СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАЛЬЦИЯ ФОЛИНАТА Российский патент 2004 года по МПК C07D475/04 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в фармацевтической и витаминной промышленности. Кальция фолинат входит в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств, утвержденный Правительством РФ (Распоряжение №357р от 20.03.03) и имеет обширную область применения. Препарат используется как антидот метотрексата и других антиметаболитов фолиевой кислоты в химиотерапии онкозаболеваний, а в сочетании с сульфаниламидами применяется в терапии протозойных инфекций, возникающих у ВИЧ-инфицированных пациентов и как осложнение при беременности. Препарат используется также в качестве высокоэффективной формы витамина фолиевой кислоты для лечения анемий, в том числе пострадиационных, а также для компенсации фолатной недостаточности при дефиците дигидрофолатредуктазы в организме.

Известны химические способы получения фолиновой кислоты и кальция фолината из фолиевой кислоты [1-7].

Ниже приведена схема синтеза кальция фолината (III) из фолиевой кислоты (I).

Восстановление (H₂/Pt; Na₂SO₄ и др.) и Формилирование (HCOOH)

гидролиз и трансформилирование (с NaOH или аминами)

Из приведенной схемы видно, что промежуточным продуктом синтеза кальция фолината является 5,10-N,N-метенил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевая кислота (5,10-метенилтетрагидрофолиевая кислота), которая существует только в кислой среде (рН<3) или в виде солей. Образование 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты из фолиевой кислоты может проходить двумя путями.

Первый путь включает в себя восстановление фолиевой кислоты (I) до тетрагидрофолиевой кислоты с помощью боргидрида натрия, цианборгидрида натрия и других восстановителей [4] и, далее, формилирование тетрагидрофолиевой кислоты при ее нагревании в муравьиной кислоте с образованием 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (II).

Второй путь включает первоначальное формилирование фолиевой кислоты в концентрированной муравьиной кислоте до 10-формилфолиевой кислоты, которую далее гидрогенизируют по пиразиновому кольцу с помощью газообразного водорода на платиновом катализаторе до 10-формилтетрагидрофолиевой кислоты. В кислом растворе при рН<5 формильная группа 10-формилтетрагидрофолиевой кислоты циклизуется с образованием 5,10-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (II).

Фолиновую кислоту получают далее путем гидролиза и трансформилирования при обработке 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты щелочами или аминами [5-7]. При этом происходит размыкание имидазолинового кольца и перегруппировка с образованием 5-формилтетрагидрофолиевой кислоты, которую далее осаждают в виде кальциевой соли - кальция фолината (III).

Основные недостатки известных способов получения фолиновой кислоты, применяемых на практике, связаны с первой стадией синтеза, то есть с получением промежуточного соединения 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты (II). Это обусловлено тем, что восстановление фолината до тетрагидро-формы проводят с помощью газообразного водорода на платиновом катализаторе, что небезопасно, или с помощью боргидрида (или цианборгидрида) щелочных металлов, которые берут в избытке и затем разлагают кислотой и при этом также выделяется газообразный водород. Другим недостатком является то, что в любом варианте после завершения восстановления до тетрагидро-формы требуется удаление катализатора и/или большого количества побочных продуктов из реакционной смеси.

В качестве прототипа выбран способ получения кальция фолината [3], включающий в себя следующие стадии:

1. Восстановление фолиевой кислоты в водном растворе (рН 8,0) с боргидридом натрия с целью превращения фолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую кислоту.

2. Выделение тетрагидрофолиевой кислоты осаждением соляной кислотой (под азотом и в присутствии аскорбиновой кислоты) с одновременным разрушением избытка боргидрида натрия и удалением продуктов его разложения.

3. Формилирование выпавшей в осадок тетрагидрофолиевой кислоты в концентрированной муравьиной кислоте с целью получения 5,10-N,N-метенил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты. Процесс протекает 14 ч.

4. Упаривание в вакууме реакционной смеси (при 60°С) с целью удаления избытка муравьиной кислоты и извлечение 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в виде хлорида с помощью соляной кислоты.

5. Для раскрытия имидазолинового кольца и получения фолиновой кислоты 5,10-метенилтетрагидрофолат растворяют в кипящей воде и выдерживают при кипячении с обратным холодильником в течение 11 ч, поддерживая рН в интервале 6,5-6,9 с помощью 1 н NaOH.

6. Очистка раствора фолината: (а) осаждением примесей с помощью MgCl₂ при рН 12; (б) удалением примесей с помощью адсорбционной хроматографии на колонке с модифицированном силикагелем (марки “Florisil”).

7. Выделение кальция фолината из фильтрата (в варианте д) или из элюатов (в варианте б) с помощью CaCl₂.

Задачей изобретения является разработка экологически безвредного и безопасного способа получения кальция фолината.

