АДАПТОГЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2004 года по МПК A61K31/56 A61P39/00 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунофармакологии и фармацеи. Более конкретно, оно относится к изысканиям новых средств защиты и лечения заболеваний, связанных с нарушением активности иммунной системы человека.

Уровень техники

Изобретение основано на обнаружении авторами не известного ранее вида биологической активности у известного и достаточно широко изученного вещества, именуемого бетулином.

Бетулин является одним из первых природных веществ, которое впервые было выделено из растительного сырья еще в 1778 году. В 1876 году У.Хаусманн опубликовал результаты элементарных анализов бетулина (Hausmann U., Annalen der chemie, 182, стр. 365).

Основным источником природного бетулина является береза. Белая часть березовой коры у отдельных видов березы (Betula verrucosa, Betula papyfera) содержит до 30 % и более бетулина (Hayek, E.W. et al. (1989) A Bicentennial of Betulin, Phytochemistry, 28(9) стр. 2229-2242).

Бетулин является пентациклическим тритерленом с углеродным скелетом ряда лупана, который также называют бетулинолом, трохотоном, березовой камфарой и (корили-)резинолом. Характерной особенностью ряда лупана является кольцо с пятью атомами углерода в составе пентациклической системы, которое в положении С-19 имеет α-изопентениловую группу. Бетулин отличается высокой термостабильностью, его температура плавления находится между 250 и 261°С, причем после сублимации рекристаллизованного продукта достигаются еще более высокие значения. Его молекулярный вес составляет 442,7, он растворим в пиридине и тетрагидрофуране, но мало растворим в дихлорметане, хлороформе и холодных органических растворителях, причем с повышением температуры его растворимость значительно возрастает. В воде и холодном петролейном эфире бетулин практически не растворим. Кроме того, кинетические исследования показали очень низкую реакционную способность гидроксильных групп бетулина.

Еще в 1899 году Дж. Уилер показал антисептические свойства бетулина и поэтому он использовался для стерилизации перевязочных бинтов и пластырей (Wheeler J., (1899), Pharm. J., Die Darstellung des Betulin durch Sublimation, 494, Ref. Chem. Centr. 1900 I, стр. 353). В натуропатии и народной медицине получали и получают до сих пор отвары березовой коры, которые применяют для лечения малярии, водянки, подагры и при кожных заболеваниях, а также в виде настойки для компрессов при лечении абсцессов.

Последнее время ведутся интенсивные исследования возможного лечебного действия бетулина и его производных. В эксперименте с животными бетулиновая кислота ингибировала репликацию ретровирусов, в частности вируса иммунодефицита человека (ВИЧ1). Описанное бактериостатическое и бактерицидное действие бетулина против кишечных бактерий Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri и Staphylococcus aureus позволяют говорить о возможности его более широкого применения в медицине (Chen Sun, J.Med. et. al., (1998), Anti-Aids Agents, 32, Synthesis and anti-HIV activity of Betulin derivates, Bioorganic & Medical Chemistry Letters 8, стр. 1267-1272; Evers, M. et. al., (1996), Betulinic acid derivates: a new class of human immunodeficiency virus type 1 specific inhibitors with a new mode of action, J. Med. Chem. 39, стр. 1056-1058). Удалось установить противовоспалительное кортизоноподобное действие бетулина и его производных, а также их цитостатическое действие при использовании различных линий раковых клеток in vitro (Carmen Recio, M., et. al. (1995), Investigations on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas, Planta Med. 61, стр. 9-12; Yasukawa, К., et. al., (1991), Sterol and triterpene derivates from plants, Oncogene 48, стр. 62-76).

Большое числе исследований посвящено гепатопротекторной активности бетулина. Было обнаружено, что бетулин вызывает снижение активности аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, содержание малонового диальдегида в сыворотке крови, предупреждает воспалительный процесс в печени (Ю.К. Василенко и др. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы. - Экспериментальная и клиническая фармакология, 1993, т. 54 №4 стр. 53-55).

Гепатопротекторная активность целого ряда производных бетулина была подтверждена на моделях экспериментального гепатита, вызванного CCL₄, тетрациклином и ацетоном (О.В.Флехтер и др. Синтез тритерпеноидов ряда лупана и их гепатопротекторная активность. - Биоорганическая химия, 2000, 26(3), стр. 215-230).

Гепатопротекторная активность бетулина лежит и в основе изобретения "Способ профилактики и лечения алкогольной интоксикации" (Патент РФ №2183965).

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является изыскание новых возможностей использования бетулина в медицине.

Авторами изобретения экспериментально было установлено, что бетулин обладает иммуномодулирующими и адаптогенными свойствами, что определяет возможность применения бетулина в качестве адаптогенного средства.

Известен ряд адаптогенов растительного происхождения (женьшень, элеутерококк, эхинацел и др.).

Однако задача изыскания новых адаптогенов продолжает оставаться актуальной, в частности по причине достаточно локального распространения перечисленных представителей растительного мира.

Раскрытие изобретения.

Исследование биологической активности иммуномодулирующей направленности бетулина проводилось на следующих образцах.

Образец А: Экстракт бересты сухой, сублимированный, с содержанием бетулина (бетулин-Lup-20(29))-ene-3-бета 28-diol (С₃₀Н₅₀O₂) бетуленол, бетулинол, трохол, бетулол), определенным методом ВЭЖХ, - 84,7%.

