СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО И ГИПОХОЛЕСТЕРИНЕМИЧЕСКОГО СРЕДСТВА Российский патент 2006 года по МПК A61K36/28 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биологически активных субстанций из амброзии полыннолистной, обладающих гепатопротекторным и гипохолестеринемическим действием, а также решение карантинной проблемы для большинства населения.

Амброзия полыннолистная (Ambrosia artemisiifolia L.), будучи злостным карантинным растением, легко приспосабливается к любым климатическим условиям и в период цветения создает серьезные проблемы для большинства населения, вызывая аллергические заболевания (Адо В.А., Астафьева Н.Г. Поллинозы. - М.: Знание, 1991. - 224 с.).

Растение практически не используется в народном хозяйстве, за исключением получения из цветочной пыльцы антиаллергических препаратов (Изучение антигенных свойств аллергоида из пыльцы амброзии. Б.Н.Райкис, С.А.Угримов, Ф.Л.Махлиновская и др. Бюл. эксперим. биологии и медицины - 1980. - Т.90, №8. - С.197-198).

Изобретение затрагивает серьезную экологическую проблему, поскольку позволяет уничтожать заросли злостного карантинногорастения в период роста до фазы цветения. С другой стороны, изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения из амброзии полыннолистной суммы полифенольных соединений, обладающей гепатопротекторным и гипохолестеринемическим действием.

В медицине широко практикуется применение суммарных полифенольных фитопрепаратов и биологически активных добавок, обладающих указанными видами активности. Так, известен ряд препаратов из расторопши пятнистой: «Легален», «Карсил», «Силибор» (Количественное определение силибина и суммы флаволигнанов в плодах Silibum Marianum (L.). В.А.Куркин, Г.Г.Запесочная, Е.В.Авдеева и др. Раст. ресурсы - 1996. - Т.32, вып.3. - С.80-86), а также комбинированные сухие растительные экстракты: «Сибектан» - сумма содержащая сухой экстракт пижмы, жом плодов расторопши, зверобоя и березы; «Гепатофальк планта» - экстракт расторопши, чистототела большого и турмерика яванского. Из листьев бархата амурского получают «Флакозид»; тыква является сырьем для известных суммарных препаратов «Тыквеол» и «Тыквэйнол» (Регистрлекарственных средств России. РЛС - Энциклопедия лекарств. - 9-е изд. перераб. и доп. Под ред. Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС, 2002. - 1504 с.).

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ получения сухого очищенного экстракта из расторопши пятнистой - силимара (Сокольская Т.А. Комплексная переработка плодов расторопши пятнистой и создание на ее основе препарата "Силимар". Хим.- фармац. журн. - 2000. - Т.34, №9. - С.27-30). Суть этого способа заключается в том, что измельченные плоды трижды при температуре 55-60°С и постоянном перемешивании экстрагируют 80%-ным этиловым спиртом. Время первой экстракции - 3 ч, второй - 2 ч, третьей - 1 ч. Соотношение сырье - экстрагент при первом контакте фаз составляет 1:8, на вторую и на третью экстракции подают экстрагент в количестве слитому. Первый и второй экстракты упаривают в вакууме до 20-25% от первоначального объема (концентрирование), третий экстракт подают на свежее сырье. Водно-спиртовый кубовый остаток (после охлаждения) обрабатывают при перемешивании 2 раза петролейным эфиром, при этом на каждую экстракцию берут растворитель в количестве 20% от объема кубового остатка. Время каждой экстракции составляет 20 мин, отстаивание 30 мин. Очищенный от жирных веществ кубовый остаток выливают при перемешивании в 0,05% раствор соляной кислоты 23:100); реакционную массу перемешивают в течение 15 мин, при этом выделяется осадок - силимар. Силимар отфильтровывают от маточного раствора, после чего промывают водой до нейтральных промывных вод, выветривают под тягой в течение 8-10 ч, а затем сушат в калориферной сушилке при температуре 45-50°С в течение 8-10 ч. Высушенный продукт измельчают и просеивают через капроновое сито.

