СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ БАКТЕРИЙ-ПРОДУЦЕНТОВ ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ, ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS CIRCULANS B-65 NCAIM (P) 001277 (B-65) - ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ЦИКЛОДЕКСТРИНТРАНСФЕРАЗЫ, ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗА, ПОЛУЧЕННАЯ ИЗ НЕГО, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИНА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12N9/10 C12P19/18 C08B37/16 C12N9/10 C12R1/09 

Область изобретения

Это изобретение касается биотехнологии, в частности способа получения циклодекстрина путем воздействия циклодекстринглюканотрансферазы (называемой также ЦГТ-аза) на крахмал и продукции ЦГТ-азы бактериями штамма Bacillus circulans B-65. По Международной классификации изобретение относится к следующим классам: С 08 В 37/16; С 12 Р 19/18; C 12 N 1/20; C 12 N 9/10.

Цели изобретения

Это изобретение решает проблему биосинтеза ЦГТ-азы, которая обычно используется для получения циклодекстрина, а также проблему получения циклодекстрина путем воздействия ЦГТ-азы на крахмал. Биосинтез ЦГТ-азы чаще всего осуществляют с помощью бактерий рода Bacillus, которые обычно продуцируют ЦГТ-азу, воздействующую на крахмал с образованием смеси α-, β- и γ-циклодекстринов в различном соотношении, в то же время выход отдельного циклодекстрина не высок, и его выделение увеличивает стоимость продукции.

Биосинтез ЦГТ-азы согласно изобретению осуществляется алкалифильными бактериями нового штамма Bacillus circulans B-65, характеризующегося продукцией большого количества ЦГТ-азы, которая обычно используется для получения циклодекстрина. Циклодекстрины получают с помощью ЦГТ-азы из бактерий В. circulans, которая характеризуется высокой степенью превращения крахмала в циклодекстрины, и специфична для образования β-циклодекстрина.

Уровень техники

Циклодекстрины получают путем воздействия ЦТГ-азы на крахмал. В процессе получения циклодекстринов наиболее важной стадией является получение ЦТГ-азы. ЦТГ-аза продуцируется некоторыми видами бактерий, среди которых чаще всего встречаются бактерии, относящиеся к роду Bacillus: В. macerans, В. circulans, В. megaterium, В. coagulans, B.lentus, В. ohbensis, В. firmus, В. amyloliquefaciens, В. stearothermophilus, В. subtilis, B.cerus. ЦТГ-аза продуцируется и некоторыми другими бактериями, не принадлежащими к роду Bacillus, например: Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Micrococcus varians. Чаще всего в качестве продуцентов ЦГТ-азы выступают бактерии Bacillus macerans и алкалифильные бактерии, относящиеся к роду Bacillus.

ЦГТ-аза продуцируется растущими бактериями в жидкой среде в аэробных условиях в ферментаторе. Этот процесс является весьма дорогостоящим, и бактерии продуцируют определенное количество ЦГТ-азы. Дорогостоящий процесс получения ЦГТ-азы существенно влияет на высокую стоимость конечного продукта, т.е. циклодекстрина, что ограничивает его широкое применение во многих отраслях промышленности.

Поскольку циклодекстрины имеют широкое применение в промышленности и их стоимость является одним из существенных факторов, ограничивающих их применение, ученые всех стран ищут пути увеличения экономичности способа получения ЦГТ-азы. Для этой цели проводят оптимизацию состава питательной среды и оптимизацию физико-химических факторов для роста бактерий, ведутся работы по увеличению продуктивности бактерий с использованием различных генетических методов (индуцированного мутагенеза, генной инженерии), также ведутся работы по выделению новых микроорганизмов, которые характеризуются высокой продукцией ЦГТ-азы.

В способе получения циклодекстрина также очень важны свойства ЦГТ-азы, продуцируемой бактериями. Свойства ЦГТ-аз, продуцируемых различными видами бактерий, относящимися к роду Bacillus, представлены в Таблице 1.

