СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С Российский патент 2005 года по МПК A61K35/78 A61P31/12 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, а более конкретно относится к изысканию новых, эффективных средств лечения гепатита С.

Уровень техники

Вирусные гепатиты относятся к категории наиболее опасных и распространенных инфекционных заболеваний. Ежегодно в мире от патологий, связанных с этой болезнью, умирают около 2 миллионов человек.

Причиной возникновения вирусных гепатитов являются, по крайней мере, 5 различных вирусов - энтеральные вирусы А и Е и парентеральные (В, С, Д).

Вирус гепатита С является самым "молодым", он был открыт лишь в 1989 году. С его открытием началось интенсивное изучение этой разновидности гепатита, являющейся основной причиной развития хронических диффузных заболеваний печени и гепатоклеточной карциномы.

Отличительной особенностью вируса гепатита С является способность к длительному персистированию в организме, что обуславливает высокий уровень хронизации инфекции (50-80% случаев). Устойчивость вируса обусловлена его способностью реплицироваться с высоким уровнем "мутации", в результате чего возникает несколько иммунологически различающихся вариантов, благодаря которым вирус избегает иммунного надзора. Образующиеся вируснейтрализирующие антитела являются высокоспецифичными и не способны нейтрализовать вновь появляющиеся варианты вируса.

Крайне высокий уровень заболеваемости вирусным гепатитом и, в частности, гепатитом С обуславливает актуальную задачу изыскания и создания эффективных средств терапии этой инфекции.

В настоящее время в практической медицине официально известно два препарата, используемых для лечения вирусного гепатита С (интерферон и рибавирин или виразол), однако это не делает задачу изыскания новых средств лечения этого заболевания неактуальной, в частности, из-за побочных эффектов, которые сопровождают применение известных препаратов, таких как развитие анемии, нейтропении, лейкопении, диспептические явления.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является изыскание нового, высокоэффективного средства для лечения гепатита С.

Другой задачей настоящего изобретения является изыскание высокоэффективного средства для лечения гепатита С природного происхождения, поскольку при этом отпадает целый ряд проблем, сопутствующих применению химиопрепаратов.

Указанные задачи решены настоящим изобретением благодаря установлению авторами высокой противовирусной активности по отношению к вирусу гепатита С у экстракта березовой коры (бересты) с содержанием бетулина в экстракте свыше 70%.

Бетулин является одним из первых природных веществ, которое впервые было выделено из растительного сырья еще в 1778 году. В 1876 году У.Хаусманн опубликовал результаты элементарных анализов бетулина (Hausmann U., Annalen der chemie, 182, р.365).

Основным источником природного бетулина является береза. Белая часть березовой коры у отдельных видов березы (Betula verrucosa, Betula papyfera) содержит до 30% и более бетулина (Hayek, E.W. et al.(1989) A Bicentenmal of Betulin, Phytochemistry, 28(9) р.2229-2242).

Бетулин является пентациклическим тритерпеном с углеродным скелетом ряда лупана, который также называют бетулинолом, трохотоном, березовой камфарой и (корили-) резинолом. Характерной особенностью ряда лупана является кольцо с пятью атомами углерода в составе пентациклической системы, которое в положении С-19 имеет α-изопентениловую группу. Бетулин отличается высокой термостабильностью, его температура плавления находится между 250 и 261°С, причем после сублимации рекристаллизованного продукта достигаются еще более высокие значения. Его молекулярный вес составляет 442,7, он растворим в пиридине и тетрагидрофуране, но мало растворим в дихлорметане, хлороформе и холодных органических растворителях, причем с повышением температуры его растворимость значительно возрастает. В воде и холодном петролейном эфире бетулин практически не растворим. Кроме того, кинетические исследования показали очень низкую реакционную способность гидроксильных групп бетулина.

Еще в 1899 году Дж.Уилер показал антисептические свойства бетулина, и поэтому он использовался для стерилизации перевязочных бинтов и пластырей (Wheeler J., (1899), Pharm. J., Die Darstellung des Betulin durch Sublimation, 494, Ref. Chem. Centr. 1900 I, стр. 353). В натуропатии и народной медицине получали и получают до сих пор отвары березовой коры, которые применяют для лечения малярии, водянки, подагры и при кожных заболеваниях, а также в виде настойки для компрессов при лечении абсцессов.

