ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS ДЛЯ СКВАШИВАНИЯ МОЛОКА В ПРОЦЕССЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ВКЛЮЧАЯ ЙОГУРТЫ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 

Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности и касается молочнокислых бактерий (МКБ), в частности Streptococcus thennophilus, которые используют в качестве закваски при получении кисломолочных продуктов, в том числе йогуртов, обычно в сочетании с культурами болгарской палочки. При этом предусматривается раздельное производство заквасок термофильного молочнокислого стрептококка и болгарской палочки [1]. Бактерии S. thennophilus традиционно используют как составную часть закваски, в основном действующую на первичных этапах технологического процесса [2]. Максимальная скорость роста клеток S.thennophilus в молоке (или иначе - минимальное время удвоения), тестируемая по скорости его сквашивания, часто является определяющей при выборе штаммов для закваски [3]. Время удвоения штамма характеризует темп деления клеток в благоприятных условиях логарифмической стадии роста. По окончании логарифмической стадии наступает период лимитации роста клеточной популяции в связи с возрастающей плотностью клеточной массы и увеличением кислотности среды. Уровень накопления биомассы в это время определяется как количеством клеток, образовавшихся в течение логарифмической стадии, так и их способностью продолжать делиться в неблагоприятных условиях.

Таким образом, можно выделить два различных свойства штамма:

- скорость и продолжительность роста клеточной популяции на логарифмической стадии, характеризующиеся минимальным временем удвоения клеток;

- способность продолжать делиться на стадии лимитации роста, т.е. в неблагоприятных условиях, отражающаяся в общем количестве накопленной биомассы.

В зависимости от их генетической природы бактерии S.thennophilus обладают разной устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды. Имеются сведения об использовании при производстве кисломолочных продуктов термоустойчивых (до t=42°C) заквасок, включающих штаммы S. thennophilus [4, 5]. Штамм для производства творога Streptococcus (современное название Lactococcus) lactis subsp.cremoris [6] способен расти при температуре до 47°С. Существенной характеристикой производственного штамма является его кислотоустойчивость, поскольку некоторые используемые в составе поликомпонентных заквасок штаммы обладают высокой кислотообразующей способностью [7]. Наличие в составе закваски бактерий, генетический аппарат которых обеспечивает устойчивость к различным стрессовым воздействиям, позволяет сделать технологический процесс более стабильным.

Штаммы бактерий вида S.thermophilus в современном производстве используют в составе поликомпонентных [8] заквасок. С целью повышения эффективности и надежности производственного процесса сквашивания молока объединяемые в закваске штаммы подбирают таким образом, чтобы их технологически значимые свойства были взаимодополняемыми.

Вопросы устойчивости клеток бактериальной закваски к неблагоприятным факторам, а именно ингибиторам роста и сезонным изменениям состава молока, были рассмотрены ранее [9]. Устойчивые штаммы традиционно характеризовали по способности образовывать вязкие сгустки.

В настоящей работе мы используем другой подход и характеризуем устойчивость штамма к неблагоприятным воздействиям по количеству биомассы, накапливаемой за период времени, включающий стадию лимитации роста.

В качестве ближайшего аналога заявляемого штамма рассмотрим производственный штамм S.thermophilus ST 18 [10]. Он, как другие штаммы МКБ видов S.thermophilus и L.lactis subsp.lactis [10, 11], способен расщеплять бета-казеин и имеет две фазы логарифмической стадии роста в молоке. Уровень накопления биомассы за 5,5-6 часов инкубации в молоке, включая стадию лимитации роста, близок 10⁹ кл/мл и при дальнейшей инкубации не превышает этого значения [10].

Задача заявляемого изобретения - получить без применения мутагенов и генетических манипуляций бактериальный штамм S.thermophilus, устойчивый к воздействию ряда неблагоприятных факторов, имеющих место при проведении технологического процесса сквашивания молока.

Задача решена путем получения штамма S.thermophilus, имеющего повышенную жизнеспособность в условиях дефицита питательных компонентов среды, обладающего уровнем накопления биомассы 1,3·10⁹ кл/мл через 24 часа инкубирования в молоке, устойчивого к воздействию температуры до 50°С, а также закислению среды до значения рН 5,0 на стадии логарифмического роста.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет номер ВКПМ В-9587.