Таблица 1: Свойства ЦГТ-аз из различных микроорганизмовПродуцент ЦГТ-азыСоотношение α-, β- и γ-ЦДОптим. рНрН устой-чивостьОптим. темп-pa (°С)Термостабильность (°С)без Са²⁺с Са²⁺Bacillus coagulans (термофил)2:2,6:16,56,0-9,0655060Алкалифильный Bacillus sp. (АТСС21783)71% β-ЦД6,5 и 8,5-65  Bacillus macerans (IF03490)71% α-ЦД5,5-55--Bacillus lentus (алкалифиль-ный)1:67:1,66,5-7,56,5-8,545-55--Bacillus sp. (алкалифиль-ный)в основном β-ЦД6,06,0-11,05560-Bacillus sp. (термофил)-6,55,0-105055-Bacillus stearothermophilus-5,0-5,55,0-8,070-756570Bacillus macerans (IAM 1243)-6,05,5-9,56050-Bacillus macerans-5,4-5,8-6050-Продуцент ЦГТ-азыСоотношение α-, β- и γ-ЦДОптим. рНрН устойчивостьОптим. темп-pa (°С)Термостабильность (°С)без Са²⁺с Са²⁴Bacillus macerans (IFO 3490)2,7:1:15,0-5,78,0-105560-Bacillus egaterium1:2,4:15,0-5,77,0-105555-Bacillus circulans3:3:15,56,0 9,0604560Bacillus amyloliquefaciens95% α-ЦД6,0-706065Bacillus sp.1,6:4:15,56,0-9,565-7065-Bacillus ohbensisв основном β-ЦД5,56,5-9,56055-Bacillus macerans (IAM 1227)в основном α-ЦД5,56,5 8,55050-Bacillus circulans (IF03329)β->α-ЦД6,06,0-9,55555-Bacillus coagulans (термофил)1:0,9:0,3-----Bacillus cereus (NCIMB 13123)22:23:05,0-40--Bacillus firmus (алкалифил)0,08:1:0,2-----Акалифильный Bacillus subtilis0:25,1:4,7--50--Акалифильный Bacillus sp.5,7:23,5:
4,7--40--

Из представленных данных можно видеть, что ЦГТ-азы из различных микроорганизмов демонстрируют похожие свойства, но есть и определенные различия. Наибольшие различия среди ЦГТ-аз касаются количеств образующихся специфических α-, β- или γ-циклодекстринов, ЦГТ-азы образуют в основном смесь α; β- и γ-циклодекстринов в различном соотношении. Однако существуют ЦГТ-азы, которые не образуют α- или γ-циклодекстрины. Большинство ЦГТ-аз образуют смесь циклодекстринов, в которой преобладает β-циклодекстрин, тогда как γ-циклодекстрин присутствует в минимальном количестве. Алкалифильные микроорганизмы продуцируют ЦГТ-азы, которые дают наибольшее содержание β-циклодекстрина, по сравнению с α- и γ-циклодекстринами. ЦГТ-азы из алкалифильных микроорганизмов образуют β-циклодекстрин, который составляет более 70% от общего количества циклодекстринов. Из данных, представленных в Таблице 1, мы можем сделать вывод, что ЦГТ-азы, продуцируемые штаммами, относящимися к видам Bacillus macerans, дают наибольший выход α-циклодекстрина, по сравнению с другими циклодекстринами. Кроме В. macerans, ЦГТ-аза, продуцируемая В. amyloliquefaciens AL 35, также образует α-циклодекстрин с выходом до 95%. В отличие от большинства ЦГТ-аз из различных продуцентов, ЦГТ-аза, продуцируемая Bacillus subtilis №313, образует γ-циклодекстрин, но не образует ни α-, ни β-циклодекстрины. ЦГТ-аза из Bacillus sp. AL-6 также дает наибольший выход γ-циклодекстрина и β-циклодекстрина, но не образует α-циклодекстрин.

В способе получения циклодекстринов с использованием ЦГТ-аз, которые в конце реакции дают смесь циклодекстринов, α-, β- и γ-циклодекстрины образуются в различном соотношении, и наибольший выход одного какого-либо циклодекстрина приводит к наименьшему выходу других циклодекстринов. После завершения ферментативной реакции с образованием циклодекстринов, осуществляют их выделение и очистку. Поскольку выделение и очистка циклодекстринов увеличивают стоимость способа их получения, желательно выделить микроорганизмы, которые продуцируют ЦГТ-азы, специфичные для образования одного из циклодекстринов.

Из патента US 4477568 известна ЦГТ-аза, полученная путем культивировния бактерий Bacillus circulans RIV №11115, которая используется для получения циклодекстринов. С помощью этой ЦГТ-азы можно получить до 66% β-циклодекстринов. Эта ЦГТ-аза активна при температуре 60°С, но ее активность существенно снижается при 65°С, в диапазоне рН от 4 до 7 (рН оптимум - 6-6.5). Существует необходимость в получении фермента, который будет продуцировать более 66% β-циклодекстринов и будет активен в более широком диапазоне температур, а также и при более высоких рН, что существенно уменьшит опасность инфекций.