Большое число исследований посвящено гепатопротекторной активности бетулина. Было обнаружено, что бетулин снижает активность аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, содержание малеинового диальдегида, предупреждает воспалительный процесс в печени (Ю.К.Василенко и др. "Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы" Экспериментальная и клиническая фармакология, 1993, т.54 №4 стр. 53-55).

Однако не имеется достоверных сведений о противовирусной активности бетулина, в отличие от его различных синтетических производных. Так, сообщалось, что 3-замещенные глютариловые производные бетулина in vitro обладают цитотоксичностью в отношении лимфоцитов, трансформированных HIV ("Synthesis and anti - HIV activity of betulin derivaties", Bioorg Med Chem Lett. 1998 May 19, 8(10) p.1267-1272).

Большое число публикации посвящено получению целого ряда производных бетулиновой кислоты как потенциальных средств борьбы со СПИДом (см. например, "Synthesis and anti - HIV activity of betulinic acid and dihidrobetulinic acid derivaties", Bioorg Med Chem lett, 1997, Dec 5(12) p.2133-2143).

Возможность применения производных бетулина исследовалась и в отношении гепатита на моделях гепатита не вирусного происхождения, вызванного Cll₄, тетрациклином и ацетоном. (О.Б.Флехтер "Синтез эфиров тритерпеноидов группы лупана и их гепатопротекторная активность", Биоорганическая химия, 2000, том 26, №3, стр. 215-223).

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что экстракт коры березы обладает антивирусными свойствами. Этот эффект был обнаружен на модели экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С человека в организме мышей.

Несмотря на то, что антивирусная активность производных бетулина была показана рядом авторов на модели ВИЧ инфекции in vitro, неожиданность этого результата обусловлена не только тем обстоятельством, что предыдущие исследования бетулина не обнаруживали у него и у его производных противовирусной активности в отношении вирусного гепатита С, но и тем, что сами авторы изобретения при исследовании экстракта березовой коры в культурах клеток (in vitro) не обнаружили у него этой активности. Она проявилась лишь в условиях in vivo.

Осуществление изобретения

Далее описаны результаты исследований влияния экстракта березовой коры на репродукцию вируса гепатита С (далее сокращенно ВГС) в организме лабораторных животных.

Материал и методы:

Вирус: В работе использовали цитопатогенный вариант ВГС, выделенный из сыворотки крови хронически инфицированной ВГС больной. По данным генотипирования изолированный вариант ВГС относится к наиболее распространенному в России генотипу 1b ВГС. В исследованиях использовали инфекционные дозы ВГС, равные 10,0 ТЦД 50.

Противовирусный препарат. В работе использовали экстракт с содержанием бетулина, определенным методом ВЭЖХ - 72%. В опыте использовали различные разведения от 50 до 150 мг на 1 кг веса, которые вводили животным пероральным способом ежедневно в течение 4 дней.

Животные. Для изучения противовирусной активности бетулина использовали белых беспородных половозрелых мышей массой 18-20 г.

Методы. Материал, содержащий ВГС, вводили животным внутрибрюшинным способом. Часть животных оставляли контрольными. На 9-й день после заражения мышей “кормили” (вводили пероральным способом) раствором бетулина (физиологический раствор, с 10% Твина-80) (здесь и далее под бетулином понимается описанный выше препарат) в объеме 50 мкл, содержащих 50, 100 и 150 мг бетулина. Бетулин давали мышам 1 раз в день в течение 4-х дней. В опыте использовали по 10 животных на каждый вариант опыта. Через 2 дня, а также через 10 дней после последнего введения препарата, по 50% животных вскрывали, извлекали печень, головной мозг, забирали кровь. Пробы сывороток крови, надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин гомогенатов ткани печени и головного мозга использовали для определения антигенов ВГС и инфекционной активности вируса гепатита С. С этой целью вируссодержащие пробы титровали в культурах перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи СПЭВ. Антиген ВГС в данных пробах изучали в реакции гемагтлютинации, используя классический метод, описанный Clarke и Casals (1968).

