СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ Z-И Е-ИЗОМЕРОВ АДЖОЕНА В СООТНОШЕНИИ 2:1. Российский патент 2004 года по МПК C07C323/65 C07C319/28 

Изобретение относится к способу получения и выделения изомеров аджоена.

Данные соединения обладают широким спектром биологической активности и представляют большой интерес в качестве основы для медицинских препаратов различного действия.

Впервые эти соединения были выделены из экстракта чеснока (Alieum Sativum) в 1986 году Block et al. [Block E., Ahmad S., Catalfamo J.L., Jain М.К., Apitz-Castro, R. (1986). Antitrombotic organosulfur compounds fiom garlic: structural, mechanistic, and synthetic studies. J. Am. Chem. 108, 7045-55.]. Авторы показали, что Е-(I) и Z-(II) аджоены образуются как продукты превращения содержащегося в измельченном чесноке аллицина (диаллилтиосульфинат). В этой же работе было показано, что изомеры аджоена являются ответственными за антитромботическое действие экстрактов чеснока.

За период, прошедший с момента выделения аджоена, были проведены многочисленные исследования его биологической активности. Эти исследования подтвердили антитромботическое действие аджоена. и позволили установить некоторые механизмы этого действия. Например, аджоен препятствует агрегации тромбоцитов, стимулированных арахидонатом, мертиолятом, адреналином, АДФ и кальциевым ионофором [Apitz-Castro R., Badimon J.J., Badimon L. Effect of ajoene, the major antiplatelet compound from garlic, on platelet thrombus formation. Thromb. Res. (1992). 68, 145-55, Apitz-Castro R., Jain M.K., Bartoli F., Ledezma E., Ruiz M.C., Salas R. Evidence for direct coupling of primary agonist-receptor interaction to the exposure of functional lib-IIIa complexes in human blood platelets. Results from studies with the antiplatelet compound ajoene. Biochem. Biophys. Acta. (1991). 1094, 269-80]. Характер ингибирования тромботической активности является необратимым. Кроме того, изомеры аджоена способны ингибировать 5-липоксигеназу и биосинтез простагландинов [Wagner H., Wierer M., Fessler В. Effects of garlic constituents on arachidonate metabolism. Planta Medica. (1987). 53, 305-6]. Биосинтез лейкотриенов также угнетается аджоеном [Belman S., Solomon J., Segal A., Block E., Barany G. Inhibition of soybean lypoxygenase and mouse skin tumor promotion by onion and garlic components. J. Biochem. Toxicol. 1989, 4, 151-60].

Также установлено, что аджоен обладает антибактериальным [Naganawa R., Iwata N., Ishikawa К., Fukuda H., Fujino Т., Suzuki A. Inhibition of vicrobial growth by ajoene, a sulfur-containing compound derived from garlic. Applied and Environmental Microbiology. (1996). 62, 4238-42.] и фунгицидным [San-Blas G., Urbina J.A., Marchan E., Contreras L.M., Sorais F., San-Bias F. Inhibition of Paracoccides brasiliensis by ajoene is associated with blockade of phosphatidylcholine biosynthesis. Microbiology. (1997). 143, 1583-6, Ledezma E., Lopez J.C., Marin P., Romero H., Ferrara G., De Sousa L., Jorquera A., Apitz Castro. Ajoene in the topical short-term treatment of tinea cruris and tinea corporis in humans. Randomized comparative study with terbinafine. Arzneimittelforschung. (1999). 49, 544-7] действием.

Аджоен способен оказывать противоопухолевое действие. Например, он обладает прямой цитотоксичностью, при этом в опытах in vitro было показано, что чувствительность к аджоену туморогенных клеточных линий значительно выше, чем у нетуморогенных линий [Scharfenberg К., Wagner R., Wagner К.G. The cytotoxic effect of ajoene, a natural product from garlic, investigated with different cell lines. Cancer Lett. (1990), 53, 103-8]. Кроме прямого цитотоксического действия аджоен способен вызывать апоптоз лейкемических клеток крови, не оказывая при этом действия на клетки крови здоровых доноров [Dirch V.M., Gerbes A.L., Vallmar A.M. Ajoene, a compound of garlic, induces apoptosis in human promyeloleukemic cells, accompanied by generation of reactive oxygen species and activation nuclear factor кВ. Mol. Pharmacol. (1998). 53, 402-7]. Наряду с непосредственным воздействием на опухолевые клетки изомеры аджоена способны влиять на иммунные реакции организма, влияя на мембранно-зависимые свойства иммунных клеток [Romano E.L., Montano R.F., Brito В., Apitz R., Alonso J., Romano M., Gebran S., Soyano A. Effects of ajoene on lymphocyte and macrophage membrane-dependent functions. Immunopharmacol. Immwiotoxicol. (1997). 19,15-36].