Поставленная задача решается предлагаемым способом, предусматривающим проведение стадии получения промежуточного продукта 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата фотохимическим путем при действии на фолиевую кислоту ультрафиолетового излучения (УФ-света) в присутствии соединений доноров электрона, что приводит к получению тетрагидрофолиевой кислоты, и сопряженное формилирование полученной тетрагидрофолиевой кислоты с помощью муравьиной кислоты. Способ включает следующие основные стадии:

1. Получение 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата при облучении УФ-светом раствора фолиевой кислоты в присутствии доноров электрона (аскорбиновой или гликолевой кислот, NADH) при постоянном пропускании через раствор инертного газа (аргона или азота) с последующим выдерживанием облученного раствора в 50%-ной муравьиной кислоте в течение 18-22 ч. 5,10-Н,Н-метенилтетрагидрофолат выделяется в виде гидрохлорида с помощью соляной кислоты.

2. Дальнейшие стадии обработки проводили по известным методикам. Для раскрытия имидазолийного цикла и образования фолиновой кислоты раствор хлорида 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата выдерживали в течение нескольких часов при повышенной температуре при рН 6,0 в присутствии аминов.

3. Получение кальция фолината проводили осаждением с помощью CaCl₂ и этанола.

Фотохимический способ получения 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата является безопасным и экологически безвредным и состоит из меньшего количества этапов (стадий), чем в прототипе, так как отпадает необходимость выделения промежуточного продукта - тетрагидрофолиевой кислоты.

Изобретение поясняется следующими примерами:

Получение 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата.

Пример №1. Раствор, содержащий фолиевую кислоту в концентрации 10^-4 М, гликолевую кислоту в концентрации 10^-3 М в изопропиловом спирте и 20% муравьиной кислоты (оптимальный рН раствора 2,5), предварительно продували в течение 10 мин током газообразного азота (или аргона) и облучали в области длинноволновой полосы поглощения фолиевой кислоты ((340±20) нм), при постоянном токе инертного газа через облучаемый раствор. Об образовании 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты судили по нарастанию поглощения в области 350 нм. Общее время облучения 20-30 мин. По окончании облучения приливали муравьиную кислоту до концентрации 50% и выдерживали в темноте под аргоном 18-22 ч. Затем муравьиную кислоту отгоняли под вакуумом при температуре 35-40°С и получали пенистый осадок, в составе которого содержался 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолат в виде формиата. Выход продукта - 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата - (по спектральным данным) составлял 12-15% (в расчете на исходную фолиевую кислоту).

Далее 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолат выделяли в виде хлорида после растворения полученного осадка в 0,5 М растворе соляной кислоты, в котором присутствовал в качестве антиоксиданта 0,01 М унитиол или 0,02 М аскорбиновая кислота (при постоянном токе азота через раствор). Требуемое количество раствора соляной кислоты рассчитывали из следующего соотношения: для осаждения 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата, полученного из одного грамм-моля (441 г) исходной фолиевой кислоты, необходимо взять 3000 мл 0,5 М раствора соляной кислоты. Полученный раствор охлаждали льдом, желтый осадок хлорида 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата отделяли фильтрацией, промывали небольшим количеством 0,02 М раствора соляной кислоты с антиоксидантом и далее сушили в вакуум-эксикаторе над P₂O₅ до постоянного веса.

О чистоте препарата судили по следующим данным. Отношение оптических плотностей при 347 и 302 нм (в растворе 1 N НСl) должно было составлять 2,6. Высоко эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в изократическом режиме с элюентом, содержащим 0,05 М NaH₂PO₄ доведенный ортофосфорной кислотой до рН 3,3 (92%) и 8% ацетонитрила, показывала время удерживания 9,8 мин при скорости потока элюента 1 мл/мин, что совпадало со временем удерживания свидетеля стандартного препарата 5,10-НЧМ-метенилтетрагидрофолата.

Пример №2. Раствор фолиевой кислоты в концентрации 10^-4 М в деионизированной воде (рН 5,6-6,5) в присутствии восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (10^-3 М) предварительно продували в течение 10 мин током газообразного азота (или аргона) и освещали (20-30 мин) в области длинноволновой полосы поглощения фолиевой кислоты ((360±20) нм) при постоянном токе инертного газа через облучаемый раствор. После освещения к раствору добавляли муравьиную кислоту (до ее концентрации 50%) и оставляли в темноте под аргоном на 18-22 ч. Выход продукта реакции составлял 15-20%.

Раскрытие имидазолинового цикла и получение кальция фолината.