Культуры клеток. Были использованы высоко чувствительные к цитопатогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), полученные из фирмы “Нарвак”, Москва. Их использовали в виде однодневного монослоя клеток, выращенного в 24-луночных пластиковых панелях. Культуры клеток СПЭВ выращивали на среде 199 с 10% сыворотки эмбриона телят, с добавлением глютамина и антибиотиков (100 ЕД/мл). Для титрования остаточной инфекционной активности вируса использовали ту же линию клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).

Инфекционную активность ВГС, содержащегося в пробах органов и тканей инфицированных мышей, учитывали по результатам титрования, как правило, на 6-7 день после инфекции, когда развивалось максимальное цитопатогенное действие вируса, используя формулу Рида и Менча для подсчета титра вируса гепатита С.

Результаты.

Данные исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из данных табл. 1а, все пробы сывороток крови, полученных от ВГС инфицированных мышей, относящихся к различным группам, содержат как антигенную, так и инфекционную активности ВГС. Причем максимальные проявления этих показателей обнаружены в контрольной группе ВГС инфицированных животных, не получавших бетулин. У животных, получавших препарат в дозе 50 мг на 1 кг веса в 50 мкл, была отмечена заметная тенденция к снижению титров гемагглютинина ВГС, а инфекционные титры ВГС в сыворотке крови падали на 2,6 lg (средние данные). Значительное снижение антигенной и инфекционной активностей ВГС в сыворотке крови отмечали в группе животных, получавших ежедневно препарат “бетулин” в дозе 100 мг/кг. В этом случае титры инфекционной активности ВГС падали на 3,4 lg и более чем в 2 раза снижалась антигенная активность ВГС в пробах сыворотки крови мышей. В меньшей степени препарат проявлял активность в случае использования его в дозе 150 мг/кг. Снижалась антигенная активность вируса, титры инфекционной активности незначительно снижались под влиянием препарата (на 1,8 lg). Близкие результаты, свидетельствующие об эффективности препарата “бетулин”, были получены при изучении тканей печени от всех групп животных (табл.1б). В частности показано, что максимальное снижение антигенов ВГС и его инфекционной активности наблюдали в случае использования препарата в разовой дозе 50 и 100 мг на 1 кг веса при 4-кратном введении препарата. Из данных таблицы 1б видно, что антигенная активность ВГС при этом снижалась в 2 и более раз и до 2 lg отмечали снижение инфекционной активности ВГС в тканях печени. Сокращались и размеры печени ВГС инфицированных мышей под влиянием лечебного эффекта препарата Наибольшие титры ВГС (до 7,0 lg ТЦД₅₀/20 мкл) наблюдали в тканях головного мозга ВГС инфицированных мышей (таблица 1 в). Однако и в этом случае у мышей, получавших препарат “бетулин” в дозах 50 и 100 мг на 1 кг наблюдали снижение титров инфекционной активности ВГС на 2,0-2,5 lg соответственно. При этом снижение антигена ВГС отмечали во всех группах животных, получавших препарат. В группе мышей, получавших бетулин в дозе 150 мг на 1 кг, отмечена тенденция к увеличению титров инфекционной активности ВГС в головном мозге.

Таким образом, данные, полученные при изучении органов и тканей мышей на 17 день после инфекции ВГС и 3-й день после 4-кратного применения препарата “бетулин”, свидетельствуют о высокой противовирусной активности препарата в отношении инфекции, вызванной ВГС у животных.

В этой связи выявлялась продолжительность положительных изменений в организме ВГС инфицированных мышей после отмены препарата. Поэтому 2-я группа ВГС инфицированных животных была обследована на 28 день после инфекции и на 11 день после отмены лечения препаратом “бетулин”.

