200 г, содержащихся на стандартном режиме вивария. В качестве контроля использовали интактных животных и животных с гепатопатией. Токсическую гепатопатию вызывали трехкратным внутрижелудочным зондовым введением через день 50% масляного раствора тетрахлорметана в дозе 0,3 мл на 100 г массы тела. Опытным животным в течение 14 дней внутрижелудочно вводили водные растворы гомогената трутневых личинок (ГТЛ) в дозе 200 мг/кг, или лиофилизата трутневых личинок (ЛТЛ) в дозе 50 мг/кг (что соответствовало сухому остатку дозы ГТЛ) или препарат сравнения ЛИВ-52 в дозе 50 мг/кг (разовые дозы). Модель острого токсического поражения печени вызывали на второй неделе введения исследуемых веществ.

Животных декапитировали на 15 день и в сыворотке крови определяли следующие биохимические показатели функционального состояния печени: активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) по Райтману и Френкелю с использованием стандартного набора фирмы "LACHEMA", активность щелочной фосфотазы (ЩФ) - с помощью набора фирмы "LACHEMA" и ТБК-активные продукты спектрофотометрическим методом с использованием стандартного набора "Агат".

Данные по сравнительному влиянию ГТЛ, ЛТЛ и ЛИВ-52 на показатели функционального состояния печени представлены в таблице 1. Острая токсическая гепатопатия, вызванная введением тетрахлорметана (группа “контроль”), сопровождалась резким увеличением активности ферментов: АЛТ на 208% (Р<0,001), щелочной фосфотазы на 115% (Р<0,001) и повышением содержания ТБК-активных продуктов (ТБКАП) - на 138% (Р<0,001). Прием ГТЛ в дозе 200 мг/кг и ЛТЛ в дозе 50 мг/кг оказал протективный эффект, выразившийся в меньших метаболических сдвигах. Активность АЛТ у групп “ГТЛ+CCI₄” и “ЛТЛ+CCI₄” снизилась по сравнению с контролем на 60% (Р<0,001) и 55% (Р<0,001) соответственно. Активность ЩФ у групп “ГТЛ+CCI₄” и “ЛТЛ+CCI₄” снизилась соответственно на 55% (Р<0,001) и 50% (Р<0,001) по отношению к контрольным показателям. Накопление ТБКАП понизилось у группы “ГТЛ+CCI₄” на 63% (Р<0,001), у группы “ЛТЛ+CCI₄” на 55% (Р<0,001) по отношению к показателям контрольной группы животных. Показатели группы “ЛИВ+CCI₄” изменялись следующим образом: активность АЛТ снизилась на 44% (Р<0,001), ЩФ - на 55% (Р<0,001), накопление ТБКАП на 29% (Р<0,001) по сравнению с контролем.

Таким образом, лечебно-профилактический прием ГТЛ и ЛТЛ у животных с гепатопатией оказывает гепатопротекторный эффект, выражающийся в снижении цитолиза и холестаза [Логинов А.С. и соавт. Новый метод оценки функционального состояния печени в клинике внутренних болезней при диспансеризации некоторых контингентов больных, 1990], снижении пероксидации липидов мембран. Этот эффект сопоставим с действием официнального гепатозащитного препарата ЛИВ-52, а в случае с ГТЛ даже несколько превосходит его.

"Твиновая" гиперхолестеринемия у крыс создавалась внутрибрюшинным введением твина-80 из расчета 250 мг твина-80 на 100 г массы животного в 1 мл воды очищенной. Гиперхолестеринемия развивалась спустя 12 часов после введения твина-80 [Полякова Э.Д., Климова М.А. Пат. физиология и эксперим. терапия, 1973, №1]. На животных с "твиновой" гиперлипидемией исследовалось влияние разных доз препаратов. Для этого животным в течение 7 дней вводили водный раствор гомогената трутневых личинок (ТТЛ) в дозе 50 мг/кг, лиофилизата трутневых личинок (ЛТЛ) в дозе 13 мг/кг (1/4 часть от дозы гомогената) и препарат сравнения “Липанор” в дозе 13 мг/кг (разовые дозы). Контролем служили интактные животные и животные, получавшие физиологический раствор в объеме 1 мл/100 г. На 7-й день опыта внутрибрюшинно животным вводили твин-80 и через 12 часов производили декапитацию, на исследование бралась сыворотка крови и печень. Уровень общего холестерина и триглицеридов определяли с помощью стандартного набора "Лахема".

Определение холестерина в печени проводили после извлечения его диэтиловым эфиром после предварительного щелочного гидролиза [Колмакова В.Н. Вопр. мед. химии, 1957, №6], колориметрическим методом по цветной реакции Либермана-Бурхарда [Строев Е.А., Макарова В.Г. Практикум по биологической химии, 1986].

Определение триглицеридов в печени проводили с помощью стандартного набора "Лахема" после извлечения их аналогично извлечению холестерина [Колмакова В.Н. Вопр. мед. химии, 1957, №6].

