НАНОМОЛЕКУЛЯРНОЕ СЕЛЕНОПРОТЕИНОВОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АКТИВНЫМ ИММУНОТРОПНЫМ И МЕТАБОЛИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2004 года по МПК A61K33/04 A61K35/78 A61P3/00 

Изобретение относится к биофармакологии, иммунологии, иммунофармакологии, биотехнологии, клинической медицине и может быть использовано для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями иммунных функций, а также для регуляции и коррекции метаболических процессов, в частности белкового, жирового и углеводного, и может быть одновременно использовано как противовоспалительное, липотропное, гепатопротекторное, противоопухолевое и кардиотоническое средство.

В последнее время в клинической медицине для коррекции иммунных и метаболических процессов используются органические вещества природного происхождения, а также различные микроэлементы, обладающие иммунотропным действием. Это препараты из экстрактов зобной железы, лимфатических узлов, соединительной ткани и селезенки. К таким лекарственным средствам относятся хорошо известные лекарственные вещества - тимоген, Т-активин, миелопид, тимоптин и др. (Машковский М.Д. “Препараты, корригирующие процессы иммунитета”, в кн. “Лекарственные средства”, Харьков, “Торсинг”, т.2, 1997, с.199-207). Широкое применение в последнее время получил, например, такой препарат как деринат, получаемый из молоки осетровых рыб. Тем не менее применение этих лекарственных средств зачастую вызывает различные побочные явления в виде аллергии и часто не переносится организмом больного человека. Кроме того, подобные лекарственные препараты не обладают необходимой физиологической активностью.

Учитывая высокую биологическую активность селена и его соединений (А.В.Кудрин, А.В.Скальный и др., в книге “Иммунофармакология микроэлементов.. Изд. КМК; М., 2000, с.14-61), клиническая медицина широко применяет подобные препараты для лечения разнообразных заболеваний, сопровождающихся иммунными и метаболическими нарушениями. Следует однако учесть, что эффект действия селена определяется не самим микроэлементом, а органическими веществами, соединенными с ним - селеносодержащими аминокислотами и белками (В.А.Тутельян и др. “Селен в организме человека”. М.: Изд. РАМН, 2002, с.11-45).

Недостаток этих микроэлементов и селенопротеиновых соединений в организме приводит к нарушению различных молекулярных процессов - снижению активности биотрансформирующих ферментов, изменению метаболизма гипофизарных и тиреоидных гормонов, повышению концентрации глутатиона плазмы. Следует отметить, что дефицит селена ассоциируется с самыми разнообразными иммунодефицитными процессами - опухолями, аутоиммунными и аллергическими заболеваниями. Селен стимулирует реакцию лимфоцитов на различные митогены, независимо от типа антигена. В то же время этот микроэлемент обладает непрямыми противовоспалительными свойствами и даже блокирует транскрипцию и репликацию вирусов СПИДа. Реализация иммунотропного эффекта селена обусловлена не действием самого микроэлемента, а его связями с другими макро- и микроэлементами, витаминами - провитамин А, и органическими веществами, в частности белками.

Одним из важнейших составляющих гомеостаза является апоптоз. Как известно, программированная клеточная смерть представляет собой реализацию генетической программы гибели клеток, что сопровождается нарушением клеточной мембраны, изменением размера клетки, деградацией ДНК и изолированием клетки от ее внутренней среды. Основную роль в формировании апоптоза, кроме селена, принадлежит кальцию (А.В.Кудрин, А.В.Скальный и др. В книге “Иммунофармакология микроэлементов., Изд. КМК; М., 2000, с.250-254), и связанным с ним органическим веществом - кальциопротеиновым комплексом. Особую роль в этом так называемом “кальциевом апоптозе” играет сопряженная активация метаболизма этого макроэлемента с активацией эндонуклеаз, протеаз, кальпаинов и трансглутаминазы, сшивающей белки цитозоля. С одной стороны, увеличение содержания кальция в цитозоле необходимо для прогрессии клеточного цикла и экспрессии генов, а с другой - оно активирует процессы деградации при апоптозе. Следует отметить также, что для лимфоидных клеток чрезвычайно важен кальциево-зависимый путь апоптоза, так как повышение концентрации этого макроэлемента в плазме крови приводит к увеличению апоптоза в тимоцитах и лимфоцитах.

