СЕЛЕНОВОЕ ФОСФОЛИПОГЛИКОПРОТЕИНОВОЕ ЭЛЕМЕНТ-ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ (ЕГО ВАРИАНТЫ) Российский патент 2001 года по МПК A61K33/04 A61K31/95 A61K35/78 A61P37/02 

Изобретение относится к области клеточной и молекулярной биологии, клинической и экспериментальной медицины, биологической химии, фармакологии и фармакодинамики, иммуно- фармакологии и может быть использовано в клинической практике для лечения различных заболеваний, сопровождающихся расстройствами модулирующей активности иммунной системы, проявляющейся нарушением единого интегративного процесса, в том числе клеточного (клеточно- опосредованного ответа) и гуморального (антитело-опосредованного ответа) иммунитета, а также изменением функции распознавания "свой - чужой" (М.М. Дейл, Дж. К. Формен в кн. Руководство по иммунофармакологии, М.: Медицина. 1998, стр. 1-14).

Как известно, при помощи иммунных реакций в первую очередь устраняется чужеродный (не свой) материал, который поступает в организм в виде опасных для жизни патогенных вирусов и микроорганизмов. Одновременно иммунный процесс направлен и на распознавание патологических изменений в тканях, происходящих вследствие мутационных нарушений. Поэтому иммунная защита в основном осуществляет обнаружение и удаление тех веществ, которые представляют существенную опасность для жизнедеятельности организма (Дж. Плейфэр в кн. Наглядная иммунология, М.: Медицина, 1999, стр. 40-41, 56-61).

В развитии иммуномодулирующей активности большую роль играют вторичные посредники, то есть такие вещества, которые оказывают непосредственное воздействие на клеточные мембраны, в том числе и на рецепторы, а также на различные гуморальные процессы. В настоящее время установлено, что в запуске иммуномодулирующего механизма важная роль принадлежит различным микро- и макроэлементам (биотикам), циклическому аденозинмонофосфату (цАМФ) и инозитолфосфату (ИФ₃) (И. Дудель в кн. Физиология человека, т. 1. М.: Мир, 1996, стр. 9-25).

Из биотиков наиболее важное значение принадлежит селену, который как выяснилось, оказывает настолько существенное воздействие на тканевые и клеточные компоненты иммунной системы, что без этого микроэлемента не осуществляется адекватная стимуляция лимфоцитарной и гистиоцитарной систем. Эффект селена в организме определяется его участием в функции клеточных мембран. Твердо установлено, что противоопухолевый эффект селена является высокоспецифичным и обусловлен не только антиоксидантной функцией этого микроэлемента.

Селен входит в состав субъединицы (27,5 Да) глутатионпероксидазы (Beckett et fl, 1991) форматдегидрогеназы, селенопротеинов Р/57-58 кДа) и W (300 Да); 14 кДа селенопротеина, связывающего жирные кислоты; селенопротеина спермы; Se-зависимой 5-дейодиназы 1 типа.

Недостаточность селена вызывает снижение активности селенозависимой дейодиназы в гипофизе, обеспечивающей биотрансформацию Т4 в Т3. Поскольку в гипофизе есть рецепторы лишь к Т3, то при дефиците селена начинает страдать обратная связь, регулирующая продукцию тиреотропного гормона (ТТГ). Гиперпродукция ТТГ при недостаточности селена становится причиной гиперплазии щитовидной железы.

При помощи селена и его соединений в организме осуществляется биосинтез иммуноглобулинов, особенно типа G; происходит коррекция клеточных компонентов иммунитета, возрастает количество хелперов (СД4) и уменьшается количество супрессоров (СД8), в связи с чем нормализуется индекс иммунорегуляции. Кроме того, активная роль селена и его органических соединений в осуществлении антиоксидантных процессов приводит к нормализации клеточного дыхания и восстановлению метаболически важных энергетических процессов.