Данный способ получения суммарного препарата очень трудоемок по затратам времени, сочетается с расходом больших объемов растворителей, а на стадии осаждения силимара требуется использование хлористоводородной кислоты, которая может оказать нежелательное воздействие на гликозиды, а именно инициировать гидролиз фенольных гликозидов.

Целью изобретения является разработка способа получения средства, обладающего гепатопротекторным и гипохолестеринемическим действием из злостного карантинного растения - амброзии полынно-листной (Ambrosia artemisiifolia L.), что позволяет создать новое лечебное средство, а также целенаправленно уничтожать вредное сорное растение до фазы цветения.

Существенным отличительным признаком данного способа является его доступность, дешевизна исходного сырья, а также реализация важнейшей карантинной задачи.

Пример конкретного исполнения. Сырье - надземная часть амброзии полыннолистной собирают в период роста и начала бутонизации (до цветения!). Измельченное сырье исчерпывающе экстрагируют 96%-ным этанолом, при температуре 60°С и постоянном перемешивании (кратность экстракции - 3; соотношение сырье - экстрагент 1:7, 1:5, 1:5; время каждой операции - 1 ч). Извлечения объединяют, фильтруют и упаривают в вакууме до 10-15% от первоначального объема (концентрирование). Водно-спиртовый кубовый остаток выливают при перемешивании в горячую воду (1:10); реакционную массу перемешивают в течение 1 ч, при температуре 80°С, до полного удаления остатков этанола. Водное извлечение после охлаждения фильтруют через мелкопористый бумажный фильтр. Получают очищенное водное извлечение суммы полифенольных соединений, которую делят на две равные порции, одну из них выпаривают досуха и получают - сухую сумму полифенольных соединений (фракция I). Схема выделения полифенольных соединений из амброзии полыннолистной представлена на фиг.1.

Вторую порцию переносят в делительную воронку и последовательно обрабатывают вначале диэтиловым эфиром, затем этилацетатом и н-бутанолом, при этом на каждую экстракцию берут растворитель в количестве 3-5% от объема водного извлечения. Время каждой экстракции составляет 5 мин, кратность 5, отстаивание 5 мин. Растворители - диэтиловый эфир, этилацетат и н-бутанол - упаривают в вакууме до сухого остатка и получают соответственно фракции II, III, IV.

Полифенольные соединения, содержащиеся в полученных фракциях, представлены фенолкарбоновыми кислотами, флавоноидами и кумаринами. В таблице 1 показаны различия качественного состава отдельных фракций.

Что касается количественного состава, в суммарном извлечении (фракция I) содержание флавоноидов максимальное (4,45±0,09%). Фракция II (эфирное извлечение) содержит преимущественно агликоны флавоноидов (1,04±0,05%), фракция IV (бутанольное извлечение) гликозиды (2,52±0,08%), а фракция III (этилацетатное извлечение) те и другие соединения (1,06±0,05%). Результаты представлены в таблице 2.

Из представленных данных видно, что основными веществами суммарных фракций являются кумарины. Фракция II содержит преимущественно агликоны кумаринов (30,47±1,5%), фракция IV гликозиды (20,02±0,88%), а фракция III те и другие (25,08±1,15%).

Присутствует небольшое количество сесквитерпеновых лактонов, из которых доминирующими являются куманин и перувин.

Гепатозащитное и гиполипидемическое действие исследуемых веществ изучено на белых беспородных крысах-самцах массой 220-250 г в 2-х сериях опытов.