К 5 г хлорида 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата добавляли 5 мл 50% водного (по объему) раствора диметилсульфоксида и нагревали до 80°С. Нагретый раствор продували азотом и затем прикалывали 1 мл 13% раствора этилендиамина в 50% диметилсульфоксиде со скоростью примерно 0,02 мл/мин. После добавления раствора амина смесь выдерживали при 80°С в течение 5 ч (с обратным холодильником). Все указанные операции проводили при постоянном токе инертного газа через раствор. Затем реакционную смесь охлаждали до -5°С и выдерживали при этой температуре в течение 24 ч, затем отфильтровывали выпавший осадок, а к фильтрату добавляли 2 г сухого СаСl₂ и 6 мл этанола. Белый осадок отфильтровывали, промывали 50%-ным этанолом и эфиром и высушивали над Р₂O₅. О чистоте конечного продукта судили по спектральным и хроматографическим данным. Отношение оптических плотностей для водных растворов кальция фолината при 282 и 242 нм составляет 4,6 для препарата 98%-ной степени чистоты. ВЭЖХ продукта имело время удерживания, совпадающее с времением удерживания стандартного препарата фолиновой кислоты. Мобильная фаза для хроматографии: 10% ацетонитрила - 1,5 мМ тетрабутиламмония гидроксида (рН 7,3). Время выхода фолиновой кислоты 17,8 мин на колонке С-18 длиной 15 см при скорости потока 1,5 мл\мин. Общий выход конечного продукта в расчете на исходную фолиевую кислоту составлял 40%.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Pohland A., Flynn E.H., Jones R.G., Shive W. A proposed structure for folinic acid-SF, a growth factor derived from pteroylglutamic acid //J. Am. Chem. Soc. 1951. Vol.73. P.3247.

2. Патент США №4148999, 1979.

3. Tatum C.M., Femald M.G., Schimel. J.P. Facile new synthesis and purification of 5,10-methenyltetrahydrofolate from folic acid //Analyt. Biochem. 1980. Vol.103, N2. P.255-257.

4. Temple С., et al. Preparation and purification of L-(+)-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid // J. Medicinal Chem. 1979. Vol.22, N6. P.731.

5. Zakrzewski S.F., Sansone A.M. Preparation of folinic acid (N⁵-formyltetrahydro folic fcid) // Methods in Enzymology. Vol.XVIII. Vitamins and Coenzymes. Part B. Acad. Press. N.-Y. London. 1971. P.731-733.

6. Патент Великобритании №1560372, 1980.

7. Патент США №5710271, 1998.

Изобретение относится к способу получения кальция фолината. Получаемый продукт принадлежит к важнейшим и жизненно необходимым лекарственным средствам и имеет обширную область применения: как антидот метотрексата и других антиметаболитов в химиотерапии онкозаболеваний, в качестве эффективной формы витамина фолиевой кислоты для лечения анемий, в том числе пострадиационных, а также для компенсации фолатной недостаточности при дефиците дигидрофолатредуктазы в организме и т.д. Способ включает стадии получения промежуточного продукта - 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата фотохимическим восстановлением фолиевой кислоты действием длинноволновым ультрафиолетовым излучением (УФ-света) в среде инертного газа и инертного растворителя, такого как изопропиловый или метиловый спирт или ионизированная вода, в присутствии донора электрона, такого как аскорбиновая или гликолевая кислота, с сопряжённым формилированием с помощью муравьиной кислоты. Кальция фолинат получают путём перевода 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолиевой кислоты в форму хлорида и последующего гидролиза в присутствии аминов. В результате гидролиза происходит размыкание имидазолинового кольца с образованием 5-формилтетрагидрофолиевой кислоты, которую далее осаждают в виде кальциевой соли – кальция фолината. Способ является экологически безвредным и безопасным.

Способ получения кальция фолината, предусматривающий восстановление фолиевой кислоты, формилирование и замыкание имидазолинового цикла с использованием муравьиной кислоты и образованием промежуточного продукта - 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата, обработку полученного продукта соляной кислотой, с получением хлорида 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата, гидролиз хлорида 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата до фолината, и обработку солью кальция, с выделением целевого продукта, отличающийся тем, что восстановление фолиевой кислоты ведут фотохимическим путем длинноволновым ультрафиолетовым излучением в среде инертного газа в присутствии растворителей, таких как изопропиловый спирт, метиловый спирт или деионизированная вода, донора электрона, такого, как аскорбиновая кислота или гликолевая кислота, а также муравьиной кислоты в качестве формилирующего агента, с образованием промежуточного продукта - 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолата; к облученному раствору для полноты формилирования и замыкания имидазолинового цикла приливают дополнительно муравьиную кислоту, затем переводят 5,10-N,N-метенилтетрагидрофолат в форму хлорида, а далее проводят гидролиз полученного продукта в присутствии амина и выделяют конечный продукт - кальция фолинат - добавлением кальция хлорида.