Для поддержания функций иммунной системы в качестве микроэлемента селен вводят в комплексы витаминных препаратов, например Центрум (Справочник ВИДАЛЬ "Лекарственные препараты в России", М.: АстраФармСервис, 1997, стр. Б-654). Известны также селеносодержащие препараты, полученные на основе биомассы водорослей (патент 2203043, 1988 или патент RU 2096037), обладающие общетонизирующим действием, реализация которого связана с активным воздействием на иммунную систему соединений селена, однако указанные препараты имеют недостаточно высокое содержание органического селена, а технология их получения сложна и требует длительного времени.

В патенте (RU 2138271 C1, 1999), предложено средство ПСК (протеоселеновый комплекс), технология производства которого в определенной степени разрешала предыдущие трудности, однако идентификация структуры этого селенового органического вещества произведена не была.

Представленные сведения говорят о том, что современная технология получения препаратов нового класса, осуществляющих иммуномодулирующую активность, должна основываться на структуре и топологии присутствующих в организме активных биомолекул, представленных гликопротеинами, фосфолипидными и фосфолипопротеиновыми комплексами в сочетании с макро -и микроэлементами. Новые лекарственные средства по своему строению и механизму действия должны в определенной мере стереохимически, т.е. биологически и химически соответствовать тем веществам организма человека, которые непосредственно осуществляют иммуномодулирующий процесс.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента иммунотропных активирующих средств - создание селеновых фосфолипогликопротеиновых элемент-органических веществ (Se-ФЛГПЭОВ), введение которых в организм не сопровождается побочными последствиями и вызывает системный лечебный эффект, основанный на нормализации иммуномодулирующей активности в организме человека.

Для решения поставленной задачи предложено лекарственное вещество, обладающее иммуномодулирующим действием. Оно включает низкомолекулярный белковый компонент (полученный путем экстракции органическими растворителями с последующим высушиванием субстанции и растворением в 60-90%-ном спирте - селенорганическое вещество), с введением в него селена, полученного вследствие термолиза селеномочевины, органические углеводы и фосфолипиды, и разнообразные неорганические ионы: катионы кальция, магния и алюминия, анионы гидросульфита и гидрофосфата, дигидроортосиликатанионы в виде жидких растворов. Смесь подобных веществ помещают и выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле 20-30 МГц в течение 5 мин. Полученные разнообразные комплексные препараты названы селеновыми фосфолипогликопротеиновыми элемент-органическими веществами (Se-ФЛГПЭОВ). В 1 мл комплекса иммуномодулирующего средства содержится 30-40 мг субстанции, 6-12 мкг селена; содержание углеводов и фосфолипидов к селенопротеину составляет в молярном соотношении 5:1:1.

Сущность изобретения поясняется фиг. 1-6.

Получение селенофосфолипогликопротеина (SeФЛГП)
В качестве исходных продуктов используют зеленую массу белковосодержащих растений, например злаковых, бобовых, листья кукурузы и т.д. Зеленую массу предварительно высушивают и измельчают. Экстракцией из растительной массы извлекают протеин (растительный белок). В качестве экстрагентов используют этиловый спирт, диэтиловый эфир, димексид. Экстракт подвергают лиофильной сушке, после чего полученный протеиновый порошок растворяют в водном растворе этилового спирта (60-90%). В раствор вводят селен, полученный термолизом селеномочевины, из расчета 6-12 мкг на 1 мл раствора, углевод и фосфолипид при молярных соотношениях: протеин:селен:углевод:фосфолипид - 1:4:5:1. Молекулярная масса селенофосфолипогликопротеина - 6953. В качестве углевода использовали сахарозу, в качестве фосфолипида - фосфоглицерол. Синтез препарата осуществляют в электромагнитном высокочастотном поле (мощность 5•10^-3 Вт/см², частота 20-30 МГц) в течение 5 мин. Поле может быть создано, например, в сквидмагнитометрах, применяемых для магнитоэнцефалографии.