Немаловажную роль в формировании иммунных реакций играют так называемые цианогенные гликозиды, в составе которых находится синильная кислота. Действие цианогенных гликозидов основано на опосредованной вторичной реакции иммунной системы, которая развивается после проникновения этих веществ в опухолевые клетки, что приводит к замедлению их роста и гибели без повреждения здоровых клеток. Указанный механизм является элективным, так как цианогенные гликозиды обладают избирательной активностью накапливаться только в опухолевых клетках.

Важное участие в активации гомеостатических процессов принадлежит различным флавонам и флавоноидам, которые осуществляют разнообразные иммунотропные и метаболические процессы - седативные, желчегонные, кровоостанавливающие и противоопухолевые. Сами по себе флавоны не являются достаточно активными лекарственными средствами, но в соединении с другими биологическими комплексами, в частности с белками, образуют эффективные лекарственные препараты.

Наряду с указанными физиологически активными веществами существенное значение в регуляции иммунных и метаболических процессов принадлежит терпеновым веществам, в частности сесквитерпеновым лактонам. Спектр биологической активности сесквитерпеновых лактонов весьма широк и включает в себя противовоспалительное и ранозаживляющее, кардиотоническое, метаболическое, а также противоопухолевое свойство.

Важную роль в регуляции гомеостаза играют также каротиноподобные вещества, в частности β-каротин. Исследования, проведенные в последнее время, показали, что β-каротин, как провитамин А, играет существенную роль в регуляции иммунотропных и метаболических процессов (А.В.Куприн, А.В.Скальный и др., в книге “Иммунофармакология микроэлементов.. Изд. КМК; М., 2000, с.86-110). Этот провитамин обладает липотропным, гепатопротекторным и противовоспалительным свойствами. Современные исследования свидетельствуют о том, что витамин А одновременно способен влиять как на белковый обмен, так и регулировать спектр популяции иммунокомпетентных клеток. Практически при дефиците витамина А страдают все органы и ткани тела человека, начиная от кожи и костного мозга до внутренних органов, эндокринных желез и иммунной системы.

В представленных патентах Российской Федерации на изобретение (Патент РФ №2176916 - “Селеновое гликопротеиновое элементорганическое вещество, обладающее иммуностимулирующим действием” и Патент РФ №2177321 - “Селенокаротинопротеиновое вещество для регулирования метаболических процессов”), описана технология получения нового класса лекарственных веществ для воздействия на иммунную систему и разнообразные метаболические процессы. Однако в этих изобретениях не изложена технология получения более активных наномолекулярных селенопротеиновых веществ с основным принципом дополнительного селенирования протеиновой матрицы. В связи с этим создаваемые новые лекарственные вещества должны по своему строению и механизму действия соответствовать селеносодержащим белкам, обогащенных селеном. Поэтому одно и то же вещество может одновременно регулировать как иммунные, так и метаболические процессы.

Для решения поставленной задачи предлагаются наномолекулярные селенопротеиновые вещества, обладающие аналогичным действием селеносодержащих белков и аминокислот. Они включают низкомолекулярный компонент - протеин, полученный экстрацией из протеиносодержащего растительного сырья органическими растворителями, селен, катионы кальция, метасиликат-анионы, метасиликат- и цианид-анионы, фосфоглицерол, флавонолы, β-каротин и терпенгидрат. Сущность изобретения поясняется прилагаемыми к описанию чертежами (фиг.1-8).

Способ получения наномолекулярного селенопротеина осуществляется следующим образом (фиг.1-3).

Первая стадия получения наномолекулярного селенопротеина (фиг.1)

(Синтез селенопротеиновой матрицы)

В качестве исходного материала используют зеленую массу белковосодержащих растений, например злаковых, бобовых, листьев кукурузы и др., предварительно высушенных и измельченных. С помощью экстракции эфиром, этиловым спиртом или димексидом из полученного сырья извлекают растительный белок-протеин. Белковый экстракт выпаривают и производят лиофильную сушку; изготовленный порошок растворяют в 60-90%-ном этиловом спирте, после чего вводят селен, полученный термолизом селеномочевины, из расчета 10-12 мкг на 1 мл раствора и помещают смесь в электромагнитное (плотность потока мощности 5·10^-3 Вт/см) синусоидальное высокочастотное поле 20-30 МГц на 5 минут. Полученная молекула селенопротеина представляет собой две полипептидные α- и β-цепи, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина; α-цепь состоит из остатков 20 аминокислот, β - из 29 аминокислот. Селен, полученный путем термолиза селеномочевины, входит в боковые алкильные радикалы аминокислот, соединяя некоторые звенья α- и/или β-цепей одной или двух соседних молекул протеина, тем самым дополнительно сшивая их (фиг.1). Молярные соотношения протеина и селена 1:4.