Заявляемый штамм получен из штамма S. thermophilus ВС 104 [12] в результате многоступенчатой селекции в условиях повышенной до 50°С температуры.

Штамм S.thermophilus ВКПМ В-9587 имеет следующие характеристики:

1. Культурально-морфологические признаки. Факультативный анаэроб. Грамположительные кокки величиной 0,7-1,0 мкм, неподвижные, располагаются преимущественно попарно, встречаются цепочки кокков средней длины. Клетки овальные, неподвижные, эндоспор не образует. На поверхности агаризованных сред МА4, МА6 и МА20 (табл.1) через 24 часа при 37-42°С образует белые, выпуклые, гладкие колонии с ровными краями.

2. Физиолого-биохимические свойства. Образование молочного сгустка происходит через 6 часов инкубирования при 37°С, приводя к закислению среды до значения рН 4,5-4,7, а через 24 часа до значения 3,9-4,0. Штамм сбраживает глюкозу и лактозу, растет при 50°С.

3. Поддержание штамма ведут путем еженедельного пересева на агаризованной среде МА6.

4. Хранение штамма осуществляют в лиофилизированном виде или при -20°С в физиологическом растворе, содержащем 40% глицерина.

5. Видовая принадлежность бактерий заявляемого штамма S.thermophilus ВКПМ В-9587 определена путем секвенирования 16S рРНК.

6. Среды для оценки технологически значимых свойств штаммов МКБ. Использовали молоко, а также среды МА6, МВ6 и МА20 (табл.1), являющиеся аналогами среды М21 [12, 13], широко применяемой для культивирования МКБ, и приближенные по составу к молоку среды МА4, М4 [14].

Таблица 1
Состав питательных сред (мас.%)Название питательных компонентовНазвание питательных средМА4МА6МА20М4МВ6Пептон из казеина0,40,4 0,40,4Пептон из мяса  0,4  Дрожжевой экстракт 0,40,4 0,4Мясной экстракт 0,40,4 0,4Лактоза0,40,50,50,40,5Агар1,551,551,55  Na₂HPO₄0,850,850,85 0,85КН₂PO₄0,20,20,2 0,2ВодаОстальное

7. Отбор контрольных штаммов. Для более объективной характеристики свойств заявляемого штамма использованы контроли. Из группы штаммов S. thermophilus АТСС19258 [15], St 47 [16], ВС 103, ВС 113, ВС 128, ВС 130, ВС 131 [12] в качестве контрольных выбраны штаммы ВС 103 и ВС 113, далее обозначаемые ВКПМ В-9588 и ВКПМ В-9589 соответственно, из которых первый отличается минимальным временем удвоения, а второй - наиболее коротким временем сквашивания молока.

8. Пример 1. Ростовые характеристики заявляемого штамма

Время удвоения штамма ВКПМ В-9587 в сравнении с контрольными штаммами ВКПМ В-9588 и ВКПМ В-9589 определяли на второй фазе логарифмической стадии роста, которая начинается с 3,5 час инкубирования в молоке [10]. Посевной материал (10 мкл), представляющий собой ночную культуру бактерий, выращенную при 37°С в 3 мл 0,5% молока «Домик в деревне», засевали в пробирки, содержащие 3 мл того же молока до конечной концентрации 10⁶ кл/мл и инкубировали при температуре 37°С. Замеры титра клеток делали через 3,5 и 4,5 часами инкубирования (табл.2). Титр клеток определяли путем подсчета числа колоний, выросших через 24 часа после высева бактериальной суспензии на чашки Петри со средой МА6. Время удвоения на логарифмической стадии роста заявляемого штамма ВКПМ В-9587 (36 мин) больше, чем у контрольных (ВКПМ В-9588-17 мин, ВКПМ В-9589-30 мин) и у ближайшего аналога (ST 18-27,3 мин).

Уровень накопления биомассы штаммом ВКПМ В-9587 через 24 часа инкубирования в молоке в тех же условиях составляет 1,3·10⁹ кл/мл, что превышает значение этого параметра у ближайшего аналога [5] и контрольного штамма ВКПМ В-9588.