Гепатозащитное действие изучено на модели острого токсического поражения печени четыреххлористым углеродом. Суммарные субстанции в дозах 200 мг/кг начинали вводить перорально за 6 дней до начала воспроизведения модели острого поражения печени и затем ежедневно в течение еще 6 дней (всего 12 дней) на фоне воспроизведения CCl₄-поражения печени, 3-кратное через день введение 50% раствора CCl₄ в вазелиновом масле в дозе 0,15 мл/100 г массы тела. Забой животных производили через 24 часа после последнего введения CCl₄. В качестве препарата сравнения использовали официальный гепатопротектор - «Карсил» в терапевтической дозе (100 мг/кг) (Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. - 14-е изд. перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2000. - 2 т.). Одновременно проводили забой интактных животных, голодавших в течение 12-14 час.

Эффективность гепатозащитного действия оценивали по нормализации функциональных и биохимических показателей состояния печени, которые являются наиболее информативными тестами, доказывающими эффективность, испытываемых в качестве гепатопротекторов соединений: активности аланинаминотрансферазы (АлАт), щелочной фосфатазы (ЩФ) и общего билирубина в сыворотке крови, содержанию белка, нуклеиновых кислот (НК), триглицеридов (ТРГ) и ТБК-активных продуктов в гомогенате печени (Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии - Минск: Беларусь, 1982. - 336 с.). Результаты представлены в таблице 3.

Гиполипидемическое действие указанных фракций изучено на модели витаминной гиперлипидемии, вызванной пероральным введением витамина Д₂. в дозе 320000 ЕД совместно с холестерином в дозе 200 мг/кг ежедневно в течение 4 суток. Исследуемые фракции в виде водной суспензии вводили per os в дозах 100 мг/кг за 6 дней до начала введения витамина Д₂ и холестерина, а затем на фоне воспроизведения модели гиперлипидемии. В качестве препарата сравнения использовали «Липанор», который в опытах на животных применяют в дозе 50 мг/кг перорально (Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. - 14-е изд. перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2000. - 2 т.). Забой производили путем декапитации через 24 часа после последнего воздействия. В сыворотке крови определяли содержания общего холестерина по методу Илька и триглицеридов по методу Gottfried S.Р., Rosenberg В. (Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии - Минск: Беларусь, 1982. - 336 с.) и выражали в ммоль/л. Статистическую обработку результатов проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в таблице 4.

Лечебно-профилактическое введение суммарных полифенольных субстанций в дозах 200 мг/кг по исследованным биохимическим показателям оказало защитное действие в условиях интоксикации тетрахлорметаном.

Самыми активными оказались фракции III (этилацетатное извлечение) и IV (бутанольное извлечение), под влиянием которых происходит нормализация всех изученных биохимических показателей сыворотки крови: активности АлАт (показатель цитолиза) и ЩФ (показатель холестаза) понизились соответственно на 57, 51% и 67, 38% (Р_к<0,001), содержание общего билирубина снизилось на 48 и 34% (Р_к<0,001, Р_к<0,05). При этом в гомогенате печени наблюдалось снижение на 12% (Р_к>0,05) и 39% (Р_к<0,001) соответственно содержания ТБК-активных продуктов. Содержание ТРГ снизилось на 47% (Р_к<0,001) и 30% (Р_к<0,05) по сравнению с контролем, а также наблюдалось увеличение содержания белка и нуклеиновых кислот на 32% (Р_к<0,05), 23% (Р_к>0,05) и 61, 43% (Р_к<0,001) соответственно (фиг. 2, 3).

Необходимо отметить, что гепатозащитное действие суммы полифенолов в дозе 200 мг/кг достоверно не отличалось от такового карсила по следующим показателям: содержанию ТБК-активных продуктов, триглицеридов, белка и нуклеиновых кислот в печени.

По ряду других показателей фракции III и IV превышали эффективность действия карсила, а именно: по степени изменения активности АлАт и ЩФ, которая уменьшилась при введении карсила на 31% (Р_к<0,001) и 47% (Р_к<0,005) соответственно. Содержанию билирубина в сыворотке крови, который под действием карсила практически не нормализовался 4% (Р_к>0,1).