Краткое изложение изобретения

Биосинтез ЦГТ-азы, которая затем используется для получения циклодекстрина, осуществляется алкалифильными бактериями штамма Bacillus circulans B-65. Биосинтез осуществляется растущими бактериями в щелочной (рН 10) жидкой среде, в аэробных условиях, в ферментаторе. Эта питательная среда содержит: в качестве источника углерода - от 0,5 до 3% крахмала, в качестве источника азота - от 0,5 до 6% вещества, выбранного из группы, состоящей из пептона, дрожжевого экстракта, дрожжевого автолизата, кукурузного автогидролизата (corn step liquid) или их смеси, в качестве источника минералов: К₂НРO₄, MgSO₄ × 7H₂O, Na₂CO₃.

После завершения биосинтеза бактериальные клетки удаляют путем центрифугирования или фильтрации, и затем внеклеточно продуцируемые ЦГТ-азы концентрируют с помощью ультрафильтрации.

При воздействии полученной таким образом ЦГТ-азы на крахмал, концентрация которого варьирует от 5% до 15%, получают циклодекстрины. Ферментативную реакцию осуществляют в течение 24 часов в щелочной среде (рН 8,0) при температуре 60°С.

Новизна этого изобретения заключается в том, что биосинтез ЦГТ-азы, которая используется для получения циклодекстрина, осуществляют с использованием алкалифильных бактерий В. circulars B-65. Эти бактерии были выделены из почвы, взятой на территории г. Лесковац. Бактерии В. circulans были выделены из приблизительно 2000 бактериальных колоний, которые характеризовались продукцией ЦГТ-азы. Изолят, который затем был идентифицирован и обозначен как В. circulans В-65, продемонстрировал существенно большую активность в продуцировании ЦГТ-азы, и это свойство явно отличает его от других изолятов. Таким образом, алкалифильные бактерии В. circulans B-65 представляют собой новый штамм, отличающийся тем, что он продуцирует значительное количество ЦГТ-азы, которая может использоваться для получения циклодекстринов. Штамм Bacillus circulans B-65 депонирован в Национальной коллекции сельскохозяйственных и промышленных микроорганизмов (National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, NCAIM) в Будапеште под номером NCAIM (Р) 001277.

Преимущество использования ЦГТ-азы, которая продуцируется данным алкалифильным штаммом В. circulans B-65, заключается в его использовании для получения β-циклодекстрина. ЦГТ-аза этого штамма специфична для образования β-циклодекстрина и характеризуется высокой степенью превращения крахмала в β-циклодекстрин. В описанных условиях реакции при концентрации крахмала 5%, ЦГТ-аза осуществляет превращение до 45% крахмала в циклодекстрины. Из общего количества продуцируемых циклодекстринов количество β-циклодекстрина составляет около 95%, что является наиболее высоким значением, по сравнению с имеющимися литературными данными. В отличие от ЦГТ-азы, известной из патента US 4477568, ЦГТ-аза согласно изобретению активна при более высоких температурах (вплоть до 75°С), в более широком диапазоне рН (от 4 до 12).

Отличие способа выделения и селекция бактерий-продуцентов ЦГТ-азы согласно изобретению от известного из патента US 4477568 также заключается в том, что в состав среды для культивирования бактерий в качестве основания входит фенолфталеин или метилоранж и не используется FeСl₃ × 6Н₂О.

Выделение и селекция бактерий-продуцентов ЦГТ-азы

ЦГТ-азы, продуцируемые бактериями, были выделены из 54 различных образцов почвы, которые были взяты на территории г. Лесковац. Суспензию почвы (0,5-1,0 г) в 10 мл стерильной дистиллированной воды нагревали в течение 10 минут при 80°С. После нагревания 0,1 мл почвенной суспензии наносили на агаровые чашки со средой Парка, содержащей: 1% растворимого крахмала, 0,5% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% К₂НРО₄, 0,02% MgSO₄ · 7H₂O, 1% Na₂CO₃, 0,03% фенолфталеина, 0,01% гелиантина, 1,5% агара, рН 10,0 (Park et al., 1989). Инкубацию осуществляли при 37°С. Через 48 часов инкубации, колонии, окруженные наиболее широкими желтыми зонами на окрашенных в красный цвет агаровых чашках, выделяли и очищали.

Число колоний, полученных из различных образцов почвы, варьировало в диапазоне от 0 до 200. Колонии, которые продуцировали ЦГТ-азу, были окружены желтыми зонами различной величины. Различные образцы почвы имели различный процент колоний, продуцирующих ЦГТ-азу, который варьировал от 0 до 90% от общего числа колоний. Принимая во внимание размер зоны вокруг колоний, выделили и очистили 85 колоний из 2000 колоний, продуцирующих ЦГТ-азы. После очистки на среде Парка были отобраны 45 колоний для дальнейшей работы. Отобранные колонии переносили на скошенный агар со средой Хорикоши (Horikoshi) II и после инкубации хранили при +4°С.