Молекула селенофосфолипогликопротеина (SеФЛГП) представляет собой две полипептидные альфа- и бета-цепи протеина, соединенные дисульфидным мостиком по остаткам цистеина (альфа-цепь состоит из остатков 20 аминокислот, бета - из остатков 29 аминокислот) (фиг. 1). Селен, введенный в протеин после термолиза селеномочевины, входит в боковые алкильные радикалы аминокислот, соединяя некоторые звенья альфа-и/или бета-цепей одной или соседних молекул протеина, тем самым дополнительно "сшивая" их. К селенопротеину через концевые карбоксильные группы альфа- и бета- цепей и, возможно, боковые карбоксильные группы присоединен фосфоглицерол, через остатки основных аминокислот серина и/или тирозина посредством О-гликозидных связей и/или, возможно, к фосфоглицеролу через фосфоэфирную связь присоединена сахароза (фиг. 1). При всех физиологических значениях pH селенофосфолипогликопротеин ионизирован. Заряженными являются C- и N-концевые группы и связанные с α-углеродными атомами боковые цепи, содержащие карбоксильную (- COO^-) или аминогруппу (-NH₃ ⁺) (фиг. 1).

При взаимодействии селенофосфолипогликопротеина с водными растворами солей возникают солевые связи между его (SeФЛГП) разноименными заряженными группами и различными катионами и анионами водных растворов. Катионы кальция, магния и алюминия присоединяются к карбоксильным группам (-COO^-) остатка глутаминовой кислоты и, возможно, пролина, анионы: гидро- и дигидроортосиликат, гидросульфит и гидрофосфат присоединяются к аминогруппам (-NHs) гистидина, аргинина и N-концевой группе к альфа- и бета- цепям одной или соседних молекул селенофосфолипогликопротеина.

1. Вещество кальция селенофосфолипогликопротеин (Ca²⁺-SeФЛГП)
Вещество включает ионизированный селенофосфолипогликопротеин (фиг. 1), к которому по карбоксильным группам (- COO^-) глутаминовой кислоты (и, возможно, пролина) присоединены катионы кальция (Ca²⁺) к альфа- и бета-цепям одной или соседних молекул SeФЛГП (фиг. 2). Молекулярная масса SeФЛГП - 7073. Молярные соотношения SeФЛГП:Ca²⁺ = 1:6.

2. Вещество кальция гидросульфит-селенофосфолипогликопротеин (Ca(HSO₃)₂-SeФЛГП)
Вещество включает ионизированный селенофосфолипогликопротеин (фиг. 1), к которому по карбоксильным группам глутаминовой кислоты (и, возможно, пролина) присоединены катионы кальция, по аминогруппам гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены гидросульфит-анионы (HSO₃ ^-) к α- и β- цепи SeФЛГП (фиг. 3).

Молекулярная масса Ca(HSO₃)₂SeФЛГП - 7721.

Молярные соотношения SeФЛГП:Ca²⁺:HSO₃ ^- = 1:6:8.

3. Вещество магния гидрофосфат-селенофосфолипогликопротеин (MgHPO₄-SeФЛГП)
Вещество включает ионизированный селенофосфолипогликопротеин (фиг. 1), к которому по карбоксильным группам глутаминовой кислоты присоединены катионы магния (Mg²⁺), по аминогруппам гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены гидрофосфат-анионы (HPO₄ ^2-) к альфа- и бета-цепям одной или соседних молекул SeФЛГП (фиг. 4). Молекулярная масса MgHPO₄-SeФЛГП - 7481. Молярные соотношения SeФЛГП:Mg²⁺: HPO₄ ^2- = 1:6:4.

4. Вещество алюминия селенофосфолипогликопротеин (Al³⁺-SeФЛГП)
Вещество включает ионизированный селенофосфолипогликопротеин (фиг. 1), к которому по карбоксильным группам глутаминовой кислоты присоединены катионы алюминия (Al³⁺) к альфа- и бета-цепям одной или соседних молекул SeФЛГП (фиг. 5). Молекулярная масса Al³⁺-SeФЛГП - 7061.