Полученные результаты приведены в таблицах 2а, б, в. Исследование антигенной активности ВГС в органах и тканях мышей в этот период времени позволило установить, что лечение препаратом “бетулин” в дозах 50 мг и 100 мг на 1 кг, как правило, приводило к значительному снижению содержания гемагглютинина ВГС в пробах сыворотки крови, печени и головного мозга ВГС инфицированных животных (в дозе 100 мг на 1 кг до 4 раз - в печени мышей, в 2 и более раз - в сыворотке крови и головном мозге животных). Доза препарата, равная 150 мг на 1 кг, как правило, приводила к незначительному снижению содержания антигена ВГС в органах и тканях животных, инфицированных ВГС.

Изучение инфекционной активности ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных мышей показало, что в отдаленные сроки после завершения лечения антивирусный эффект введенного препарата сохранялся в течение более чем 10 дней. Однако анализ полученных данных позволил обнаружить иные закономерности в параметрах инфекции ВГС в эти сроки. В частности, показано, что титры ВГС, содержащиеся в сыворотке крови и в печени контрольной группы животных в значительной степени превышали эти значения, выявленные в ранние сроки после заражения мышей (на 1,5 lg - в сыворотке крови, на 2,4 lg - в печени). В то же время, на 28-й день после инфекции в тканях головного мозга титры вируса стали заметно снижаться.

Противовирусный эффект препарата “бетулин” в эти сроки после отмены препарата был несколько снижен, однако наибольший эффект наблюдался в период, когда для лечения использовали дозу, равную 50 мг на 1 кг веса. В этом случае в сыворотке крови животных титры вируса снижались в среднем на 1,9 lg, в печени - на 2,9 lg, в головном мозге - на 2,4 lg. 4-кратное введение препарата “бетулин” в дозе 100 мг на 1 кг приводило к менее существенным изменениям титра ВГС в сторону уменьшения (см. таблицы.2а, б, в).

Таким образом, установлено положительное действие препарата “бетулин” на снижение показателей инфекции, вызванной ВГС у мышей, и через 10 дней после его отмены.

Полученные авторами изобретения результаты позволяют утверждать, что экстракт березовой коры обладает высокой антивирусной активностью в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С, что позволяет предлагать его в качестве средства для лечения этого вида гепатита.

При этом нет оснований утверждать, что содержание бетулина в экстракте не менее 70% является критическим и ограничивать им объем изобретения. Практически значимые результаты могут быть получены и при меньших значениях содержания бетулина. Установление этих граничных значений может быть осуществлено специалистами при проведении обычной рутинной работы, в частности, основываясь на изложенном выше в описании настоящего изобретения.

Предпочтительной формой применения экстракта бересты являются твердые лекарственные формы: таблетки, пилюли, капсулы, порошки. При этом могут использоваться обычные для этого вида фармацевтически приемлемые носители. Препарат может включать один или несколько наполнителей, таких как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, сахара, крахмалы, маннит, сорбит и другие полиолы, карбонат кальция, фосфат кальция, сульфат кальция, полиэтиленгликоли и др.

Препарат также может включать поверхностно-активные вещества и другие обычные компоненты для твердых фармацевтических препаратов, такие как красители, ароматизаторы, адсорбенты.

При изготовлении препарата в виде таблетки с покрытием последнее может быть получено из таких пленкообразующих веществ как гидроксипропилцеллюлоза, пластификатора, такого как полиэтиленгликоли, и других вспомогательных добавок таких как, например, пигменты.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется для лечения вирусного гепатита С. Препарат для лечения вирусного гепатита С, включающий экстракт бересты с содержанием бетулина более 70% и фармацевтически приемлемый носитель. Препарат вводят пациенту перорально. Препарат способствует эффективному лечению вирусного гепатита С. 3 н.з. п. ф-лы, 2 табл.

1. Применение экстракта бересты в качестве средства для лечения вирусного гепатита С.2. Препарат для лечения вирусного гепатита С, включающий экстракт бересты с содержанием бетулина более 70% и фармацевтически приемлемый носитель.3. Способ лечения вирусного гепатита С, характеризующийся тем, что пациенту перорально вводят препарат по п.2.