45 отобранных алкалифильных изолятов, продуцирующих ЦГТ-азу, выращивали в жидкой среде во флаконах Эрленмейера при перемешивании для последующей селекции изолятов. Инкубацию осуществляли при 37°С в течение 48 часов при постоянном перемешивании 200 об/мин. На третий и четвертый день отбирали образцы, и после удаления бактериальных клеток путем центрифугирования (10000 × g, 10 мин, +4°С) определяли амилолитическую и циклодекстриногенную активности супернатанта.

Амилолитическая активность изолятов варьировала в диапазоне от 0,4 U/мл до 12,17 U/мл. Наибольшее количество изолятов продемонстрировало амилолитическую активность от 1 U/мл до 2 U/мл. Количество изолятов, которые показали более высокую амилолитическую активность, постепенно уменьшалось, так что амилолитическую активность выше 5 U/мл продемонстрировали только 3 изолята. Циклодекстриногенная активность варьировала в диапазоне от 0,019 U/мл до 0,530 U/мл. Циклодекстриногенная активность большинства изолятов составляла до 0,100 U/мл. Циклодекстриногенная активность выше 0,200 U/мл была продемонстрирована единственным изолятом. Изолят В-65 показал амилолитическую активность 12,17 U/мл и циклодекстриногенную активность 0,530 U/мл, которые были существенно выше, по сравнению с другими изолятами.

Морфологические и таксономические характеристики бактериального штамма

С целью идентификации были исследованы морфологические и физиолого-биохимические характеристики бактериального штамма. Результаты исследования были проанализированы с помощью “Bergey’s Manual Systematic Bacteriology” (Систематического справочника по бактериологии под редакцией Bergey, Sneath, 1968). В качестве контрольного штамма использовали Bacillus circulans (ATCC 4513).

Результаты этих исследований показали, что бактерии нового штамма представляют собой палочки, имеющие размер 0,6-0,7 × 2-4 мкм, являются подвижными, грамположительными, образуют эндоспоры эллиптической формы, растут в аэробных и анаэробных условиях и продуцируют каталазу. Эти характеристики показывают, что данный бактериальный штамм принадлежит к роду Bacillus. Результаты этих исследований показывают, что бактериальный штамм: демонстрирует отрицательную реакцию по Voges-Proskauer; продуцирует кислоты из глюкозы, арабинозы, ксилозы и маннита; не продуцирует газ из глюкозы; гидролизует желатин и крахмал; не использует (не метаболизирует) цитраты; не продуцирует индол; не растет в среде с рН 6,8 и 5,7 и демонстрирует хороший рост в среде с 2, 5, 7 и 10% NaCl.

Морфологические и физиолого-химические характеристики изолята В-65 в основном совпадают с характеристиками Bacillus circulans. Однако существенной особенностью изолята В-65 является то, что он демонстрирует хороший рост в щелочной среде (рН 10) и не растет в нейтральной среде, такой как питательная среда с рН 6,8, что отличает его от описанных штаммов Bacillus circulans. Изолят В-65 также отличается от штаммов Bacillus circulans тем, что растет в среде с 10% NaCl.

На основании указанных характеристик изолят В-65 был идентифицирован как штамм Bacillus circulans. Поскольку его особенностью является хороший рост в щелочной среде (рН 10) и отсутствие роста в нейтральной среде, изолят В-65 обозначили как алкалифильный штамм Bacillus circulans В-65. Характристики изолята В-65 представлены в Таблице 2.

Таблица 2: Характеристики бактерий Bacillus circulans (ATCC 4513) и изолята В-65Морфологические и физиолого-биохимические характеристикиBacillus circulans
(ATCC 4513)Изолят В-65ФормаПалочкиПалочкиРазмер (мкм)0,5-0,7×2-50,6-0,7×2-4Подвижность++Форма спорэллиптическаяэллиптическаяОкрашивание по Граму++Каталаза++Анаэробный рост++Анализ по Voges-Proskauer--Продукция кислот из углеводов:
D-глюкоза
L-арабиноза
D-ксилоза
D-маннит+
+
+
++
+
+
+Продукция газа из глюкозы--Гидролиз: желатина
крахмала+
++
+Использование цитратов--Продукция индола--Рост при рН: 6,8 (питательная среда)
5,7+
+-
-Рост в присутствии NaCl: 2%
5%
7%
10%+
+
+
-+
+
+
+Рост при: 30°С
37°С
40°С+
+
++
+
+

Биосинтез ЦГТ-азы штаммом В, circularis B-65

Биосинтез ЦГТ-азы осуществляется бактериями штамма В. circulans B-65, растущими в щелочной (рН 10) жидкой среде. Питательная среда включает: 1% растворимого крахмала, 0,5% пептона-1, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% К₂НРО₄, 0,02% MgSО₄ × 7H₂O, 1% Na₂CO₃.

