СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОМОЛЕКУЛЯРНОГО СЕЛЕНОПРОТЕИНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОТРОПНЫМ И МЕТАБОЛИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2004 года по МПК A61K33/04 A61K35/78 A61P37/02 

Изобретение относится к биофармакологии, иммунофармакологии, биотехнологии, клинической медицине и может быть использовано для получения разнообразных селенопротеиновых лекарственных средств, направленных на восстановление функций иммунной системы и коррекцию метаболических процессов - белкового, жирового и углеводного обмена. Данное изобретение может быть использовано также для получения разнообразных селеносодержащих белков и селеносодержащих аминокислот.

В настоящее время проблема, связанная с обменом селена и его ролью в формировании иммунных и метаболических процессов, получила приоритетное направление (В.А.Тутельян и др. “Селен в организме человека”. М.: Изд. РАМН, 2002, с.11-45). В частности установлено, что специфическая патология, обусловленная дефицитом селена, развивается у человека при поступлении селена менее 19 мкг в сутки для мужчин и 14 мгк у женщин. Физиологический уровень потребления и усвоения селена регулируется количеством поступления этого микроэлемента в организм и активностью фермента глутатионпероксидазы, обусловливающих формирование так называемого селенового гомеостаза (В.А.Тутельян и др. “Селен в организме человека”. М.: Изд. РАМН, 2002, с.146-156). В связи с этим в клинической медицине возникло целое направление, основанное на применении селена как микроэлемента, а также аминокислот, соединенных с селеном. Специфический и неспецифический механизм инкорпорирования селена в макромолекулы регулируется определенной системой генов как у бактерий, так и у млекопитающих. Инкорпорирование селеноцистеина в специальные молекулы-селенопептиды непосредственно осуществляется генами и специальными ферментами (Бионг Лей Ли. “Селеноцистеиновая тРНК у млекопитающих. Лаборатория молекулярной генетики, Сеул, Южная Корея, в сборнике “Селен”, Бостон, Лондон, 2000; Август Бок. “Метаболизм селена в бактериях”, Мюнхенский университет, Германия, в сборнике “Селен”. Бостон, Лондон, 2000). Например, инкорпорирование селеноцистеина в транспортную РНК происходит только под контролем генных структур с привлечением специальных ферментов.

Изучение сложного механизма включения селеновых аминокислот в селеносодержащие белки позволяет предположить, что методы генной инженерии в данном случае не могут быть широко использованы для производства большого количества селеносодержащих белковых препаратов, так как они требуют одновременного участия в процессе синтеза матричной и транспортной РНК. В тоже время потребность создания лекарственных средств, содержащих селен, соединенный с белком, крайне велика. В последнее время создан ряд технологий, позволяющих получить селенопротеиновое органическое вещество из аминокислотных цепей, соединенных между собой ионами селена (Патент РФ на изобретение №2177323 - Селенопротеиновое органическое вещество, обладающее иммунокорригирующим действием). В этом патенте представлена технология получения in vitro молекулы селенопротеина.

Однако это изобретение не завершает саму технологию создания биологически и физиологически активных селенопротеиновых молекул, служащих матрицей для получения нового класса лекарственных селенопротеиновых веществ. Данная технология не предусматривает также возможность дополнительного насыщения молекулы протеина ионами селена, что не позволяет селенопротеину как лиганду обладать высокой энергетической активностью. Кроме того, не решена сама проблема внутримолекулярного селенирования протеиновой матрицы. В тоже время для получения активного лиганда - молекулы селенопротеина - необходимо применение наномолекулярной технологии с одновременным высокочастотным воздействием в целях селенирования внутренней поверхности самой молекулы.

Создание наномолекулярного селенопротеинового вещества в какой-то степени должно быть идентично синтезу селеносодержащих белков в микро- и макроорганизмах. Учитывая роль селена в регуляции разнообразных процессов - иммунотропных, метаболических и противоопухолевых, необходимо в самом технологическом процессе предусмотреть активное насыщение ионами селена самой селенопротеиновой матрицы.

Для решения поставленной задачи предлагается технология получения наномолекулярного селенопротеинового вещества, обладающего физиологическим действием селеносодержащих белков. Наномолекулярная селенопротеиновая матрица включает в себя низкомолекулярный компонент - протеин, полученный экстракцией из протеиносодержащего сырья органическими растворителями, а также ионы селена, полученные электролизом селеномочевины. Наряду с этим для осуществления внутримолекулярной селенизации белка необходимо ферментативное (Ноздрачев А.Д, ред. “Начала физиологии”., Изд. СПб 2001, с.892-893) расщепление самой молекулы на наночастицы с последующим добавлением ионов селена и применением сверхвысоких гигагерцовых частот.

Способ получения наномолекулярного селенопротеина осуществляется следующим образом (Фиг.1-3).

Первая стадия получения наномолекулярного селенопротеинового вещества (Фиг.1).

Синтез селенопротеиновой матрицы

В качестве исходного материала используют зеленую массу белковосодержащих растений, например злаковых, бобовых, листьев кукурузы и др., предварительно высушенных и измельченных. С помощью экстракции эфиром, этиловым спиртом или димексидом из полученного сырья извлекают растительный белок - протеин. Белковый экстракт выпаривают и производят лиофильную сушку; изготовленный порошок растворяют в 60-90%-ном этиловом спирте, после чего вводят селен, полученный термолизом селеномочевины, из расчета 10-12 мкг на 1 мл раствора и помещают смесь в электромагнитное (плотность потока мощности 5·10^-3 Вт/см²) синусоидальное высокочастотное поле 20-30 МГц на 5 минут. Полученная молекула селенопротеина представляет собой две полипептидные α- и β-цепи, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина; α-цепь состоит из остатков 20 аминокислот, β- из 29 аминокислот. Селен, полученный путем термолиза селеномочевины, входит в боковые алкильные радикалы аминокислот, соединяя некоторые звенья α- и/или β-цепей одной или двух соседних молекул протеина, тем самым дополнительно сшивая их (Фиг.1). Молярные соотношения протеина и селена 1:4.