Вторая стадия получения наномолекулярного селенопротеина (фиг.2)

(Получение наночастиц селенопротеиновой матрицы)

На полученный селенопротеин воздействуют ферментом трипсином в разведении 1:1000 (из расчета 1/20 мл на 100 мл субстанции), который гидролизует связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот - в данном случае аргинина, входящего в α- и β-цепи протеина. Этот процесс сопровождается разделением молекулы селенопротеина на наноструктуры между двумя аминокислотами аргинина в α-цепи и разделением β-цепи на две структуры между глутамином и аргинином.

Третья стадия получения наномолекулярного селенопротеина (фиг.3).

(Синтез наночастиц селенопротеиновой матрицы в единую структуру с дополнительным обогащением белка ионами селена)

К полученным наночастицам молекулы селенопротеина добавляют дополнительно 10-12 мкг селена, полученного путем термолиза селеномочевины и данную смесь помещают в высокочастотное электромагнитное поле - 20-30 ГГц длительность на 5 минут при потоке мощности 5·10 Вт/см². В полученной наномолекуле содержится 20-24 мкг селена и дополнительно две диселенидные связи - между двумя аминокислотами вверху и аминокислотами изолейцина и глутамина внизу. Молярные соотношения протеина и селена в наномолекулярной селенопротеиновой матрице 1:8.

Полученная наномолекула селенопротеина представляет собой две полипептидные α- и β-цепи протеина, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина, селеновыми связями между аминокислотами валином и лейцином, селеновой связью между глутаминовыми кислотами и двумя диселе-нидными связями между α- и β-цепью. При всех физиологических значениях рН наномолекула селенопротеина ионизирована.

Заряженными являются С- и N-концевые группы и связанные с α-углеродными атомами боковые цепи, содержащие карбоксильную или аминогруппы (фиг.3).

Технология получения наномолекулярных селенопротеиновых веществ

1. Вещество кальция силикат-селенопротеин

Вещество включает ионизированный наномолекулярный селенопротеин (фиг.3), к которому по карбоксильным группам глутаминовой кислоты и С-концевым группам присоединены катионы кальция, по аминогруппам гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены метасиликат-анионы к α- и β-цепи наномолекулярного селенопротеина (фиг.4).

Согласно современным представлениям (А.В.Кудрин, А.В.Скальный и др., в книге “Иммунофармакология микроэлементов. Изд. КМК; М., 2000, с.250-254), кальцию и связанному с ним протеину принадлежит основная роль в формировании апоптоза и сопряженной регуляции метаболизма с активацией эндонуклеаз, протеаз и трансглутаминазы, сшивающей белки цитозоля.

2. Вещество силикат - цианид-селенопротеин

Вещество включает ионизированный наномолекулярный селенопротеин (фиг.3), к которому по аминогруппам гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены метасиликат - и цианид-анионы к α- и β-цепи наномолекулярного селепротеина (фиг.5).

Полученное средство играет важную роль в формировании противоопухолевых иммунных реакций, т.к. для соединений синильной кислоты характерно элективное проникновение их в опухолевые клетки, что приводит к замедлению их роста и гибели раковых клеток.

3. Вещество селенофосфолипофлавонопротеин

Вещество включает ионизированный наномолекулярный селенопротеин (фиг.3), к которому через концевые карбоксильные группы и/или карбоксильные группы боковых цепей, остатков кислых аминокислот присоединен фосфоглицерол и также возможно к остаткам глутаминовой кислоты и/или к остаткам серина и/или тирозина присоединены флавонолы (рутин, витамин Р и др.) (фиг.6).

Данное вещество осуществляет разнообразные метаболические и иммунотропные процессы - седативные, желчегонные, кровоостанавливающие и противоопухолевые.