Инокулят для способа получения ЦГТ-азы приготавливали путем инокуляции культуры, взятой из скошенного агара, в жидкую среду. Инкубацию проводили при 37°С при постоянном перемешивании (200 об/мин) в течение 48 часов. В ферментатор со свежей средой вносили 5% инокулята. Биосинтез ЦГТ-азы осуществляли в течение 96 часов при 37°С в потоке стерильного воздуха при 0,5 vvm (volume of air per volume of medium min^-1, объем воздуха на объем среды в минуту) при скорости вращения мешалки 300^-1. Через 96 часов роста бактериальные клетки удаляли путем центрифугирования (10000 × g, 10 мин, +4°С) или путем фильтрации, и затем осуществляли концентрированно внеклеточно продуцируемой ЦГТ-азы путем ультрафильтрации. Полученную таким образом ЦГТ-азу использовали затем для получения циклодекстрина. В процессе получения определяли амилолитическую и циклодекстриногенную активности ЦГТ-азы, внеклеточно продуцируемой штаммом В. circulans B-65. Клеточный рост и активность ЦГТ-азы, продуцируемой штаммом В. circulans B-65, растущим в описанных условиях, охарактеризованы в Таблице 3.

Таблица 3Активность ЦГТ-азы, клеточный рост и изменения рН в процессе роста штамма В. circulans B-65Время (ч)Активность Амилолитическая активностьЦГТ-азы (U/мл) Циклодекстриногенная активностьКлеточный рост (610 нм)0//0,125247,300,201,677489,700,241,4897214,850,381,497

ЦГТ-аза продуцируется в процессе клеточного роста. До завершения фазы роста величина циклодекстриногенной активности достигает 0,20 U/мл, что составляет чуть более 30%, по сравнению с активностью, полученной после 96-часового периода роста. После завершения фазы роста продукция ЦГТ-азы продолжается, так что через 96 часов роста циклодекстриногенная активность достигает величины 0,60 U/мл, а амилолитическая активность 23,37 U/мл. Увеличение циклодекстриногенной и амилолитической активностей после завершения фазы роста составляет около 70% от общей величины. Таким образом, изолят B-65 продуцирует больше ЦГТ-азы после завершения фазы клеточного роста.

В процессе роста В. circulans B-65 амилолитическая и циклодекстриногенная активности увеличиваются пропорционально, что приводит к выводу, что штамм В. circulans B-65 продуцирует ЦГТ-азу и не продуцирует какие-либо другие амилолитические ферменты.

Этот вывод подтверждается определением содержания циклодекстринов и восстанавливающих сахаров во время инкубации ЦГТ-азы из В, circulans B-65 с крахмалом. Эти результаты показали, что в ходе реакции наблюдалось образование циклодекстринов, в то время как количество восстанавливающих сахаров не увеличивалось, что имело бы место в присутствии других амилолитических ферментов.

Преимущество данного способа получения ЦГТ-азы, которое подтверждается данными результатами, состоит в том, что биосинтез ЦГТ-азы осуществляется новым алкалифильным штаммом В. circulans B-65, который характеризуется внеклеточной продукцией большого количества ЦГТ-азы. Другой, также важной характеристикой штамма В. circulans B-65 является то, что кроме ЦГТ-азы этот штамм не продуцирует другие амилолитические ферменты. Присутствие этих ферментов в препаратах ЦГТ-азы в процессе получения циклодекстринов привело бы к гидролизу крахмала, то есть к уменьшению концентрации субстрата для получения циклодекстринов, что оказало бы негативное влияние на конечный выход продукта.

Преимущество биосинтеза ЦГТ-азы штаммом В. circulans B-65, по сравнению с другими продуцентами этого фермента состоит в том, что биосинтез ЦГТ-азы штаммом В. circulans B-65 осуществляется в очень щелочной среде (рН 10), при этом снижается риск инфекции другими микроорганизмами, что чрезвычайно важно для производства в промышленных условиях.