Молярные соотношения SeФЛГП:Al³⁺ = 1:4.

5. Вещество алюминия гидроортосиликат-селенофосфолипогликопротеин (AlHSiO₄-SeФЛГП)
Вещество включает ионизированный селенофосфолипогликопротеин (фиг. 1), к которому по карбоксильным группам глутаминовой кислоты присоединены катионы алюминия (Al³⁺), по аминогруппам гистидина, аргинина и N-концевой группе гидроортосиликат-анионы (HSiO₄ ^3-) к альфа- и бета-цепям одной или соседних молекул SeФЛГП (фиг. 6). Молекулярная масса AlHSiO₄-SeФЛГП - 7433.

Молярные соотношения SeФЛГП:Al³⁺:HSiO₄ ^3- - 1:4:4.

Примеры получения селеновых фосфолипогликопротеиновых элемент-органических веществ Se-ФЛГПЭОВ (солевые формы).

1. Способ получения кальция селенофосфолипогликопротеина.

К селенофосфолипогликопротеиновому комплексу (SeФЛГПК) добавляют необходимое количество водного раствора катионов кальция, полученного при предварительном электролизе ортосиликата кальция (молярное соотношение комплекса SeФЛГП к кальцию 1:6). Подобную смесь выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле с частотой 20-30 МГц.

2. Способ получения кальция-гидросульфит-селенофосфолипогликопротеина.

К SeФЛГПК добавляют необходимое количество гидросульфита кальция, подвергнутого предварительно электролизу (молярные соотношения SeФЛГПК к кальцию 1: 6 и к анионам HSO₃ - 1:8). Подобную смесь выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле с частотой 20-30 МГц.

3. Способ получения магния гидрофосфат-селенофосфолипогликопротеина.

К SeФЛГПК добавляют необходимое количество ионов магния, полученных при электролизе глицерофосфата магния и гидрофосфат-анионы, полученные при электролизе гидрофосфата кальция (молярное соотношение SeФЛГПК к магнию 1:6 и к гидрофосфат-анионам - 1: 4). Подобную смесь выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле с частотой 20-30 МГц.

4. Способ получения алюминия селенофосфолипогликопротеина.

К SeФЛГПК добавляют необходимое количество водного раствора катионов алюминия, полученных при электролизе сульфата алюминия (молярное соотношение SeФЛГПК к алюминию 1:4). Подобную смесь выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле с частотой 20-30 МГц.

5. Способ получения алюминия гидроортосиликат-селенофосфолипогликопротеина.

К SeФЛГПК добавляют определенное количество водного раствора катионов алюминия, полученных при электролизе сульфата алюминия, и необходимое количество гидроортосиликат-анионов, полученных при электролизе гидроортосиликата кальция (молярное соотношение SeФЛГПК к алюминию 1:4 и к гидроортосиликат-аниону - 1:4). Подобную смесь выдерживают в электромагнитном синусоидальном высокочастотном поле с частотой 20-30 МГц.

Se-ФЛГПЭОВ представляет собой асимметрическую белковую молекулу с альфа-спиралью и бета-структурой. Гидрофобный конец молекулы Se-ФЛГПЭОВ переходит в альфа-спираль, бета-структура молекулы Se-ФЛГПЭОВ извита соответствующим образом и внутренние стороны аминокислотных цепочек соединены селенидными и дисульфидными связями, обеспечивающими пространственную устойчивость и в то же время гибкость данной молекулы.

В состав всей молекулы Se-ФЛГПЭОВ входит 15 аминокислот. Соответственно описанной технологии могут быть получены молекулы лекарственного вещества с различным числом аминокислот с относительно низким молекулярным весом.

Острую токсичность препарата исследовали при внутрибрюшинном введении Se-ФЛГПЭОВ в дозе 250 мг/кг мышам (возраст 6 недель, вес 28-30 г). Значение ЛД составило 700 мг/кг.

