Штамм культивируемых клеток мака PapaVeR SомNIFеRUм,используемый для получения алкалоидов Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K35/78 

IПД 7 /192

И tiifiprTi HUf (1ТЧ(1Г11Тгя к биотохн(1-питятрльную срелу, рячлитую по 20 и

Л М ИИ и можот г-ыть игп( ЛЬ1пп,т11о п ме-( мл в биологичргкис гтрпГ Ирки и кил/ппипи-кой г рпм1,п11.чг1М1(м-ти дня получр-f bi мя 250 нл. Сррдя имеет следующий

ПИЯ Onnjun tMe с ки яктиниых пещестп., состяр, г/л:

Ислмо ичоОретония япляется получе-NH,NO, 1Н5-1Я50

иис штлмма культмнирусмьгх клеток мякаKNO, 1 90-2100

P;ip,Tver somtii f ervim, продуцирующего(хЯС1, 2Н,0 420-500

мгффинопыг ллкалоил и растущего какMp.SO 7HjO 350-ДОО

п жидкой, ГПК и па тпгрдоО питатель-10 KUjPO 150-210

ных сре-длх.И,ВО, 4,2-8,0

Штамм Tapaver Sdmnifenim PS 5 по-MnSO H O 13,6-26,7

лучгн п Институте фичиолог ии растенийZnSO 7Н,0 6,0-10,30

им. К.Л. Тимирязепа и хранится в Спе- - 0,53-0,90

ииаличиропаиной коллекции культиви- 5 NajMoO -2H O 0,15-0,30

рурмьк клеток иыстргх растений данногоCiiSO 0,03-0,075

института лсд номером ВСКК(ВР) № А иСоСЦ 0,03-0,075

характеризуется следук1П1Ими признаками.ЬеЯ04 /п,0 25,00-30,00

Морфологические признаки. БиомассаNaJЭДTЛ 26, 10-40,tO спетло-кремового цвета состоит из20 пиридоксин 0,5-1,0; никотиновая кис- клеток со средним диаметром 118,0+лота 0,5-1,0; тиамин 0,05-0,15; инозит + 0,2|м, пределы варьиропсзния 60-530/и.80-120; гидролизат казеина 800-1200; Штамм представлен двумя типами клеток:2,4-Л 0,05-0,15; кинетин 0,05-0,15;

клетки меристематического типа -ДЭДТК 4-5; сахароза 2-5; агар-агар

округлые, реже вытпнутые, ядра пра-25 пластинчатый отечественный 0,6-0,8%.

пильных очертаний, интенсивно окра-рН среды 5,6-5,8. шиваются, ядрытки (одно или два) не

всегда выражены, густая цитоплазма... „. ,в

Штамм выращивают при 26+1 С в темсодержит зерна крахмала:х-, -, „

ноте, при влажности 67+3. Продолжиклетки паренхимного типа - более30

тельность цикла выращивания составля- крупн.гх размеров, с меньшим ядерноет 21 сут., по истечении этого срока

плазменным отношением, стенки утолще-, - - . ,биомасса уведичивается по сырой массе

ны, рыхлая цитоппазма содержит боль- п . i

в среднем в 8-12 раз. Ее отделяют от ШУЮ вакуоль.

„среды и для последующего определения

Физиологические признаки. Биомасса, содержания алкалоидов высушивают способна к росту на твердой (агаризо-„пи комнатной температуре. ванной) и в жидкой среде. При поверхностном рыращивамии индекс роста зас целью качественного и количест- 21 сут. выращивания составляет 8-12венного определения содержания алка- (по сырой массе), при этом штамм про- о доидов, образуемых щтаммом PS 5, ис- дуцирует алкалоиды: наркотин, кодеин,пользуют комбинацию тонкослойной И морфин, папаверин. Преобладает нарко-газожидкостной хроматографии. Анализ тин. При глубинном выращивании индексалкалоидной фрак.у1и проводят следую- роста за 12 сут. выращивания состав-,ц„„ образом. Точную навеску воздутано- ляет 13-17 (по числу клеток), при.. ухой массы (1,5-2,0 г) трижды экстра- этом штамм продуцирует алкалоиды: ко-гируют смесью хлороформ-изопропанол- деин, протопин, сангвинарин. Околоэтанол-аммиак (6:2:1,5:0,5). Объеди- 907. алколоидов выделяются в среду.ценные зкстракты упаривают досуха,

Митотический индекс в суспензион- у ой остаток растворяют в диэтиловом

ной культуре достигает максимума на „ экстрагируют раствором

10-12 сут. и в .разных пассажах можетH SO-. Кислую фракцию подщелачивают

колебаться от 1,5 до 5,5%. , до рН 9,0. Операцию повторяют

Число живых клеток 78%.и свободные основания алкалоидов

Использование штамма PS 5 нллюст-экстрагируют смесью хлористый метилен

рируется следук дими примерами. метанол (3:1), упаривают, затем сухой

Пример 1. Каллусияя массаостаток растворяют в смеси хлорофорPS 5 высаживается стерильно из расче-ма с иэопропанолом (3:1) и анализита 30 г сырой магсы ткани на 1 лpyniT. Результаты анализа представлены

(рс ;и.1 на стерильную агаризоианнуюв табл. 1.