Изучено антимутагенное действие аджоена. С помощью теста Эймса показано, что аджоен способен ингибировать химически индуцированный мутагенез, вызываемый такими агентами, как бензо[а]пирен и 4-нитро-1,2-фенилендиамин [Ishikawa К., Naganawa R., Yoshida H., Iwata N., Fukuda H., Fujino Т., Suzuki A. (1996). Antimutagenic effects of ajoene, an organosulfur compound derived from garlic. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 2086-8]. Известно также, что аджоен препятствует связыванию метаболитов афлотоксина В1 (потенциального гепатоканцерогена) с клеточной ДНК [Tadi P.P., Lau B.H., Teel R.W., Herrmann C.E. Binding of the aflatoxin Bl to DNA inhibited by ajoene and diallyl sulfide. Anticancer Res. (1991). 11,2037-41].

Известно, что некоторые компоненты чесночных экстрактов обладают антивирусной активностью. Однако наиболее сильное противовирусное действие проявляет аджоен [Weber N.D., Andersen D.O., North J.A., Murray B.K., Lawson L.D., Hughes B.G. In vitro virucidal effects of Allium sativum (garlic) extract and compounds. Planta Medica (1992). 58, 417-23]. Показано, что данное соединение подавляет размножение вирусов иммунодефицита человека и обезьяны, причем ингибирующие действие аджоена на лизис ВИЧ-инфицированных клеток наблюдается не только на стадиях адсорбции и пенетрации, но и на более поздних этапах вирусного цикла [Walder R., Kalvathev Z., Apitz-Castro R. Selective in vitro protection of SIV agm-induced cytolysis by ajoene, [(e)-(z)-4,5,9-trithiadodeca-l,6,ll-triene-9 oxide]. Biomed. Pharmacother. (1998). 52, 229-35].

Большинство исследований по биологической активности было проведено на неразделенной смеси Е- и Z-изомеров аджоена. Это связано с тем, что препаративное разделение этих изомеров является сложным и трудоемким. Существует только очень небольшое количество работ, проведенных на разделенных изомерах. Так, в работе [Block Е., Ahmad S., Catalfamo J.L., Jain M.K., Apitz-Castro, R. Antitrombotic organosulfur compounds from garlic: structural, mechanistic, and synthetic studies. J. Am. Chem. (1986). 108, 7045-55] определена антитромботическая активность каждого изомера. В работе [Ledezma Е., Jorquera A., Bendezu H., Vivas J., Perez G. Antiproliferative and Leshmanicidal effect of ajoene on various Leishmania species: ultrastructural study. Parasitol. Res. (2002 Aug)., 88(8), 748-53] изучено влияние как Е-, так и Z-изомера на различные разновидности Leishmania mexicano. Авторами [Li M, Cm JR, Ye Y, Min JM, Zhang LH, Wang K, Gares M, Cros J, Wright M, Leung-Tack J. Antitumor activity of Z-ajoene, a natural compound purified from garlic: antimitotic and microtubule-interaction properties. Carcinogenesis, 2002 Apr, 23(4), 573-9] определена противоопухолевая активность Z-изомера.

Несмотря на многочисленные исследования по биологической активности аджоена в патентной и научной литературе описано немного способов получения этих веществ. Условно все предлагаемые методы получения аджоена можно разделить на выделение из чеснока и химический синтез.

Выделение аджоена из чеснока является достаточно сложной и трудоемкой процедурой, требующей большого количества растворителей. Так, в работе [Block E., Ahmad S., Catalfamo J.L., Jain M.K,, Apitz-Castro, R. Antitrombotic organosulfur compounds from garlic: structural, mechanistic, and synthetic studies. J. Am. Chem. (1986). 108, 7045-55] предложен метод выделения фракции чесночного экстракта, обогащенной аджоеном, с помощью многократной замены растворителя. Окончательное выделение изомеров аджоена проводилось методом препаративной ВЭЖХ. В европейском патенте [Европейский патент ЕР №0702002 В1 (May 13, 1998)] предложен способ выделения аджоена из чеснока с использованием в качестве экстрагента растительного масла. Этот метод позволяет получить смесь изомеров в растительном масле с соотношением Z/E-4. Использование масла хотя и обеспечивает практически полное выделение аджоена из чеснока, но сильно затрудняет последующее разделение Z- и Е-изомеров. В общем, можно сказать, что применение этих методов ограничено очень низким содержанием аджоена в чесноке (0,03-0,04% от веса свежего чеснока).

Во всех известных методах синтеза в качестве исходного вещества для получения аджоена использовался аллицин (диаллилтиосульфинат). В европейском патенте [Европейский патент ЕР №0721940 А1 (Jan 11, 1996)] предложен способ получения изомеров аджоена с помощью образования комплекса между аллицином и α- или β-циклодекстрином. Данный метод позволяет получать 30% аджоена по отношению к исходному аллицину с соотношением Е- и Z-изомеров 2/1. Недостатком этого метода является использование большого количества органических растворителей и воды (3 л воды и 1,5 л диэтилового эфира на 150 мг аджоена).