При этом нужно отметить, что под влиянием данных фракций наблюдается полная нормализация таких показателей, как АлАт, ЩФ, общего билирубина, ТБК-активных продуктов, белка и нуклеиновых кислот в печени, т.к. они достоверно не отличались от уровня интактных животных (Р_и>0,1).

Эффективность гиполипидемического действия оценивали по нормализации содержания холестерина и триглицеридов в сыворотке крови, которые являются наиболее информативными тестами, доказывающими эффективность соединений, испытываемых в качестве средств нормализующих липидный обмен.

Лечебно-профилактическое введение различных фракций (фиг. 4) в дозах 100 мг/кг оказало гиполипидемическое действие. Наиболее выраженное снижение содержания холестерина и триглицеридов (соответственно на 70% и 53%, Р_к<0,001) в крови наблюдалось под влиянием фракции I. Введение этилацетатной фракции III приводит к снижению холестерина на 52% (Р_к<0,001), а триглицеридов - на 36% (Р_к<0,005). Эфирная фракция II снижает холестерин и триглицериды в крови на 30% (Р_к<0,005) и 21% (Р_к<0,05) соответственно. В то же время активность фракции IV достоверно не отличается от активности фракции I: холестерин и триглицериды крови снизились соответственно на 68% (Р_к<0,001) и 45% (Р_к<0,001). Под влиянием фракций I и IV наблюдается полная нормализация изученных показателей липидного обмена, поскольку они достоверно не отличались от таковых у интактных крыс (Р_и>0,1).

Таким образом, агликоны и гликозиды фенолокислот, кумаринов и флавоноидов, содержащиеся в суммарных полифенольных извлечениях из амброзии полыннолистной, обладают способностью снижать содержание холестерина и триглицеридов крови в условиях гиперлипидемии. При этом гиполипидемическая активность гликозидов in vivo выше, чем агликонов, что, по-видимому, связано с их лучшей растворимостью в воде, следствием чего является их лучшая биодоступность.

Нужно отметить, что гиполипидемическая активность фракции I и IV из амброзии полыннолистной по своей эффективности не уступает действию эталонного препарата «Липанора».

Таблица 1
Химический состав суммарных полифенольных фракциий из амброзии полыннолистнойБиологически активная фракцияКласс соединенийОксикоричные кислотыКумариныФлавоноидыФракция IСодержит фракции II, III, IVФракция IIферуловая◆
изоферуловая◆
кофейная*
хлорогеновая*эскулетин*◆
скополетин*◆
умбеллиферон*◆яцеидин*◆ (5,7,4'-тригидрокси-3,6,3'-триметоксифлавон)кверцетинФракция IIIферуловая◆
изоферуловая◆
кофейная*
хлорогеновая*эскулетин*◆
эскулин*◆
скополетин*◆
скополин*◆
умбеллиферон*◆
скиммин*◆изорамнетин*
кверцетин*Фракция IVхлорогеновая глюкозид кофейной*эскулин*◆
скополин*◆
скиммин*◆изорамнетина-3-рутинозид*◆, кверцимеритрин*◆, изокверцитрин*, гликозиды ксантомикрола*◆ (4',5-дигидрокси-6,7,8-триметоксифлавон) и 4',5-дигидрокси-3,6,7,8-тетраметоксифлавона*◆* - преобладающие соединения;
◆ - идентифицированы для амброзии полыннолистной впервые

Таблица 2
Содержание основных биологически активных соединений в суммарных полифенольных фракциях амброзии полыннолистнойБиологически активная фракцияСесквитерпеновые лактоны, %Флавоноиды, %Кумарины, %Фракция I2,45±0,05; ε=2,10%4,45±0,09; ε=2,06%16,03±0,50; ε=3,16%Фракция II-1,04±0,05; ε=4.96%30,47±1,50; ε=4,91%Фракция III1,01±0,05; ε=4,61%1,06±0,05; ε=4,80%25,08±1,15; ε=4,59%Фракция IV1,51+0,06; ε=4,0%2,52±0,08; ε=3,07%20,02±0,88; ε=4,42%