Свойства ЦГТ-азы из В. circulans B-65

Кроме того, что штамм В. circulans B-65 продуцирует ЦГТ-азу в большом количестве, очень важно, что эта ЦГТ-аза характеризуется хорошими свойствами, касающимися термостабильности и оптимальной для ее активности температуры, а также рН-устойчивости и оптимальных значений рН.

ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 характеризуется тем, что она стабильна при температурах до 55°С, и в присутствии Са²⁺ ее стабильность увеличивается до 60°С. Оптимальная температура для ее действия составляет 60°С. Благодаря высокой оптимальной температуре действия и высокой термостабильности ЦГТ-азы из штамма В. circulans B-65 способ получения циклодекстринов осуществляют при температуре 60°С. Преимущество получения циклодекстринов при высокой температуре состоит в том, что при этих условиях реакции уменьшается риск инфекции другими микроорганизмами. При высоких температурах также выше скорость ферментативной реакции, что уменьшает длительность процесса получения циклодекстринов.

ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 характеризуется тем, что оптимальное для ее активности значение рН находится в пределах рН от 5,0 до 6,0, однако ЦГТ-аза сохраняет свою активность в довольно широком диапазоне значений рН в щелочной среде. ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 стабильна при рН от 6,5 до 10,0. Благодаря этим свойствам ЦГТ-азы получение циклодекстринов может осуществляться в широком диапазоне значений рН. Константа Михаэлиса для ЦГТ-азы из штамма B.circulans B-65 составляет от 3,016 мг/мл (рассчитанная методом Lineweaver-Burck) до 4.77 мг/мл (рассчитанная методом Idi-Hofsti). Ингибиторами этого фермента являются NaN₃, CuSO₄, MnSO₄, FeSO₄, MgSO₄ и глюкоза.

Результаты изучения свойств ЦГТ-азы из штамма В. circulans B-65 представлены ниже.

Влияние рН на активность ЦГТ-азы

Влияние рН на активность ЦГТ-азы исследовали в диапазоне рН от 4,0 до 10,0 при температуре 40°С. Для подведения рН использовали следующие буферы: 50 Мм ацетатный буфер (рН 4-5), 50 мМ фосфатный буфер (рН 5-8), 50 мМ карбонатный буфер (рН 8-10). Результаты этих исследований, представленные в Таблице 4, показывают, что оптимальное значение рН для активности ЦГТ-азы находится в пределах рН от 5,0 до 6,0, однако ЦГТ-аза сохраняет свою активность в довольно широком диапазоне значений рН в щелочной среде.

Таблица 4Циклодекстриногенная активность ЦГТ-азы при различных значениях рН.РН50 мМ буферЦиклодекстриногенная активность (U/мл)Относительная активность (%)¹4Ацетатный0,1819,84,50,7480,45Фосфатный0,921005,50,9198,960.8996,76,50,7682,670,6671,780,5660,39Карбонатный0,4245,2100,2628,6^28,6Относительная активность выражается как процент от максимальной активности, полученной при рН 5,0.

Влияние рН на стабильность ЦГТ-азы

Влияние рН на стабильность ЦГТ-азы исследовали в диапазоне рН от 4,0 до 12,0. Для подведения рН использовали следующие буферы: 50 мМ ацетатный буфер (рН 4-5), 50 мМ фосфатный буфер (рН 6-7), 50 мМ трис-HCl буфер (рН 8-10) и 50 мМ глицин-NaOH буфер (рН 11-12). ЦГТ-азу инкубировали при различных значениях рН в течение 1 часа при 40°С, и затем рН подводили до 6,0 и определяли остаточную ферментативную активность. Результаты этих исследований представлены в Таблице 5, показывающей, что ЦГТ-аза была стабильна в широком диапазоне рН-значений от 6,5 до 10,0.

Таблица 5Остаточная ЦГТ-азная активность после инкубации при различных значениях рНрН50 мМ буферЦиклодекстриногенная активность (U/мл)Относительная активность (%)4Ацетатный0,1819,850,7480,46Фосфатный0,921006,50,9198,970,8996,78Трис-HCl0,7682,690,6671,7100,5660,311Глицин-NaOH0,4245,212 0,2628,6

Влияние температуры на активность ЦГТ-азы

Влияние температура на активность ЦГТ-азы в диапазоне температур от 30°С до 75°С при рН 6,0. Результаты этих исследований показали, что оптимальная температура для ЦГТ-азной активности составляла 60°С (Таблица 6).