Таблица 2
Уровень накопления биомассы штаммов S.thermophilus в молокеНомера штаммов S.thermophilusТитр кл/мл 3,5 часТитр кл/мл 4,5 часТитр кл/мл 24 часВКПМ В-95871,2·10⁸4,0·10⁸1,3·10⁹ВКПМ В-95881,3·10⁸9,4·10⁸6,6·10⁸ВКПМ В-95892,5·10⁸1,0·10⁹1,8·10⁹

В условиях нашего эксперимента между 4,5 часами (время, близкое к началу стадии лимитации роста) и 24 часами (время, заведомо превышающее переход клеточной популяции в стационарную стадию) титр бактерий заявляемого штамма увеличился в 3,5 раза, штамма ВКПМ В-9589 - в 1,8 раза, а штамма ВКПМ В-9588 упал в 0,7 раза (табл.2). Из этого следует, что в неблагоприятных условиях роста при высокой плотности популяции заявляемый штамм имеет преимущество перед обоими контрольными, так как не только продолжает делиться после 4,5 часов, но и накапливает за время лимитации роста большее количество клеток, чем контрольный штамм ВКПМ В-9589.

Пример 2. Двухфазный рост модельного объекта МКБ Lactococcus lactis subsp.lactis на приближенной по составу к молоку минимальной питательной среде М4

В молоке стадия логарифмического роста S. thermophilus [10] и L. lactis [11] состоит из двух фаз. В среде МВВР [13], содержащей, как и молоко, в качестве источника азота свободные олигопептиды (пептон из казеина), наличие аналогичных двух фаз показано на бактериях L. lactis (штамм ТВ2). В связи с тем, что штамм ТВ2 не является типичным для бактерий L. lactis [13], в настоящей работе в качестве модельного использован штамм L. lactis subsp. lactis ВКПМ В-9590 [18]. В этом примере бактерии выращивали в минимальной питательной среде М4 (табл.1), которая в качестве источника азота содержит свободные олигопептиды, а в качестве источника углерода, как и молоко, - лактозу (в отличие от среды МВВР, содержащей глюкозу). Для получения посевного материала культуру штамма ВКПМ В 9590 инкубировали в течение 19 часов на среде МА4, представляющей собой агаризованный вариант среды М4. Затем собирали микробиологической петлей в 1 мл физиологического раствора, концентрировали при помощи центрифугирования в 15 мкл такого же раствора и добавляли в количестве 10 мкл в 5 мл среды М4 до конечной концентрации 6,4·10⁶ кл/мл. Через 1 час инкубирования при 37°С титр клеток вырос в среднем (на основании 4 независимых опытов) в 2,6 раза, что соответствует времени удвоения 46 мин. При дальнейшем инкубировании в течение второго часа темп деления бактерий замедлился, титр клеток в среднем вырос в 1,95 раз, время удвоения составило 62 мин. На этом закончилась первая фаза роста, не требующая включения генов протеолитической активности. Далее наблюдали рост клеточной популяции, соответствующий логарифмической стадии (время удвоения от 60 до 40 мин, что соответствует известным данным о скорости репликации ДНК [19] в условиях логарифмической стадии роста бактерий). Таким образом, среда М4 так же, как и молоко, обеспечивает двухфазный рост МКБ. Ее агаризованный вариант - среда МА4 (табл.1), имеющая ту же концентрацию питательных веществ, в дальнейшем (пример 4) использована для характеристики морфогенеза колоний заявляемого штамма.

Пример 3. Устойчивость заявляемого штамма к повышению кислотности среды

Процесс сквашивания молока сопряжен с повышением кислотности среды, то есть понижением значения рН. В связи с этим, устойчивость к понижению значения рН используемых в составе закваски бактерий в период их логарифмического роста является важной технологической характеристикой. Условия, близкие к начальной стадии кислотной коагуляции казеина [20] в процессе сквашивания, смоделированы путем добавления 100 мкл желудочного сока («ЭКВИН» ГУП «Иммунопрепарат») в 1 мл среды МВ6 (табл.1), что приводило к понижению рН до значения, близкого к 5,0. В пробах без добавления желудочного сока титр бактерий заявляемого ВКПМ В-9587 и контрольных ВКПМ В-9588 и ВКПМ В-9589 штаммов определяли сразу после добавления посевного материала в 5 мл среды МВ6, а также после 3,5 и 4,5 часов инкубирования при 37°С. Для определения влияния желудочного сока к пробам бактериальной суспензии объемом 1 мл после 3,5 часов их роста в среде МВ6 добавляли 100 мкл желудочного сока (Ж/С) и продолжали инкубировать еще в течение 1 часа. Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что в присутствии желудочного сока титр контрольных штаммов в течение анализируемого периода времени упал в два раза, а заявляемого - увеличился в 1,9 раза. Время удвоения заявляемого штамма в неблагоприятных условиях повышенной кислотности составило 63 мин и соответствовало нормальному темпу клеточного деления. В соответствующих пробах без добавления желудочного сока клетки всех трех штаммов на том же временном отрезке инкубирования интенсивно делились (время удвоения у заявляемого штамма - 24 мин, а у контрольных - 21 мин). Выявленная устойчивость клеток заявляемого штамма к повышенной кислотности среды в процессе активного роста дает ему технологическое преимущество по сравнению с контрольными, позволяя осуществлять процесс сквашивания молока в условиях, являющихся критическими для других штаммов.