Т а б л I

Пример 2. Для получения суспензионной культуры штамма PS 5 10 мл клеточной суспензии плотностью 5-6 10 кл/мл добавляют в 50 мл среды следующего состава, г/л:

O

750-900 900-1000 180-260 135-235 60-110 2,5-3,7 10,0-13,0 3,5-5,1 0,3-0,5 0,05-0,20 0,005-0,05 0,005-0,05 13,0-15,0 17,0-19,5

пирмдоксин 0,5-16; никотиновая кислота 0,5-1,0; тиамин 0,05-0,15; инозит 80-120; гидролизат казеина 800-1200; 2,4-Д 0,05-0,5; ЛЗДТК 4,0-5,0; сахароза 2-5. рН среды 5,6-5,8.

Вырашивание проводят при 26±1 С в темноте, при влажности , цикл выращивания составляет 12-14 суток, биомасса штамма за этот период увеличивается в среднем в 15 раз.

Затем биомассу отделяют от питательной среды фильтрованием на бумаге высушивают при комнатной температуре с применением вакуума. Точную навеску (1-1,5 г) воздушно-сухой измельченной ткани экстрагируют при комнатной температуре и перемешивании в 15%-ной уксусной кислоте (1:50 мае./объем). Экстракцию повторяют дважды в течение 30 и 60 мин. К объединенному фильтрату лобав;1яют смесь хлорО(юрм:метанол (4:1), рИ водной фазы доводят до 9,5

10

15

10,0 кониснтрироплмиь м рлп порем ам- миака при пррем миии,;111ии и иг нмчтыпаю- ще экстрагируют смесью хлорпф -)рм:ме- танол (li: 1) ,

Об-ьединениые хлорс)формио-метлноль- ныс экстракты упарипают досуха под вакуумом при 40-50 С, добаплнют определенное количество внутреннего стандарта (гексадека 1,12-дипла) в хлоро- форме-изопропаноле (3:1) и анализируют с помощью гаэожидкостной и тонкослойной хроматографии.

Результаты представлены в табл, 2.

Таблица 2

20

0,3в 42,22 Следы

Сумма алкалоидов

А2,60

30

35

40

В 50 мл среды, свободной от клеток, доводят до рН до 1,8-2, с помощью 97%-иой уксусной кислоты и перемеии- вают в течение 1,5 ч затем проводят нейтрализацию концентрированным ам миаком до рН 9-9,5 и исчерпьтающую экстракцию смесью хлороформ - метанол (4:1) и анализируют с помощью гаэожидкостной и тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в табл.3.

Таблица 3

Алкалоиды

Содержание алкалоидов, |U г/л

90

2450 290

Сумма алкалоидов

2830

Формула изобретения

Штамм культивируемьк клеток мака Papaver somniferum BCKK(RP) Я- 4 (Специализированная коллекция культивиру5I347A49в

емых клеток высших растений Института зева АН СССР), испольвуемый для полу- физиологии растений им. К.А. Тимиря- чения алкалоидов.

Изобретение относится к биотехнологии и может Выть использовано в медицинской промьгашенности для получения биологически-активных веществ. Целью изобретения является получение штамма культивируемых клеток мака Papaver somniferum продуцирующего алкалоиды. Штамм Papaver somniferinn PS 5 получен в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева и хранится в специализированной коллекш культивируемых клеток высших растений данного института под номером ВСКК (ВР) № 4. Биомасса штамма светло-кремового цвета состоит из клеток со средним диаметром T18,0±0,2(i . Штамм способен к росту на твердой (агаризован- ной) и в жидкой питательной среде. Суммарное содержание алкалоидов (в рд/г сухого вещества) при вьфащивании на агаризованной среде составляет 361, при этом в составе алкалоидов преобладает наркотин (194 ь/г сухого вещества). Суммарное содержание алкалоидов ()м/л питательной среды) при суспензионном культивировании штамма составляет 2830, на долю сангвинарина приходится 2450. 3 табл. О с