ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ RUBIA CORDIFOLIA L., ПРОДУЦЕНТ АНТРАХИНОНОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N5/04 A61K35/78 C12P19/00 C09B61/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ценных биологически активных веществ, в частности антрахинонов, которые являются эффективным средством для лечения почечнокаменной болезни и заболеваний печени. Поиск новых гепатопротекторных веществ и особенно лекарственных веществ, разрушающих и выводящих камни из почек, является актуальной задачей для медицины и фармацевтической промышленности.

Марена сердцелистная Rubia cordifolia L. (синоним: марена пурпурная Rubia purpuria DC.) - растение семейства мареновых (Rubiaceae), произрастает в странах Восточной Азии, Пакистане, на территории России - в Приморском крае. Экстракты из корней марены сердцелистной, содержащие антрахиноны, обладают способностью растворять и удалять камни из почек и мочевого пузыря (Gilani А. Н. , Janbaz К.Н., Zaman М., Lateef A., Suria A., Ahmed H.R. Possible presence of calcium channel blocker(s) in Rubia cordifolia: an indigenous medicinal plant. J. Pak. Med. As- soc. 1994. V. 44. P. 82-85). Известно, что антрахиноны обладают гепато- защитным действием (Gilani А.Н., Janbaz К.Н. Effect of Rubia cordifolia extract on acetaminophen and CCl₄-induced hepatotoxicity. Phytotherapy Res. 1995. V. 9. P. 372-375).

Известно, что антрахиноны синтезируются в культурах растительных клеток. Так, пурпурин, ализарин и люцидин вырабатывается культурой корней растения Rubia tinctorum (Sato К., Yamazaki Т., Okuyama Е., Yoshihira К., Shimomura К. Antraquinone production by transformed root culture of Rubia tinctorum: influence of phytohormones and sucrose concentration // Phytochemistry. 1991. V. 30. N 5. P. 1507-1509 (прототип). Известно, что из каллусной культуры растений Cinchona ledgeriana выделено до 15 различных антрахинонов (Wijnsma R., Verpoorte R., Mulder-Krieger Th., Svepdsen A. Antraquinones in callus cultures of Cinchona ledgeriana // Phytochemistry. 1984. V. 23, N 10, P. 1507-1509). Известно, что набор антрахинонов продуцирует культура клеток Morinda citrifolia (Leistner E. Biosynthesis of morindone and alizarin in intact and cell suspension cultures of Morinda citrifolia // Phytochemistry. 1973. V. 12. P. 1669-1674). Однако в силу того, что некоторые антрахиноны обладают мутагенным действием, создание культур, синтезирующих большой набор антрахинонов, нежелательно. Проблема создания клеточного штамма, продуцента антрахинонов, заключается в том, чтобы культура продуцировала определенный набор антрахинонов, не обладающих мутагенным действием.

Задача изобретения - получение нового источника антрахинонов, штамма культивируемых клеток растения Rubia cordifolia L., продуцента антрахинонов.

Штамм получен в Биолого-почвенном институте ДВО РАН и депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений при Институте физиологии растений РАН под номером ВСКК(ВР) 60. Наименование штамма - RC-1.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная штамма: стеблевые апексы дикорастущего растения марены сердцелистной, собранного в Анучинском районе Приморского края. Для получения и культивирования каллусов использовали питательную среду следующего состава, мг/л воды:
NH₄NO₃ - 350-450
KNO₃ - 1500-2300
K₂HPO₄ - 150-190
CaCl₂•6H₂O - 600-730
MgSO₄•7H₂O - 350-390
H₃BO₄ - 4,2-8,0
MnSO₄•4H₂O - 15,6-26,7
CuSO₄•5H₂O - 0,02-0,03
CoCl₂•2H₂O - 0,02-0,03
ZnSO₄•7H₂O - 6,0-10,3
Na₂MoO₄•2H₂O - 0,2-0,3
KJ - 0,52-0,90
FeSO₄•7H₂O - 25,0-30,6
Na₂EDTA•2H₂O - 33,6-41,0
Мезо-инозит - 80-120
Тиамина гидрохлорид - 0,15-0,25
Никотиновая кислота - 0,4-0,6
Пиридоксина гидрохлорид - 0,4-0,6
6-бензиламинопурин - 0,45-0,55
α- нафтилуксусная кислота - 1,5-2,5
Казеина гидролизат - 40-60
Сахароза - 24000-26000
Агар - 5800-6200
Вода - До 1 л
pH среды 5,6-5,8 до автоклавирования
Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: 20.

Штамм представляет собой каллусную ткань рыхлой консистенции желто-оранжевого цвета. Ростовой индекс и продуктивность по сырой и сухой биомассе представлена в таблице 1. Каллусы выращиваются в накопительном режиме на агаризованной питательной среде.

Стандартные условия культивирования: температура 25±1^oC, относительная влажность воздуха (70±10%), освещенность - отсутствует, сосуды для выращивания - колбы Эрленмейера объемом 100 мл, объем питательной среды 30 мл, либо культуральные сосуды объемом 200 мл, содержащие 60 мл питательной среды. Кратность рассева 1:10.

Цитологические характеристики. Ткань представляет собой популяцию, состоящую на 20-86% из клеток меристематического типа округлой, овальной, треугольной и неправильной формы, имеющих средние размеры 81 х 62 мкм и из клеток паренхимного типа (содержание 14-80%) округлой, овальной, вытянутой, подковообразной, треугольной, трапециевидной и неправильной формы, имеющих средние размеры 193 х 103 мкм. Максимум митотической активности наблюдается на 36 сутки культивирования. Митотический индекс составляет 8,8%.

Кариологическая характеристика
Распределение клеток по числу хромосом, % клеток в модальном классе (см. таблицу 1a)
Диплоидный набор хромосом - 38. Маркерных хромосом не отмечено.