Наиболее близкий к предлагаемому способ получения аджоена предложен в патенте [патент США №4643994 (Feb 17, 1987) ]. В этом методе аджоен получали из неочищенного аллицина в растворе в смеси ацетон/вода (60:40) при температуре 45-46°С в течение 32 часов с последующей экстракцией хлористым метиленом. Данный способ позволяет получать 41% аджоена по отношению к исходному аллицину. Соотношение Е- и Z-изомеров составляло 9/1. Недостатком метода является низкое количество Z-изомера, что сильно затрудняет его выделение.

В данной заявке на изобретение предлагается способ получения смеси изомеров аджоена из синтетически полученного неочищенного аллицина в н-бутаноле.

Синтез исходного аллицина проводится по описанной методике [патент США №4643994 (Feb 17, 1987)] окислением диаллилдисульфида перекисью водорода в уксусной кислоте с последующей экстракцией хлористым метиленом. Полученный аллицин упаривался досуха и растворялся в н-бутаноле. Никакой дополнительной очистки аллицина не проводилось.

Реакция проводится при комнатной температуре в 0,5%-ном растворе аллицина в н-бутаноле в течение 6 суток. Количественный анализ реакционной смеси осуществлялся методом ВЭЖХ на силикагеле. Условия анализа были следующими: колонка ULTRASIL 10×250 mm, элюент гексан/изопропанол 95/5, УФ-детектор с длиной волны 254 нм, скорость элюирования 4,5 мл/мин. В результате проведенного анализа установлено, что на протяжении первых шести суток наблюдается увеличение количества аджоена. Анализ, проведенный после семи и восьми суток, показал, что количество аджоена в смеси практически не изменилось. После девяти суток наблюдалось небольшое снижение концентрации аджоена, что свидетельствует о начале его разложения.

Общий выход аджоена в процентах от массы исходного аллицина составляет 30%, при этом соотношение Е- и Z-изомеров в смеси 1/2. Динамика образования Z-изомера приведена в таблице.

Окончательное выделение из реакционной смеси Z-изомера и Е-изомера аджоена осуществляется с помощью препаративной ВЭЖХ на силикагеле. Условия разделения следующие: колонка ULTRASIL 10х250 мм, элюент гексан/изопропанол 95/5, УФ-детектор с длиной волны 254 нм, скорость элюирования 4,5 мл/мин, количество вводимой пробы 50 мкл.

Структура полученных Z-аджоена и Е-аджоена была подтверждена методом ЯМР-спектроскопии.

Z-аджоен

ЯМР’Н(СВСl₃, δ); 6,45(д, 1H; J=9,4 Гц); 5,96-5,7 (м, 3Н); 5,46-5,38(м, 2Н); 5,20-5,14(м, 2Н); 3,67-3,47(м,3Н); 3,43-3,35(м,3Н)

ЯМР¹³С(CDCl₃, δ); 138,52; 132,50; 125,57; 123,79; 119,23; 117,91; 54,83; 49,49; 42,02.

Е-аджоен

ЯМР’Н(СDСl₃, δ); 6,35(дт, 1Н; J=14,71 Гц, 1,1 Гц); 5,95-5,76 (м, 3Н); 5,48-5,36(м, 2Н); 5,21-5,15(м, 2Н); 3,56-3,38(м,4Н) 3,37 (д, 2Н; J=7,39 Гц)

ЯМР¹³C(СDСl₃, δ); 135,0; 132,7; 125,6; 124,0; 119,4; 116,6; 54,4; 53,3; 41,6.

Пример

300 мг синтетического аллицина растворялось в 50 мл н-бутанола и выдерживалась, в течение 6 суток при температуре 21-23°С. Затем полученная реакционная масса концентрировалась под вакуумом на роторном испарителе до объема ≈1 мл. Далее осуществлялось разделение изомеров методом препаративной ВЭЖХ. Условия разделения: жидкостной хроматограф SESIL Adept System 2, колонка ULTRASIL 10×250 мм, элюент гексан/изопропанол 95/5, УФ-детектор с длиной волны 254 нм, скорость элюирования 4,5 мл/мин, количество вводимой пробы 50 мкл. Соответствующая хроматограмма приведена на чертеже.

Полученные таким образом растворы Е- и Z-изомеров аджоена в элюенте упаривались досуха под вакуумом на роторном испарителе при комнатной температуре. Было выделено 67 мг Z-аджоена и 33 мг Е-аджоена.

Изобретение относится к способу получения смеси Z- и Е-изомеров аджоена в соотношении 2:1, заключающемуся в том, что раствор синтетического аллицина в н-бутаноле выдерживают в течение 6 суток при температуре 21-23°С с последующим в случае необходимости разделением изомеров методом препаративной ВЭЖХ. 1 ил., 1 табл.

Способ получения смеси Z- и Е-изомеров аджоена в соотношении 2:1, отличающийся тем, что раствор синтетического аллицина в н-бутаноле выдерживают в течение 6 суток при температуре 21-23°С с последующим в случае необходимости разделением изомеров методом препаративной ВЭЖХ.