При исследовании общей токсичности мышам вводили Se-ФЛГПЭОВ в дозе 100 мг/кг в день внутрибрюшинно непрерывно в течение 10 дней. Снижение веса и каких-либо других нарушений при этом не наблюдали, в последующем, при наблюдении этих мышей в течение трех месяцев отклонений от нормы не выявлено.

В результате проведенных исследований установлено, что Se-ФЛГПЭОВ обладает иммуномодулирующим действием, не токсичен, полностью растворим в воде и биологических жидкостях - крови, лимфе и ликворе. В 1 мл Se-ФЛГПЭОВ содержится, в зависимости от количества аминокислот в лиганде, от 30 до 40 мг субстанции и 6- 12 мкг селена.

Доза вводимого препарата зависит от клинического состояния больного, его возраста, веса, а также способа введения. Эффективная терапевтическая суточная доза для больного составляет от 6 до 150 мг активного вещества, которое вводят одномоментно или дробно.

Способ модулирующей функции иммунной системы осуществляют следующим образом.

Полученный препарат Se-ФЛГПЭОВ представляет собой раствор активного вещества в 60 - 90%-ном спирте, 1 мл которого содержит 30-40 мг лекарственной субстанции. Se-ФЛГПЭОВ вводят перорально, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, а также наружно в виде суспензии в масляном растворе или в виде мази с масляно-спиртовым наполнителем.

При пероральном введении необходимую дозу рассчитывают следующим образом:
в 20 каплях раствора содержится 30-40 мг лекарственной субстанции;
в 10 каплях (1/2 мл) содержится 15-20 мг препарата;
в 5 каплях (1/4 мл) содержится 7,5-10 мг препарата;
в 3 каплях (1/7 мл) содержится 4,3-5,7 мг препарата.

При внутримышечном, внутривенном или внутриартериальном введении препарат растворяют в физиологическом растворе для лучшей диссоциации в соотношении 1:10 при использовании 60%-ного спирта или 1:15 при 90%-ном спирте.

Например: детям до 6 лет при клинической патологии средней степени тяжести препарат вводят однократно в виде инъекции от 0,1 до 0,5 мл в день, при тяжелой степени патологии указанную дозу вводят два раза в день. При проведении интенсивной терапии препарат вводят внутримышечно или внутривенно (внутриартериально) по 1,0 -2,0 мл соответственно с добавлением 10 или 20 мл физиологического раствора. В случае перорального введения в зависимости от возраста, веса и степени поражения - от 0,5 до 3,0 мл, причем препарат растворяют в 1/3 стакана кипяченой, слегка теплой воды (36-38^oC).

Длительность лечения может колебаться от 1 до 3 месяцев, в случае тяжело протекающей патологии курс лечения повторяют с интервалом 1-2 месяца до выраженного клинического эффекта. В период проведения лечения контролируют иммунологический статус больного по развернутой клинической формуле и иммунограмме.

После применения селеновых фосфолипогликопротеиновых элемент-органических веществ обычно доминирует иммунная активность - Т-хелперы всегда превышают количество супрессорных клеток (индекс иммунорегуляции - 1,5-2). Синхронно с этим активируется производство интерлейкинов, молекул адгезии и киллерных клеток, что прямо указывает на иммуномодулирующую активность действия этих веществ. Селеновые фосфолипогликопротеиновые элемент- органические вещества Se-ФЛГПЭОВ (солевые формы) вызывают системный иммунотропный эффект, основанный на активации клеточных и гуморальных защитных реакций, в том числе главный механизм иммуномодулирующей активности - распознавание чужеродного антигена ("свой-чужой").