Соотношение живых и мертвых клеток, %: живых 25-90, мертвых - 10-75.

Способность к морфогенезу: отсутствует.

Качественная и количественная характеристика биосинтеза вторичных продуктов. Штамм продуцирует пигменты антрахиноновой группы, пурпурин и муньистин. Пурпурин и муньистин не обладают мутагенным действием. Отмечено также присутствие в следовых количествах других пигментов.

Пример. 1 г каллусной ткани штамма RC-1 помещают в культуральные флаконы объемом 200 мл, содержащие 60 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:
NH₄NO₃ - 400
KNO₃ - 1900
K₂HPO₄ - 170
CaCl₂•6H₂O - 665
MgSO₄•7H₂O - 370
H₃BO₄ - 6,2
MnSO₄•4H₂O - 22,3
CuSO₄•5H₂O - 0,025
CoCl₂•2H₂O - 0,025
ZnSO₄•7H₂O - 8,6
Na₂MoO₄•2H₂O - 0,25
KJ - 0,83
FeSO₄•7H₂O - 27,8
Na₂EDTA•2H₂O - 37,3
Мезо-инозит - 100
Тиамина гидрохлорид - 0,2
Никотиновая кислота - 0,5
Пиридоксина гидрохлорид - 0,5
6-бензиламинопурин - 0,5
α- нафтилуксусная кислота - 2,0
Казеина гидролизат - 100
Сахароза - 25000
Агар - 6000
Вода дистиллированная - До 1 л
(pH среды 5,6 до автоклавирования). Ткань культивируют в течение 30 суток при температуре 25^oC, относительной влажности воздуха 70%, в темноте. Затем извлекают из сосудов, высушивают в токе нагретого до 60^oC воздуха и экстрагируют трехкратно кипящим метиловым спиртом. Метиловый спирт удаляют под вакуумом. Остаток красно-оранжевого цвета представляет собой неочищенную сумму антрахиноновых пигментов. Колоночной хроматографией на сефадексе LH-20 в системе хлороформ - метанол (10:1) получают фракции двух основных пигментов. После удаления под вакуумом растворителей антрахиноны кристаллизуют из соответствующих растворителей. Структуры полученных пигментов установлены на основании физико-химических свойств и спектральных данных:
Муньистин. C₁₅H₈O₆. Молекулярная масса 284,22.

Золотистые пластинки (хлороформ), температура плавления 231-233^oC.

УФ-спектр (этанол),λ (нм), (lgε): 248 (4,52), 289 (4,30), 424 (3,76).

ИК-спектр (KBr), ν (см^-1): 3190, 1698, 1675, 1631, 1587. Масс-спектр m/z, %: 284 M⁺ (11), 283 [M-1]⁺, (60), 267 (35), 266 (99), 241 (46), 240 (100), 238 (80), 212 (40), 184 (50). ПМР-спектр (CDCl₃): 7,47 (с., 1H, Н-4), 7,84 (м. , 2H, Н-6, Н-7), 8,33 (м., 2H, Н-5, H- 8), 11,44 (шир. с., ОН), 13,13 (с. , ОН), 16,52 (с. , ОН). ^13-ЯМР-спектр (DMSO-d₆): 107,1, 109,3, 113,6, 126,1, 126,4, 132,5, 133,1, 133,9, 134,3, 134,9 162,3, 163,1, 167,0, 181,4, 184,5.

Пурпурин. C₁₄H₈O₅. Молекулярная масса 256.21.

Красные кристаллы, т. пл. 262^oC.

УФ-спектр (этанол), λ (нм), (lgε): 203 (4,35), 257 (4,46), 296 (3,91) 459 (плечо), 485 (3,85), 521 (плечо). ИК-спектр (CH₂Cl₂), ν (см^-1): 1623, 1588. Масс-спектр m/z, %: 256 M⁺, (100), 228 (100), 186 (17). ПМР-спектр (CDCl₃): 6,83 (с. , 1H, H-3), 7,83 (м., 2H, Н-6, Н-7), 8,35 (м., 2H, Н-5, Н-8), 12,24 (с., ОН), 12,28 (с., ОН). ^13-ЯМР-спектр (DMSO-d₆): 104,9, 109,6, 112,1, 125,9,126,1, 132,2, 133,1, 133,6, 134,4, 149,2, 156,7, 160,2, 182,7, 186,1.

Количество пурпурина и муньистина, продуцируемое штаммом на протяжении года культивирования, представлено в таблице 2. Среднее содержание этих двух пигментов составило 0,89% от массы сухих клеток. Штамм характеризуется стабильным соотношением муньистина и пурпурина (таблица 2).

Таким образом, использование предложенного штамма марены сердцелистной RC-1 позволяет получить антрахиноновые пигменты биотехнологическим способом.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения ценных биологически активных веществ, антрахинонов, которые являются эффективным средством для лечения почечнокаменной болезни и заболеваний печени. Штамм культивируемых клеток растений Rubia cordifolia L. (марены сердцелистной) получен в Биолого-почвенном институте ДВО РАН и депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур высших растений при Институте физиологии растений РАН под индексом RС-I. Штамм RC-I получен из дикорастущего растения марены сердцелистной, собранного в Анучинском районе Приморского края. Штамм представляет собой каллусную ткань рыхлой консистенции желто-оранжевого цвета. Штамм выращивают в накопительном режиме на агаризованной питательной среде. Штамм RС-I является высокопродуктивным источником антрахиноновых пигментов-муньистина и пурпурина. Среднее содержание пигментов составляет 0,89% от массы сухих клеток. 3 табл.

Штамм культивируемых клеток растений Rubia cordifolia L., продуцент антрахинонов.