4. Вещество селенофосфолипокаротинопротеин

Вещество включает ионизированный наномолекулярный селенопротеин (фиг.3), к которому через концевые карбоксильные группы и/или карбоксильные группы боковых цепей присоединены: фосфоглицерол и β-каротин (+) (фиг.7).

Данное вещество играет важную роль в регуляции гомеостаза, а также иммунотропных и метаболических процессов (А.В.Кудрин, А.В.Скальный и др., в книге “Иммунофармакология микроэлементов.. Изд. КМК; М., 2000, с.86-110); одновременно обладает липотропным, гепатопротекторным и противовоспалительным свойствами, регулируя как белковый обмен, так и спектр популяции иммунокомпетентных клеток.

5. Вещество селенокаротинотерпенопротеин

Вещество включает ионизированный наномолекулярный селенопротеин (фиг.3), к которому через концевые карбоксильные группы и/или карбоксильные группы боковых цепей присоединены β-каротин (+) и терпенгидрат - сесквитерпенлактон (фиг.8).

Полученное вещество, учитывая наличие в нем как каротина, так и сесквитерпенового лактона, обладает широким иммунотропным и метаболическим действием (М.Я.Ловкова и др. в кн. “Почему растения лечат”., М., Изд. Наука, 1990, с.19-21).

В настоящее время установлено, что лекарственные средства подобного рода обладают широким спектром биологической активности:

противовоспалительное и ранозаживляющее действие;

маточное кровоостанавливающее;

антигельминтное;

кардиотоническое;

противораковое.

Примеры получения наномолекулярного селенопротеинового органического вещества

Пример 1

Способ получения кальция силикат-селенопротеина.

К ионизированной молекуле наноселенопротеина добавляют необходимое количество катионов кальция и метасиликат анионов. Смесь выдерживают в электромагнитном высокочастотном поле (мощность 5·10^-3 Вт/см, частота 20-30 МГц). Молекулярное соотношение - наноселенопротеин:

Са²⁺:SiO2-3

Пример 2

Способ получения силикат-цианид-селенопротеина

К ионизированной молекуле наноселенопротеина добавляют необходимое количество метасиликат- и цианид-анионов. Смесь выдерживают в электромагнитном высокочастотном поле (мощность 5·10^-3 Вт/см, частота 20-30 МГц). Молекулярное соотношение - наноселенопротеин:

SiO2-3

Пример 3

Способ получения селенофосфолипофлавонопротеина

К ионизированной молекуле наноселенопротеина добавляют необходимое количество фосфоглицерола и флавонола. Смесь выдерживают в электромагнитном высокочастотном поле (мощность 5·10^-3 Вт/см, частота 20-30 МГц). Молекулярное соотношение - наноселенопротеин: фосфоглицерол: флавонол = 1:1:4.

Пример 4

Способ получения селенофосфолипокаротинопротеина

К ионизированной молекуле наноселенопротеина добавляют необходимое количество фосфоглицерола и β-каротина (+). Смесь выдерживают в электромагнитном высокочастотном поле (мощность 5·10^-3 Вт/см, частота 20-30 МГц). Молекулярное соотношение - наноселенопротеин: фосфоглицерол: β-каротин = 1:1:8.

Пример 5

Способ получения селенокаротинотерпенопротеина

К ионизированной молекуле наноселенопротеина добавляют необходимое количество β-каротина (+) и терпенгидрата - сесквитерпенлактона (СТЛ). Смесь выдерживают в электромагнитном высокочастотном поле (мощность 5·10^-3 Вт/см, частота 20-30 МГц). Молекулярное соотношение - наноселенопротеин: β-каротин (+): терпенгидрат = 1:6:4.

Острую токсичность препарата исследовали при внутрибрюшинном введении наномолекулярного селенопротеинового органического вещества (НМСПОВ) в дозе 250 мг/кг мышам (возраст 6 недель, вес 28-30 г). Значение ЛД составило 700 мг/кг.

При исследовании общей токсичности мышам вводили НМСПОВ в дозе 100 мг/кг в день внутрибрюшинно непрерывно в течение 10 дней. Снижение веса и каких-либо других нарушений при этом не отмечали, в последующем при наблюдении этих мышей отклонений от нормы не выявлено.