Вторая стадия получения наномолекулярного селенопротеинового вещества (Фиг.2).

Получение наночастиц селенопротеиновой матрицы

На полученный селенопротеин воздействуют ферментом трипсином в разведении 1:1000 (из расчета 1/20 мл на 100 мл субстанции), который гидролизует связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот - в данном случае аргинина, входящего в α- и β-цепи протеина. Этот процесс сопровождается разделением молекулы селенопротеина на наноструктуры между двумя аминокислотами аргинина в α-цепи и разделением β-цепи на две структуры между глутамином и аргинином.

Третья стадия получения наномолекулярного селенопротеинового вещества (Фиг.3).

Синтез наночастиц селенопротеиновой матрицы в единую структуру с дополнительным обогащением белка ионами селена

К полученным наночастицам молекулы селенопротеина добавляют дополнительно еще 10-12 мкг селена, полученного путем термолиза селеномочевины, и данную смесь помещают в высокочастотное электромагнитное поле - 20-30 ГГц длительность на 5 минут при потоке мощности 5·10^-3 Вт/см². В полученной наномолекуле содержится 20-24 мкг селена и дополнительно две диселенидные связи - между двумя аминокислотами вверху и аминокислотами изолейцина и глутамина внизу. Молярные соотношения протеина и селена в наномолекулярной селенопротеиновой матрице 1:8.

Полученная наномолекула селенопротеина представляет собой две полипептидные α- и β-цепи протеина, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина, селеновыми связями между аминокислотами валином и лейцином, селеновой связью между глутаминовыми кислотами и двумя диселенидными связями между α- и β-цепью. При всех физиологических значениях рН наномолекула селенопротеина ионизирована. Заряженными являются С- и N-концевые группы и связанные с α-углеродными атомами боковые цепи, содержащие карбоксильную или аминогруппу (Фиг.3).

Согласно данным В.А.Тутельяна и др. (“Селен в организме человека”. М.: Изд. РАМ, 2002, с.11-45), все селеносодержащие белки, в том числе и полученный нами наномолекулярный селенопротеин, обладают активным иммунотропным и метаболическим действием. Исследования, проведенные в последнее время рядом ученых (А.В.Куприн, А.В.Скальный и др., в книге “Иммунофармакология микроэлементов”, Изд. КМК; М., 2000, с.14-61), показывают, что селен и селенопротеиновые соединения в организме человека и животных регулируют действие биотрансформирующих ферментов, активируют метаболизм гипофизарных и тиреоидных гормонов, а также снижают возможность появления различных иммунодефицитных процессов при опухолях, разнообразных аутоиммунных и аллергических заболеваниях, блокируют транскрипцию и репликацию вирусов СПИДа.

Изобретение относится к биофармакологии и касается получения средства, направленного на восстановление метаболических процессов и коррекцию функций иммунной системы. Способ получения наномолекулярного селенопротеина включает экстракцию протеина из белковосодержащего растительного сырья органическими растворителями с последующим добавлением селена, обработкой смеси в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле, затем трипсином, добавлением к образовавшимся наночастицам молекулы селенопротеина ионов селена в соотношении 1:8 и повторного выдерживания в высокочастотном электромагнитном поле 20-30 ГГц. Средство, полученное предложенным способом, обладает выраженным иммунотропным и метаболическим действием, не токсично, растворимо в воде и биологических жидкостях - крови, лимфе и ликворе. 1 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ получения наномолекулярного селенопротеина, обладающего корригирующим действием функций иммунной системы и метаболических процессов, характеризующийся тем, что протеин, полученный путем экстракции белковосодержащих растений органическими растворителями, лиофильно высушивают и далее растворяют в 60-90%-ном этиловом спирте и добавляют селен при молярном соотношении протеина и селена 1:4, затем смесь выдерживают в электромагнитном (плотность потока мощности 5·10^-3 Вт/см²) синусоидальном высокочастотном поле 20-30 МГц в течение 5 мин, полученную субстанцию обрабатывают трипсином, к образовавшимся наночастицам молекулы селенопротеина добавляют ионы селена, выдерживают в высокочастотном электромагнитном поле 20-30 ГГц в течение 5 мин при потоке мощности 5·10^-3 Вт/см², при этом молярное соотношение протеина и селена составляет 1:8, а полученная наномолекула селенопротеина представляет собой α- и β-цепи протеина, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина, селеновыми связями между аминокислотами валином и лейцином, а также между глутаминовыми кислотами и двумя диселенидными связями между α- и β-цепью, при этом наномолекула селенопротеина ионизирована при всех физиологических значениях рН, заряженными являются С- и N-концевые группы и связанные с α-углеродными атомами боковые цепи, содержащие карбоксильную или аминогруппы.2. Способ по п.1, где в качестве белковосодержащего растительного сырья используют злаковые и бобовые растения, листья кукурузы.3. Способ по п.1, где экстракцию белковосодержащих растений проводят эфиром, этиловым спиртом или димексидом.4. Способ по п.1, где субстанцию селенопротеина обрабатывают трипсином из расчета 1/20 мл фермента на 100 мл субстанции.