Образец В: Экстракт бересты сухой, с содержанием бетулина (бетулин-Lup-20(29)-еnе-3-бета 28-diol (С₃₀Н₅₀О₂) бетуленол, бетулинол, трохол, бетулол), - 78,1%.

Образец С: Экстракт бересты сухой, с содержанием бетулина (бетулин-Lup-20(29))-ene-3-бета 28-diol (С₃₀Н₅₀O₂) бетуленол, бетулинол трохол, бетулол), - 72,0%.

Для выявленения потенциальной иммуномодулирующей активности бетулина был применен специфический НАДФН-оксидазный тест in vitro, созданный во Всероссийском институте лекарственных растений ВИЛАР (г. Москва) и раскрытый в патенте РФ №2904077. Согласно этому тесту иммуномодуляторы обладают свойством активизировать НАДФН-оксидазу in vitro. НАДФН-оксидаза является внутриклеточным ферментом лейкоцитов и макрофагов, катализирующим начальную стадию респираторного взрыва. Известно, что НАДФН-оксидаза в неактивированных, "спокойных" лейкоцитах неактивна и скорость НАДФН-оксидазной реакции в этих условиях равна нулю. В экспериментах с бетулином в качестве источника НАДФН-оксидазы были использованы перитонеальные макрофаги крысы, из которых готовили гомогенат. Субстратом реакции служил НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) фирмы "Sigma" США. Образцы бетулина, в концентрации 1 мг/мл, растворяли в 1%-ном Тритоне × 100 (фирмы Fluka). Скорость реакции определяли по убыли поглощения при 340 нм за счет окисления НАДФН. Измерения проводили в двухлучевом режиме, при автоматическом вычитании поглощения в кювете сравнения. В кювету сравнения добавляли 1%-ный тритон в объеме, равном объему добавленного в кювету измерения раствора бетулина в 1%-ном тритоне. Полученные результаты приведены в табл.1.

Влияние образцов Бетулина на скорость НАДФН оксидазной реакции in vitro

Из таблицы видно, что все три образца бетулина оказывают на НАДФН-оксидазу активирующее влияние in vitro. Величина эффекта зависит от концентрации Бетулина в пробе. Для Бетулина В зависимость эффекта от концентрации бетулина описывается кривой с максимумом. Для Бетулина А и Бетулина С с увеличением концентрации препарата в пробе наблюдается ингибирующий эффект. Бетулин А и Бетулин С обладают более выраженным сродством к ферменту, чем Бетулин В, и проявляют активирующий эффект по отношению к НАДФН-оксидазе при более низких концентрациях в пробе. Согласно патенту №2904077 свойство активизировать на НАДФН-оксидазы in vitro является специфическим свойством иммуномодуляторов. Таким образом, с помощью НАДФН-оксидазного теста in vitro установлено, что образцы Бетулина А,Б,С, проявляют явно выраженную биологическую активность иммуномодулирующей направленности.

Обнаружение у бетулина иммуномодулирующей активности позволило высказать предположение о возможности его применения в качестве адаптогенного средства. Это предположение подтвердилось в ходе дальнейших исследований влияния бетулина на такие ферменты, как каталаза (КАТ), глутатионредуктаза (ГР) и глутатионпероксидаза (ГП).

Ключевым в этом исследовании было влияние бетулина на скорость ГР-реакции в связи с известностью того факта, что адаптогены увеличивают скорость именно этой реакции. Образцы бетулина А, В, С, использованные в опытах, соответствовали таковым в приведенных выше опытах с НАДФН-оксидазой.

В работе использовали коммерческие препараты ферментов - ГР, ГП и КАТ, субстраты - глутатион окисленный и глутатионвосстановленный, р-никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный (р-НАДФН) фирмы "Sigma". Концентрация ферментов в инкубационной пробе составляла 0,3-0,5 мкг/мл. Исследуемые вещества растворяли в дистиллированной воде в присутствии 1% твина-80 и добавляли в пробу в концентрации 1, 10, 50, и 100 мкг/мл.

Для определения скорости ферментативных реакций использовали известные методы. Скорость ГР и ГП реакций определяли в кварцевых кюветах на двулучевом спектрофотометре Shimalzu MPS-2000 с непрерывной автоматической регистрацией убыли НАДФН при длине волны 340 нм. Об активности каталазы судили по убыли субстрата - гидроперекиси, которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при 410 нм. Скорость ферментативных реакций измеряли без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). В табл.2 приводятся средние арифметические значения из 2-х (для ГР и ГП) и 4-х (для КАТ) параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (М±т).

Результаты исследования показывают, что для всех изученных образцов характерно а) их влияние на активность ферментов и б) зависимость этого влияиния от концентрации бетулина. Глутатионпероксидазу активируют in vitro все образцы бетулина. Максимальный эффект для образцов А и С наблюдается при концентрации 50 и 100 мкг/мл, для образца Б - при 10 и 50 мкг/мл. При этом образец С в оптимальной концентрации проявляет более высокую активность, чем образцы А и Б. Все три образца активируют глутатионредуктазу, на 9-15%.

Обнаружение адаптогенной активности у бетулина создает неограниченные возможности его применения в качестве адаптогена из-за практически неисчерпаемых природных запасов этого продукта.

Предложено: новое адаптогенное средство. Средство представляет собой бетулин, ранее известный как антисептик, эффективный также против вирусов, и иммуномодулятор. Изобретение расширяет арсенал средств указанного назначения. 2 табл.

1. Применение бетулина в качестве адаптогенного средства.