Изобретение относится к клинической и экспериментальной медицине и может быть использовано в клинической практике для лечения заболеваний, сопровождающихся расстройствами модулирующей активности иммунной системы. Сущностью изобретения являются селеновые фосфолипогликопротеиновые элемент-органические вещества, включающие низкомолекулярный белковый компонент, селен, органические углеводы и фосфолипиды, неорганические ионы; катионы кальция, магния и алюминия, а также гидросульфит-, гидрофосфат- и дигидроортосиликат анионы. Техническим результатом является активация клеточных и гуморальных защитных реакций. 5 с.п. ф-лы, 6 ил.

1. Селенопротеиновый препарат, обладающий иммуномодулирующим действием на основе протеоселена, отличающийся тем, что содержит селенопротеин, представляющий собой две полипептидные α- и β-цепи протеина растительного происхождения, в боковые алкильные радикалы которых введен селен, полипептидные цепи соединены также дисульфидным мостиком по остаткам цистеина, причем α-цепь состоит из остатков 20 аминокислот, β-цепь 29 аминокислот, при этом селенопротеин через концевые карбоксильные группы α- и β-цепей и возможно боковые карбоксильные группы соединен с фосфоглицеролом через остатки основных аминокислот серина и/или тирозина посредством O-гликозидных связей и/или к фосфоглицеролу через фосфоэфирную связь присоединена сахароза при молярных соотношениях протеин : селен : углевод : фосфолипид - 1:4:5:1 (фиг. 1) и получен под действием синусоидального электромагнитного поля с плотностью потока мощности 5•10^-3 Вт/см² при частоте 20-30 МГц. 2. Селенопротеиновый препарат, обладающий иммуномодулирующим действием на основе селенопротеина, отличающийся тем, что препарат содержит селенофосфолипогликопротеин (SеФЛГП), охарактеризованный в п.1, к которому по карбоксильным группам (-СОО^-) глутаминовой кислоты к α- и/или β-цепям селенофосфолипогликопротеина присоединены катионы кальция (Са²⁺) при молярном соотношении SеФЛГП:Са²⁺ - 1:6 (фиг.2) или катионы алюминия (Al³⁺) при молярном соотношении SеФЛГП:Al³⁺ - 1:4 (фиг.5). 3. Селенопротеиновый препарат, обладающий иммуномодулирующим действием на основе селенопротеина, отличающийся тем, что препарат содержит селенофосфолипогликопротеин (SeФЛГП), охарактеризованный в п.1, к которому по карбоксильным группам (-СОО^-) глутаминовой кислоты (возможно пролина) присоединены катионы кальция (Са²⁺), по аминогруппам (-NН₃ ⁺) гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены гидросульфит-анионы (HSO₃ ^-) к α- и β-цепи селенофосфолипогликопротеина при их молярном соотношении SеФЛГП:Са²⁺:НSO₃ ^- - 1:6:8 (фиг.3). 4. Селенопротеиновый препарат, обладающий иммуномодулирующим действием на основе селенопротеина, отличающийся тем, что препарат содержит селенофосфолипогликопротеин (SеФЛГП), охарактеризованный в п.1, к которому по карбоксильным группам (-СОО^-) глутаминовой кислоты присоединены катионы магния (Mg²⁺), по аминогруппам (-NH₃ ⁺) гистидина, аргинина и N-концевой группе присоединены гидрофосфат - анионы (НРO₄ ^2-) к α- и/или β-цепям SеФЛГП при молярном соотношении SеФЛГП:Mg²⁺:HPO₄ ^2- - 1:6:4 (фиг.4). 5. Селенопротеиновый препарат, обладающий иммуномодулирующим действием на основе селенопротеина, отличающийся тем, что препарат содержит селенофосфолипогликопротеин (SеФЛГП), охарактеризованный в п.1, к которому по карбоксильным группам (-СОО^-) глутаминовой кислоты присоединены катионы алюминия (Al³⁺), по аминогруппам (-NH₃ ⁺) гистидина, аргинина и N-концевой группе гидроортосиликатанионы (HSiO₄ ^3-) к α- и/или β-цепи SеФЛГП при молярном соотношении SеФЛГП:Al³⁺:HSiO₄ ^3- - 1:4:4 (фиг.6).