Таблица 6: Активность ЦГТ-азы при различных температурахТемпература (°С)Относительная активность (%)3023,14036,24549,85071,75585601006594,77045,37515,9

Влияние температуры на стабильность ЦГТ-азы

Влияние температуры на стабильность ЦГТ-азы исследовали в диапазоне температур от 30°С до 80°С. Исследование термостабильности ЦГТ-азы проводили в отсутствие и в присутствии ионов Са²⁺ в концентрации 10 мМ. ЦГТ-азу инкубировали в течение 30 минут при различных температурах при рН 8,5, и затем рН подводили до 6,0 и исследовали остаточную ферментативную активность.

Результаты исследования (Таблица 7) показали, что ЦГТ-аза была стабильна в диапазоне температур до 55°С и что в присутствии ионов Са²⁺ ее стабильность увеличивалась до температуры 60°С.

Таблица 7Остаточная ЦГТ-азная активность после инкубации при различных температурахТемпература
(°С)Остаточная активность (%) без Са²⁺Остаточная активность (%) с Са²⁺309797,34098,396,8509696,8559698,26052,896,86517,281,770319,075-080-0

Получение ииклодекстринов

Циклодекстрины получают, воздействуя ЦГТ-азой из штамма В. circulans B-65 на крахмал в концентрации от 5% до 15%. Благодаря высокой оптимальной температуре действия фермента и высокой термостабильности ЦГТ-азы из штамма В. circulans B-65, процесс получения циклодекстринов можно осуществлять при температуре до 60°С. Что касается значений рН, получение циклодекстринов можно проводить в широком диапазоне значений рН от 6,5 до 10,0.

Выход циклодекстринов в процессе инкубации 5%-ного раствора крахмала с различными концентрациями ЦГТ-азы при 40°С и рН 6,5 представлен в Таблице 8.

Таблица 8Выход циклодекстринов при различных концентрациях ЦГТ-азы¹Концентрация ферментов (U/г крахмала)Время инкубации
(ч)ЦД
(г/л)Выход ЦД²
(%)Циклодекстриногенная активностьАмилолитическая активность0,623,42410,821,61,246,82411,222,31,870,22411,723,32,493,62412,124,23,011724
4814,8
19,229,5
38,44,517524
4817,8
19,735,6
39,46,023424
4821,7
22,543,3
44,97,529324
4821,1
20,342,2
40,6^40,6Реакционную смесь, которая содержала 5% крахмала и соответствующую концентрацию фермента, инкубировали в течение 48 часов при 40°С.
 ²Выход ЦД представляет степень превращения крахмала в ЦД.

Наилучшие результаты были получены для ЦГТ-азы в концентрации 6,0 U (циклодекстриногенная активность)/г крахмала. При такой концентрации ЦГТ-азы примерно 45% крахмала превращалось в циклодекстрины.

После завершения ферментативной реакции получения циклодекстринов их можно удалить из реакционной смеси путем преципитации, используя, например трихлорэтилен или толуол. Из осажденных циклодекстринов β-циклодекстрин можно удалить кристаллизацией, благодаря тому факту, что он значительно менее растворим, по сравнению с другими циклодекстринами. Циклодекстрины, полученные путем преципитации, растворяли в дистиллированной воде при нагревании при 100°С, и затем кристаллизовали β-циклодекстрин при постепенном понижении температуры до 20-25°С при осторожном перемешивании. Кристаллы β-циклодекстрина затем удаляли фильтрацией, промывали небольшим количеством холодной воды и высушивали при 70°С.

При анализе полученных циклодекстринов спектрофотометрическими методами и ВЭЖХ было установлено, что ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65, в описанных условиях, превращает до 45% крахмала в циклодекстрины и в основном образует β-циклодекстрин. В полученных циклодекстринах количество β-циклодекстрина составляет приблизительно 95%, в то время как количество α-циклодекстрина и γ-циклодекстрин составляет 2-3% и 0,6-3% соответственно.

ЦГТ-аза из штамма В. circulans B-65 характеризуется тем, что она специфична для образования р-циклодекстрина и превращает высокий процент крахмала в β-циклодекстрин. Следовательно, использование ЦГТ-азы из нового штамма имеет значительные преимущества для получения β-циклодекстрина, по сравнению с ЦГТ-азами из других известных бактерий.

Следующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают данное изобретение.

Пример 1

Продукция ЦГТ-азы

ЦГТ-аза продуцируется растущими бактериями штамма В. circulans B-65 в жидкой среде, содержащей: 1% растворимого крахмала, 0,5% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% К₂НРО₄, 0,02% MgSО₄ × 7H₂O, 1% Nа₂СО₃. Инокулят для способа получения ЦГТ-азы получали путем инокуляции в 450 мл жидкой среды Хорикоши (Horikoshi) II культуры из скошенного агара. Инкубацию проводили в течение 48 часов при 37°С при постоянном перемешивании (200 об/мин).