Таблица 4
Гиполипидемическое влияние извлечений из амброзии у крыс с гиперлипидемией, вызванной введением витамина Д₂ совместно с холестериномПоказателиИнтактные, n=4Контрольные, n=5Фракция I, 100 мг/кг, n=5Фракция II, 100 мг/кг, n=5Фракция III, 100 мг/кг, n=5Фракция IV, 100 мг/кг, n=5Липанор, 50 мг/кг, n=4Холестерин, ммоль/л1,71±0,0886,57±0,363
Р_и<0,001
+284%2,05±0,220
Р_к<0,001
-69%
Р_и>0,14,62±0,256
Р_к<0,005
-30% Р_и<0,0013,16±0,281
Р_к<0,001
-52% Р_и<0,0052,08±0,306
Р_к<0,001
-68%
Р_и>0,11,96±0,079
Р_к<0,001
-70%
Р_и>0,1ТРГ сыв. ммоль/л0,747±0,0891,768±0,093
Р_и<0,001
+136,7%0,830±0,092
Р_к<0,001
-53%
Р_и>0,11,388±0,091
Р_к<0,05
-36%
Р_и<0,0051,127±0,105 Рк<0,005 -37% Ри<0,050,975±0,133
Р_к<0,005
-45%
Р_и>0,10,905±0,207
Р_к<0,001
-49%
Р_и>0,1

Таблица 3
Гепатозащитное действие суммарных фракциий из амброзии полыннолистнойПоказателиИнтактные, n=4Контроль, n=5Фракция I, 200 мг/кг, n=5Фракция II, 200 мг/кг, n=5Фракция III, 200 мг/кг, n=5Фракция IV, 200 мг/кг, n=5Карсил, 100 мг/кг, n=7АлАт, мккат/л0,70±0,0461,85+0,053
Р_и<0,001
+164%1,27±0,11
Р_к<0,005,
-31%
Р_и<0,0051,37±0,105
Р_к<0,05,
-26%
Р_и<0,010,80±0,046
Р_к<0,001,
-57%
Р_и>0,10,91±0,044
Р_к<0,001,
-51%
Р_и<0,051,27±0,046
Р_к<0,001,
-31%
Р_и<0,001Общий билирубин, мкмоль/л8,39±1,0220,61±0,93
Р_и<0,001
+146%20,42±1,34
Р_к>0,1
Р_и<0,00118,54±1,06
Р_к>0,1
Р_и<0,00110,63±1,21
Р_к<0,001,
-48%
Р_и>0,113,65±1,78
Р_к<0,05,
-34%
Р_и>0,0519,78±1,99
Р_к>0,1
Р_и<0,01ТРГ печени мкмоль/г24,48±1,6779,76±4,04
Р_и<0,001
+226%78,54±4,52
Р_к>0,1
Р_и<0,00161,20±6,97
Р_к>0,05
Р_и<0,00542,54±2,92
Р_к<0,001,
-47%
Р_и<0,0155,59±3,67
Р_к<0,005,
-30%
Р_и<0,00149,83±4,36
Р_к<0,001,
-38%
Р_и<0,01ЩФ, Ед/л176,88±14,481433,74±49,945
Р_и<0,001
+145%254,86±36,045
Р_к<0,05,
-41%
Р_и>0,05425,01±5,019
Р_к>0,1
Р_и<0,001159,90±19,293
Р_к<0,001,
-63%
Р_и>0,1267,51±45,018
Р_к<0,05,
-38%
Р_и>0,05229,39±11,526
Р_к<0,005,
-47%
Р_и>0,05Белок, мг/мл25,5±1,4418,3±0,81
Р_и<0,01
-28%20,9±1,60
Р_к>0,05
Р_и>0,119,2±0,71
Р_к>0,1
Р_и<0,0124,1±1,54
Р_к<0,05,
+32%
Р_и>0,122,5±1,75
Р_к>0,05
+23%
Р_и>0,125,0±1,32
Р_к<0,005,
+37%
Р_и>0,1НК, мг/г47,75±0,54332,45±1,341
Р_и<0,001
-32%42,38±0,834
Р_к<0,001,
+31%
Р_и<0,00534,65±1,495
Р_к>0,1
Р_и<0,0552,34±1,845
Р_к<0,001,
+61%
Р_и>0,146,45±0,946
Р_к<0,001,
+43%
Р_и>0,145,25±1,148
Р_к<0,001,
+39%
Р_и>0,1ТБК-печени,
нмоль/мг белка0,1875±0,00710,3227±0,0117
Р_и<0,001
+72%0,2949±0,0134
Р_к>0,1
Р_и<0,0010,3173±0,0055
Р_к>0,1
Р_и<0,0010,2840±0,0156
Р_к>0,05,
-12%
Р_и<0,0050,1980±0,0169
Р_к<0,001,
+39%
Р_и>0,10,1867±0,0145
Р_к<0,001,
+42%
Р_и>0,1