В результате проведенных исследований установлено, что НМСПОВ является органическим соединением, обладает выраженным биологическим действием, не токсичен, полностью растворим в воде и биологических жидкостях - крови, лимфе и ликворе. В 1 мл НМСПОВ содержится в зависимости от количества аминокислот в лиганде от 20 до 30 мг субстанции и 20-24 мкг селена.

Доза вводимого препарата зависит от клинического состояния больного, его возраста, веса, а также способа введения. Эффективная терапевтическая суточная доза для больного составляет от 6 до 150 мг активного вещества, которое вводят одномоментно или дробно.

Способ активации и стимуляции метаболических и иммунных процессов осуществляют следующим образом.

Полученный препарат НМСПОВ представляет собой раствор активного вещества в 60-90%-ном этиловом спирте, 1 мл которого содержит 20-30 мг лекарственной субстанции НМСПОВ вводят перорально, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, а также наружно в виде суспензии в масляном растворе или в виде масляно-спиртового наполнителя.

При пероральном введении необходимую дозу рассчитывают следующим образом:

в 20 каплях раствора содержится 20-30 мг лекарственной субстанции;

в 10 каплях (1/2 мл) содержится 10-15 мг препарата;

в 5 каплях (1/4 мл) содержится 5-7,5 мг препарата;

в 3 каплях (1/7 мл) содержится 3,3 мг препарата.

При внутримышечном, внутривенном или внутриартериальном введении препарат растворяют в физиологическом растворе для лучшей диссоциации в соотношении 1:10 - при использовании 60%-ного спирта или 1:20 - при 90%-ном спирте.

Например, при клинической патологии средней степени тяжести препарат вводят однократно в виде инъекции от 0,1 до 0,5 мл в день, при тяжелой степени патологии указанную дозу вводят два раза в день. При проведении интенсивной терапии препарат вводят внутримышечно или внутривенно (внутриартериально) по 1,0-2,0 мл соответственно с добавлением 10 или 20 мл физиологического раствора. В случае перорального введения в зависимости от возраста, веса и степени поражения - от 0,5 до 3,0 мл, причем препарат растворяют в 1/3 стакана кипяченой теплой воды (36-38°С). Длительность лечения может колебаться от 1 до 3 месяцев, в случае тяжело протекающей патологии курс лечения повторяют с интервалом в 1-2 месяца до выраженного клинического эффекта. В период проведения лечения эффект терапии контролируют исследованием биохимических показателей и иммунологического статуса.

Изобретение относится к биофармакологии и медицине и касается средства, обладающего иммунотропным и метаболическим действием. Средство представляет собой наномолекулярное селенопротеиновое вещество в виде полипептидных α- и β-цепей, соединенных дисульфидным мостиком по остаткам цистеина, селеновыми связями между аминокислотами валином и лейцином, а также глутаминовыми кислотами и двумя диселенидными связями между α- и β-цепью, наномолекула при всех физиологических значениях рН ионизирована. К ионизированной наномолекуле селенопротеина могут быть присоединены катионы кальция и метасиликат анионы; метасиликат - и цианид-анионы; фосфоглицерол и флавонолы; фосфоглицерол и β-каротин; β-каротин и терпенгидратсесквитерпенлактон. Средство обладает выраженным биологическим действием, не токсично, растворимо в воде и биологических жидкостях - крови, лимфе и ликворе. 5 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Наномолекулярное селенопротеиновое органическое средство, обладающее иммунотропным и метаболическим действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой две полипептидные α- и β-цепи протеина, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина, селеновыми связями между аминокислотами валином и лейцином, а также глутаминовыми кислотами и двумя диселенидными связями между α- и β-цепью, при этом соотношение протеина и селена составляет 1:8, наномолекула селенопротеина при всех физиологических значениях рН ионизирована, заряженными являются С- и N-концевые группы и связанные с α-углеродными атомами боковые цепи, содержащие карбоксильную или аминогруппы (Фиг.3).2. Средство по п.1, где к ионизированной наномолекуле селенопротеина по карбоксильным группам глутаминовой кислоты и С-концевым группам присоединены катионы кальция, по аминогруппам гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены метасиликат-анионы к α- и β-цепи наномолекулярного селенопротеина при молекулярном соотношении наноселенопротеин: Са²⁺: SiO2-3