В ферментатор, содержащий 9 л среды Хорикоши, вносили 450 мл инокулята. Рост осуществляли в течение 96 часов при 37°С в потоке стерильного воздуха при 0,5 vvm и скорости вращения мешалки 300 мин^-1. В процессе роста отбирали образцы и определяли амилолитическую и циклодекстриногенную активности супернатанта. Через 96 часов роста бактериальные клетки удаляли путем центрифугирования (10000 × g, 10 мин, +4°С), и затем внеклеточно продуцируемые ЦГТ-азы концентрировали путем ультрафильтрации.

Штамм В. circulans B-65, растущий таким образом, через 96 часов продуцировал внеклеточно ЦГТ-азу с амилолитической активностью 23,4 U/мл и циклодекстриногенной активностью 0,6 U/мл. После концентрирования фермента путем ультрафильтрации получали амилолитическую активность 450 U/мл и циклодекстриногенную активность 12 U/мл.

Пример 2

Получение ииклодекстринов

Растворимый крахмал (300 г) разводили в 6 л воды при нагревании. Температуру доводили до 40°С и рН до 6,5. В раствор крахмала добавляли ЦГТ-азу в концентрации 6U (циклодекстриногенная активность) на г крахмала. Инкубацию осуществляли в течение 30 часов при 40°С.

Через 30 часов инкубации реакцию останавливали путем нагревания реакционной смеси в течение 10 минут при 100°С. Реакционную смесь затем обесцвечивали активированным углем. После удаления с помощью фильтрации активированного угля циклодекстрины осаждали из реакционной смеси (6 л) трихлорэтиленом (1,2 л). Осажденные циклодекстрины затем удаляли фильтрацией и высушивали при 70°С. Конечный выход составлял 107 г циклодекстринов из 300 г крахмала.

Полученные циклодекстрины растворяли в 500 мл дистиллированной воды при нагревании при 100°С. Затем при постепенном понижении температуры до 20-25°С и при осторожном перемешивании осуществляли кристаллизацию β-циклодекстрина. После выдерживания в течение ночи при +4°С кристаллы удаляли фильтрацией, промывали небольшим количеством холодной дистиллированной воды и высушивали при 70°С. Таким образом получали 75,2 г β-циклодекстрина в виде белых кристаллов.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в пищевой промышленности для получения циклодекстринов и циклодекстринглюканотрансферазы (ЦГТ-азы), применяемых в различных отраслях промышленности. Штамм Bacillus circulans В-65 – продуцент ЦГТ-азы выделен и отобран из образца почвы культивированием на питательной среде, с достигаемой по амилолитической активностью 12,17 V/мл и циклодекстриногенной активностью до 0,530 V/мл. ЦГТ-аза, выделенная из B circulans В-65, отличается высокой степенью превращения крахмала в циклодекстрины и специфична для образования β-циклодекстрина. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 табл.

1. Способ выделения и селекции бактерий-продуцентов циклодекстринглюканотрансферазы, отличающийся тем, что бактерии выделяют из образца почвы, приготавливают водную суспензию путем нагревания до 80°С в течение 10-15 мин и инокулируют в агаровые чашки со средой, содержащей крахмал, пептон, дрожжевой экстракт, K₂HPO₄, MgSO₄, Na₂CO₃, фенолфталеин, гелиантин и агар, затем инкубируют от 20 до 72 ч при 37°С, осуществляют селекцию колоний, отобранные колонии культивируют в жидкой среде до тех пор, пока происходит продукция ферментов, и осуществляют отбор изолята Bacillus circulans В-65.2. Штамм бактерий Bacillus circulans В-65 NCAIM (Р) 001277 (В-65) – продуцент внеклеточной циклодекстринглюканотрансферазы.3. Способ получения циклодекстринглюканотрансферазы, отличающийся тем, что алкалифильные бактерии штамма Bacillus circulans В-65 культивируют в аэробных условиях в жидкой среде в течение 24-120 ч при температуре от 25 до 50°С, после культивирования бактериальные клетки удаляют путем центрифугирования и фильтрации, и концентрирование внеклеточно продуцируемой ЦГТ-азы осуществляют путем ультрафильтрации.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что питательная среда содержит

- 0,5-3% крахмала в качестве источника углерода,

- 0,5-6% вещества, выбранного в качестве источника азота из группы, состоящей из пептона, дрожжевого экстракта, дрожжевого автолизата, кукурузного автогидролизата или их смеси,

- источники минералов: К₂НРО₄, MgSO₄ × 7Н₂О, Nа₂СО₃.