Расчет проводили по стандарту, результаты выражали в мкмоль/г.

Опыты показали, что содержание холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и в печени у контрольных животных с "твиновой" гиперлипидемией по сравнению с показателями у интактных животных резко повысилось (таблица 2 и 3). Введение ЛТЛ привело к снижению в сыворотке крови уровня общего холестерина на 32,3% (р<0,001), триглицеридов - на 42,1% (р<0,001). В печени содержание холестерина уменьшилось на 38,1% (р<0,001), а триглицеридов - на 56,9% (р<0,001) по сравнению с контрольной группой. ГТЛ оказывал аналогичный эффект: наблюдалось снижение уровня холестерина в сыворотке крови на 39,6% (р<0,001), в печени - на 94,1% (р<0,001); содержание триглицеридов в сыворотке понизилось на 36,6% (р<0,001), а в печени - на 56,9% (р<0,001).

Отмечено, что содержание холестерина и триглицеридов в опытах с введением лиофилизата трутневых личинок в большинстве случаев восстанавливалось до уровня интактных животных или даже ниже.

Исследования показали, что при введении трутневых личинок и препарата сравнения Липанора в дозах 13 мг/кг получены близкие результаты. При введении Липанора уровень холестерина в сыворотке крови снизился на 59,5% (р<0,001), триглицеридов - на 58,8% (р<0,001), а при введении ЛТЛ холестерин снизился на 54,5% (р<0,001), триглицериды - на 51,4% (р<0,001). Различие в величине показателей оказались статистически недостоверны (р<0,5). Сходный характер изменений наблюдался и в печени.

Гиполипидемические свойства ЛТЛ подтвердились и на “хронической” модели гиперлипидемии, вызванной сочетанным применением холестерина, метилтиоурацила и болевого стресса [Денисенко П.П. и соавт., 2000]. Как следует из таблицы 4, в контрольной группе животных, получавших физиологический раствор, через 1 месяц наблюдалось значительное увеличение содержания холестерина на 84,4% (р<0,001) против исходного, а также изменение содержания пребета- и бета-липопротеидов и триглицеридов. В группе животных, получавших ЛТЛ (13 мг/кг), уровень холестерина оказался ниже по сравнению с контролем на 25,1% (р<0,01), триглицеридов - на 9,2% (р<0,5), пребета- и бета-липопротеидов на 40,0% (р<0,001).

Существенные изменения содержания липидов в сыворотке крови отмечались на втором месяце опыта. В контрольной группе уровень холестерина был выше исходного на 134,1% (р<0,001), триглицеридов - на 11,0% (р<0,05), пребета- и бета-липопротеидов - на 60,0% (р<0,001). Введение ЛТЛ привело к нормализации исследуемых показателей: по сравнению с контролем уровень холестерина снизился на 49,6% (р<0,001), триглицеридов - на 25,5% (р<0,001), пребета- и бета-липопротеидов - на 34,7% (р<0,001), и практически достигло исходного уровня (р<0,5). В печени при введении ЛТЛ содержание холестерина снизилось на 23,3% (р<0,001), триглицеридов - на 17,5% (р<0,001) по сравнению с контрольными опытами.

Следовательно, исследование гиполипидемической активности трутневых личинок в виде гомогената и лиофилизата позволяют заключить, что они оказывают однонаправленный эффект у животных с разными моделями гиперлипидемии, выражающийся в снижении величины холестерина, триглицеридов, пребета- и бета-липопротеидов в сыворотке крови, а также холестерина и триглицеридов в печени.

Этот эффект не уступает действию официнального гиполипидемического препарата Липанора.

Таким образом, гомогенат и лиофилизат трутневых личинок обладают гиполиподемической и гепатозащитной активностью.

Это свидетельствует о целесообразности дальнейших исследовании данного вещества с целью создания эффективных лекарственных препаратов.

Изобретение относится к медицинской и фармацевтической промышленности, а именно к использованию гомогената и лиофилизата из трутневых личинок, может быть использовано в качестве источников получения высокоэффективных лекарственных и лечебно-профилактических средств. Средство, обладающее гиполипидемическим и гепатозащитным действием, представляет собой гомогенат или лиофилизат трутневых личинок и обладает гепатозащитным действием в дозе соответственно 200 мг/кг или 50 мг/кг, а гиполипидемическим в дозе соответственно 50 мг/кг или 13 мг/кг. Технический результат: средство содержит сбалансированный комплекс биологически активных компонентов и обеспечивает выраженный гепатозащитный и гиполипидемический эффект. 4 табл.

Средство, обладающее гиполипидемическим и гепатозащитным действием, отличающееся тем, что оно представляет собой гомогенат или лиофилизат трутневых личинок и обладает гепатозащитным действием в дозе соответственно 200 или 50 мг/кг, а гиполипидемическим - в дозе соответственно 50 или 13 мг/кг.