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения гепатопротекторного и гипохолестеринемического средства. Способ получения гепатопротекторного и гипохолестеринемического средства, характеризующийся тем, что в качестве исходного сырья используют амброзию полынолистную, собранную в фазу развития до цветения, сырье измельчают и экстрагируют трижды этанолом при определенных условиях, извлечения объединяют, фильтруют и упаривают в вакууме, водно-спиртовой кубовый остаток смешивают с горячей водой и нагревают до полного удаления этанола, затем очищают от липофильных соединений, полученное очищенное водное извлечение суммы полифенольных соединений делят на две равные порции, одну выпаривают досуха и получают сухую сумму полифенольных соединений - фракцию 1, вторую порцию последовательно обрабатывают растворителями, сначало эфиром с выделением фракции 2, затем обрабатывают этилацетатом с выделением фракции 3, затем обрабатывают бутанолом с выделением фракции 4, на каждую экстракцию берут растворители в определенном количестве от объема водного извлечения, время каждой экстракции составляет 5 минут, кратность 5, отстаивание 5 минут, затем растворители удаляют в вакууме до сухого остатка. Способ позволяет получить средство из амброзии полынолистной, обладающее эффективным гепатопротекторным и гипохолестеринемическим действием. 4 ил., 4 табл.

Способ получения гепатопротекторного и гипохолестеринемического средства, характеризующийся тем, что в качестве исходного сырья используют амброзию полынолистную, собранную в фазу развития до цветения, сырье измельчают и экстрагируют трижды 96% этанолом при температуре 60°С при постоянном перемешивании и соотношении сырье-экстрагент 1:7, 1:5, 1:5 соответственно в течение 1 ч при каждом экстрагировании, извлечения объединяют, фильтруют и упаривают в вакууме до 10-15% от первоначального объема, водно-спиртовой кубовый остаток смешивают с горячей водой и нагревают до полного удаления этанола, затем очищают от липофильных соединений, полученное очищенное водное извлечение суммы полифенольных соединений делят на две равные порции, одну выпаривают досуха и получают сухую сумму полифенольных соединений - фракцию 1, вторую порцию последовательно обрабатывают растворителями, сначала эфиром с выделением фракции 2, затем обрабатывают этилацетатом с выделением фракции 3, затем обрабатывают бутанолом с выделением фракции 4, на каждую экстракцию берут растворители в количестве 3-5% от объема водного извлечения, время каждой экстракции составляет 5 мин, кратность 5, отстаивание 5 мин, затем растворители удаляют в вакууме до сухого остатка.