Таблица 3
Титр бактерий штамма ВКПМ В-1111 в присутствии желудочного сокаНомера штаммов S.thermophilusТитр клеток (кл/мл)Контроль (МВ6)Опыт (МВ6+Ж/С)0 час3,5 час4,5 часс 3,5 до 4,5 часВКПМ В-95872,6·10⁶3,2·10⁷1,6·10⁸6,1·10⁷ВКПМ В-95881,6·10⁶5,4·10⁷3,1·10⁸2,5·10⁷ВКПМ В-95893,6·10⁶1,4·10⁸8,0·10⁸6,6·10⁷

Пример 4. Определение жизнеспособности заявляемого штамма в процессе длительного культивирования

Бактерии заявляемого ВКПМ В-9587 и контрольного ВКПМ В-9588 штаммов выращивали в течение 24 часов при 37°С после посева штрихом на чашки Петри с обогащенной агаризованной средой МА20. Из выросшей биомассы каждого штамма готовили бактериальную суспензию и разводили ее таким образом, чтобы при высеве на поверхность минимальной агаризованной среды МА4 можно было наблюдать сопоставимое количество отдельных колоний сравниваемых штаммов на одной чашке.

После длительного (в течение 96 часов) инкубирования при 37°С средняя площадь колоний заявляемого штамма превосходила таковую у контрольного штамма (2 и 0,5 мм² соответственно). Это подтверждает способность заявляемого штамма ВКПМ В-9587 накапливать большее количество биомассы в условиях минимального состава питательной среды и длительного инкубирования.

Свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в составе поликомпонентной закваски, так как при неблагоприятных условиях (понижении рН среды, повышении температуры, а также постепенного обеднения состава питательной среды по мере протекания технологического процесса) он способен осуществлять сквашивание молока. Повышенная жизнеспособность бактерий позволяет повысить содержание живых клеток в получаемом кисломолочном продукте [21].

Источники информации

1. SU 1750592.

2. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. 1999. - 415 с.

3. SU 1461759.

4. RU 2218793.

5. RU 2109455.

6. SU 1705340.

7. SU 1731141.

8. RU 2218793.

9. SU 1730142.

10. Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.68. P.3162-3165.

11. Appl. Environ. Microbiol. 1995. V.61. P.3024-3030.

12. Биохимия. 2007. №6 (в печати).

13. Микробиология. 2006. Т.75. №1. С.1-9.

14. Тезисы конференции: Генетика микроорганизмов и биотехнология. Москва - Пущине. 2006. С.65.

15. International Journal of Systematic Bacteriology. 1999. V.49. P.759-767.

16. App. Environ. Microbiol. V.63. N.8. P.3246-3253.

17. RU 2244002.

18. Антибиотики и химиотерапия, 1988. №3. С.203-210.

19. BioEssays. 1994. V.16. P.13-22.

20. SU 404459.

21. RU 2088660.

Штамм молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus ВКПМ В-9587 получен из штамма S. thermophilus BC 104 в результате многоступенчатой селекции в условиях повышенной температуры. Свойства штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в составе поликомпонентной закваски, так как при неблагоприятных условиях - понижении рН среды, повышении температуры, а также постепенного обеднения состава питательной среды по мере протекания технологического процесса, он способен осуществлять сквашивание молока. Изобретение обеспечивает повышенную жизнеспособность штамма при неблагоприятных условиях культивирования. 3 табл.

Штамм бактерий Streptococcus thermophilus ВКПМ В-9587 для сквашивания молока в процессе приготовления кисломолочных продуктов, включая йогурты.